Адрес документа: http://law.rufox.ru/view/9/14131.htm


МУ 4.2.2008-05

     
     
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ.
ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ

Метод идентификации генно-инженерно-модифицированных организмов (ГМО)
растительного происхождения с применением ферментного анализа
на биологическом микрочипе

     
     
Дата введения: с момента утверждения

     
     
     1. РАЗРАБОТАНЫ ГУ НИИ питания РАМН (В.А.Тутельян - руководитель, Е.Ю.Сорокина, О.Н.Чернышева, Н.А.Кашина); ФГУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора (Т.В.Воронцова, Т.Н.Потапова); Инновационной корпорацией "Биозащита" (И.В.Панкин).
     
     2. РЕКОМЕНДОВАНЫ к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
     
     3. УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Г.Г.Онищенко 17 октября 2005 года.
     
     4. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ
     
     

1. Область применения

     
     1.1. Настоящие методические указания подготовлены для идентификации генно-инженерно-модифицированных организмов (далее - ГМО) растительного происхождения в пищевых продуктах с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе и его последующей обработки на аппаратно-программном комплексе "ДЕГМИГЕН-001".
     
     1.2. Методические указания разработаны в соответствии с постановлением Правительства Российской Федерации от 30.06.2004 N 322 "Об утверждении Положения о Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека", постановлением Правительства Российской Федерации от 15.09.2005 N 569 "О Положении об осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора в Российской Федерации", постановлением Правительства Российской Федерации от 24.07.2000 N 554 (в редакции от 15.09.2005 N 569) "Об утверждении Положения о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании".
     
     1.3. Методические указания предназначены для органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также других испытательных лабораторий, аккредитованных в порядке, установленном Правительством Российской Федерации.
     
     1.4. Методические указания разработаны для одновременного определения в одном лабораторном испытании пяти различных маркеров рекомбинантной ДНК при проведении скрининга с целью выявления ГМО растительного происхождения в пищевых продуктах, в т.ч., в продовольственном сырье.
     
     

2. Общие положения

     
     Методические указания содержат описание метода определения ГМО растительного происхождения в пищевых продуктах с помощью набора реагентов для выявления и идентификации ГМО растительного происхождения с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе. Метод основан на идентификации рекомбинантной ДНК с использованием метода асимметричной мультиплексной полимеразной цепной реакции (далее - амПЦР) и последующей гибридизации продуктов амПЦР с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе. Метод одновременно устанавливает наличие или отсутствие в анализируемой пробе не менее пяти различных рекомбинантных последовательностей ДНК: трех регуляторных (35 S, nos и ocs) и двух селективных (gus, nptll). Идентификация этих последовательностей позволяет проводить предварительную проверку пищевых продуктов на наличие ГМО растительного происхождения. Чувствительность метода не менее 10 г (1пг) ДНК.
     
     

3. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы

     
3.1. Аппаратура и инструменты

     

Амплификатор ДНК типа "Терцик-мс-2" под микроцентрифужные пробирки, вместимостью 0,2; 0,5 см, со скоростью нагрева/охлаждения активного элемента не менее 1,5° С/с

ТУ 9642-001-4648062-98

Комплекс аппаратно-программный для анализа биологических микрочипов типа "ДЕГМИГЕН-001"

ТУ 9443-001-02699501-03

Компьютерная программа "Arra" для анализа изображений, полученных с помощью комплекса "ДЕГМИГЕН-001"

Биологический микрочип с иммобилизованными олигонуклеотидами (прилож.1А)

ТУ 4320-002-71321417-04

Термостат суховоздушный типа ТВ3-25 с рабочей температурой 42 °С, рабочий диапазон от 20 до 60 °С точность поддержания температуры ±1 °С

ТУ 42-61961

Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ±0,0001 г

ГОСТ 24104-01

Термостат типа "TERMO 24-15" под пробирки типа "Эппендорф" вместимостью 0,5 и 1,5 мл, диапазон температур от 15 до 120 °С, количество гнезд - не менее 20 каждого типа, точность поддержания температуры - 0,2 °С, разность температур между соседними ячейками - не более 0,5

Камера морозильная, обеспечивающая температуру минус 20 °С

ГОСТ 26678-85

Холодильник бытовой

ГОСТ 26678-85

Микроцентрифуга настольная типа "Эппендорф" с частотой вращения не менее 13000 мин


Аппарат для встряхивания типа "Вортекс", скорость вращения 250-3000 мин

Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды

ГОСТ 6709-72

Микродозаторы с переменным объемом дозирования: 0,5-10,0 мм (шаг - 0,1 мм, точность ±2,5-10,0%, воспроизводимость 3-7%); 0,5-50,0 мм (шаг - 0,5 мм, точность ±2,0-5,0%, воспроизводимость 2,5-5%); 20,0-200,0 мм (шаг - 1,0 мм, точность ±1,5-2,0%, воспроизводимость 2-3%); 100-1000 мм (шаг - 5 мм, точность ±1,0-1,5%, воспроизводимость 1-2%); 2000-10000 мм (шаг - 10 мм, воспроизводимость 1-2%)

Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 или других видов

ТУ 16-535-84

     
     Примечание. Допускается использование другой аппаратуры и инструментов с аналогичными техническими характеристиками, разрешенных для применения в установленном порядке.
     
     

3.2. Лабораторная посуда и материалы
 

Бумага фильтровальная лабораторная

ГОСТ 12026-76

Воронки стеклянные

ГОСТ 25336-82

Колбы стеклянные мерные плоскодонные конические, вместимостью 25, 50, 100, 200, 1000 см

ГОСТ 12738-77

Чашки Петри

ГОСТ 25336-82

Цилиндры стеклянные мерные лабораторные, вместимостью 25, 100, 1000 см

ГОСТ 1770-74

Пробирки микроцентрифужные типа "Эппендорф", вместимостью 0,2; 0,5; 1,5 см

Наконечники с фильтром для дозаторов с переменным объемом дозирования до 10; 20; 200; 1000; 10000 мм


3.3. Реактивы и реагенты
 

Додецилсульфат натрия (SDS)

Натрия гидроокись

ГОСТ 4328-77

Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), хч

ТУ 6-09-11-1721-83

Альбумин бычий сывороточный сухой (БСА). Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N В 4287

Спирт этиловый ректификованный

ГОСТ Р 51652-00

Вода дистиллированная

ГОСТ 6709-72

Вода деионизованная

ОСТ 11.029.003-80

3%-й раствор пероксида водорода

     
     Примечание. Допускается использование других реактивов с аналогичными техническими характеристиками; препараты импортного производства должны иметь международный сертификат качества ИСО 9 000 или EN 29 000.
     
     

Набор реагентов для выявления и идентификации ГМО растительного происхождения на биологическом микрочипе состоит из набора для выделения ДНК, набора для проведения амПЦР и набора для ДНК гибридизации и ферментного анализа. Наборы рассчитаны на 100 реакций

Набор реагентов для пробоподготовки (бисер - 30 г, лизирующий реагент - 60 см (2 флакона), сорбент - 2 см (2 пробирки), солевой буфер (10-кратный) - 10 см, экстракционный раствор - 10 см)

ТУ 2643-003-71321417-04

     
     Порядок приготовления рабочего раствора солевого буфера описан в п.4.1. Остальные реагенты готовы к использованию.
     

Набор реагентов для амПЦР (включает в себя: сухие смеси реагентов (100 пробирок, каждая пробирка содержит Taq ДНК полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты и хлорид магния с конечными концентрациями, соответственно, 1 ед, 200 мкМ и 2,5 мМ, а также оптимизированную буферную систему для проведения одной стандартной ПЦР); растворитель; минеральное масло; "+" контроль амплификации - 1 пробирка, 0,5 см , праймеры на 35S-промотор вируса мозаики цветной капусты:

ТУ 2643-003-71321417-04

 35S_п 5' CGG CTA CTC CAA GAA TAT CAA AGA TAC AGT TTC AGA AGA

(39 н.о.);

 35S_o* 5' ССА ТТТ ТСС ТTT ТTT АТТ GTC СТТ TCG ATG AAG TGA CAG А

(40 н.о.);

праймеры на маркерный ген gus из бактерии Escherichia coli:

 gus_ 5' ACC GTA CCT CGC АТТ АСС СТТ ACG СТG AAG AGA

(33 н.о.);

 gus_o* 5' TGC CCG CTT CGA AAC CAA TGC CTA AAG AGA

(30 н.о.);

 праймеры на терминатор nos из агробактерии Agrobacterium tumefaciens:

 nos_п 5' GGA CAA GCC GTT TTA CGT TTG GAA CTG АСА GA

(32 н.о.);

 nos_o* 5' GCC TGA CGT ATG TGC TTA GCT CAT TAA ACT ССА GA

(35 н.о.);

праймеры на маркерный ген nptll из транспазона Tn5 бактериального происхождения:

 npt_п 5' GTG ACC CAT GGC GAT GCC TGC TTG С

(25 н.о.);

 npt_o* 5' ACC CAG CCG GCC АСА GTC GAT GAA ТСС AGA

(30 н.о.);

праймеры на промотор ocs из агробактерии Agrobacterium tumefaciens:


 ocs_п 5' AAA AAG TGG CAG AAC CGG TCA AAC CTA AAA GA

(32 н.о.);

 ocs_o* 5' CGT TAT TAG TTC GCC GCT CGG TGT GTC GTA GA

(32 н.о.).

     
     Праймеры расфасованы в 10 пробирках по 0,5 см.
     
     Примечание: 35S_п; gus_п; nos_п; nptll_п; ocs_п - обозначают прямые праймеры; 35S_o*; gus_o*; nos_o*; nptll_o*; ocs_o* - обозначают обратные праймеры меченные биотином; н.о. - нуклеотидные остатки.
     
     

Набор реагентов для ДНК гибридизации и ферментного анализа: 20хSSC - 50 см; диаминобензидин (ДАБ) - 100 таблеток; конъюгат пероксидазы хрена со стрептавидином - 0,1 см с концентрацией 1 мг/см, 1 пробирка

ТУ 2643-003-71321417-04

     
     Примечание. Срок годности набора реагентов - 12 месяцев со дня изготовления. Основную часть реагентов, упакованную в картонную коробку, хранят в сухом темном месте при температуре от 2 до 8 °С. В отдельных пластиковых пакетах при температуре -20 °С хранят праймеры, положительный контроль и конъюгат стрептавидин-пероксидазы.
     
     

4. Подготовка к анализу. Приготовление растворов

 
4.1. Приготовление 0,5 М ЭДТА (рН 8,0)

     

     В мерной колбе на 100 см растворить 18,62 г этилендиаминтетрауксусной кислоты (молекулярный вес 372,2) в 80 см дистиллированной воды. Раствором 30%-й гидроокиси довести рН раствора до 8,0 дистиллированной водой - объем раствора до метки, перемешать. Хранить в колбе с притертой пробкой при комнатной температуре до года.
          

4.2. Приготовление 10%-го раствора SDS

     
     Растворить 10 г SDS в 90 см дистиллированной воды. Хранить при комнатной температуре не более 1 года.
               

4.3. Приготовление рабочего раствора солевого буфера

     
     Содержимое флакона с 10-кратным солевым буфером (10 см) (из набора реагентов) перенести из флакона в цилиндр, довести бидистиллированной водой до отметки 100 см и 96%-м этиловым спиртом до отметки 300 см и перемешать. Рабочий раствор солевого буфера следует хранить в герметично закрытой посуде при температуре 4 °С.
     
     

5. Отбор и подготовка проб пищевых продуктов для анализа

     
     Отбор проб проводят по государственным стандартам, устанавливающим порядок отбора проб для однородных групп пищевой продукции: ГОСТ 5904-82, 9163-90, 12292-00, 10852-86, 12430-66, 13979-86, 26313-84, 22617.0-77, 27668-88, 26312-84, 9792-73, 7631-85, 12036-85, 51447-99*, 135869.3-86*, 13440-89*, 17109-88, 19341-73, 26809-86, 27668-88, 27853-88, 28741-90, 29142-91, 13634-90, 15877-70, 17110-71, 17109-88, ГОСТ Р 50436-92, 50437-92, 51926-02, ГОСТ Р ИСО 2170-97.
_______________
     * Соответствует оригиналу. - Примечание .
          
     

6. Проведение анализа. Выделение ДНК

     
     6.1. В одноразовые центрифужные пробирки типа "Эппендорф" на 1,5 см внести 300 мг бисера и 70-80 мг анализируемого материала. Добавить 0,5 мл 5 мМ Na-соль ЭДТА и термостатировать при 65 °С в течение 30-60 мин. Время инкубации составляет 30 мин для процессированных продуктов (мука, чипсы, детское питание и др.) и до 60 мин для зерна. Через каждые 10-15 мин гомогенизировать пробу срезанным наконечником (для каждой пробы использовать индивидуальный наконечник).
     
     6.2. К содержимому пробирки добавить 400 мм лизирующего реагента из набора реагентов и перемешать на вортексе до максимально однородного состояния. Пробу термостатировать при 65 °С 60-120 мин.
     
     6.3. После термостатирования пробу, при необходимости, еще раз гомогенизировать, добавить 500 мм бидистиллированной воды и перемешать на вортексе.
     
     6.4. Центрифугировать пробу 1 мин при 5000 g (12000 об./мин). Прозрачный супернатант перенести в чистую пробирку.
     
     6.5. Добавить 20 мм сорбента из набора реагентов (перед использованием сорбент следует интенсивно встряхнуть на вортексе). Пробирку поместить на ротатор и перемешивать на вортексе 10 мин (10-20 об./мин).
     
     6.6. Центрифугировать пробу 10 с при 5000 g.
     
     6.7. Осторожно, не задевая осадка, удалить супернатант. К осадку добавить 200 мм лизирующего реагента из набора реагентов и перемешать на вортексе до однородного состояния. Центрифугировать пробу 10 с при 5000 g.
     
     6.8. Удалить супернатант. К осадку добавить 1 см рабочего раствора солевого буфера из набора реагентов, перемешать содержимое пробирки переворачиванием 5-10 раз. Центрифугировать пробу 10 с при 5000 g.
     
     6.9. Удалить супернатант, не задевая осадка.
     
     6.10. К осадку добавить 1 см рабочего раствора солевого буфера, перемешать на вортексе, центрифугировать пробу 10 с при 5000 g и осторожно удалить супернатант.
     
     6.11. Повторить предыдущий пункт еще раз.
     
     6.12. Подсушить осадок при 65 °С в течение 4-5 мин.
     
     6.13. К осадку добавить 50 мм экстракционного раствора из набора реагентов. Отбор раствора из исходного флакона проводить при постоянном помешивании, не допуская выпадения в осадок гранул ионообменной смолы.
     
     6.14. Суспендировать содержимое пробирки на вортексе 5-10 с до гомогенного состояния, затем термостатировать 10 мин при 65 °С.
     
     6.15. Еще раз суспендировать пробу на вортексе, центрифугировать 1 мин при 5000 g.
     
     6.16. Супернатант, содержащий очищенную ДНК, перенести в чистую пробирку и хранить при -20 °С до проведения ПЦР анализа. При отборе раствора ДНК необходимо избегать захвата осадка, содержащего сорбент.
     
     Примечание. Кроме описанного выше сорбционного метода выделения ДНК, возможно использование метода выделения, с помощью СТАВ (гексадецилтриметиламмониум бромид), описанного в методических указаниях по определению генетически модифицированных источников в продуктах питания растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции (МУК 4.2.1902-04 "Определение генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции").
     
     

7. Амплификация

     
     7.1. Перед проведением реакции вынуть из холодильника необходимое количество микропробирок с сухими реагентами из набора реагентов. Промаркировать соответствующим образом: "-" контроль", "исследуемые пробы", "+" контроль".
     
     7.2. Добавить во все пробирки по 5 мм праймеров.
     
     7.3. Добавить во все пробирки по 10 мм растворителя.
     
     7.4. В пробирку, которая служит отрицательным контролем, добавить 5 мм бидистиллированной воды. В опытные пробирки добавить по 5 мм исследуемой ДНК. В пробирку с положительным контролем добавить 5 мм раствора контрольной ДНК.
     
     7.5. Добавить во все пробирки по 20 мм минерального масла (масло не используется в случае, если амплификатор имеет термостатируемую крышку).
     
     7.6. Подготовленные для проведения реакции пробирки перенести в термоблок программируемого термостата и запустить программу амплификации в соответствии с режимами, приведенными в табл.1.
     
     

Таблица 1

     
Программа проведения амПЦР

     

Шаг программы

Температура, °С

Время инкубации, с

Количество циклов

1

94

180

1

2

94

30

42

3

62,5

30

4

72

180

1

     
      Примечание. Для пипетирования жидкостей без примесей рекомбинантной ДНК (праймеры, растворитель, вода), необходимо иметь отдельный комплект микродозаторов, не используемых при пробоподготовке или работах с ДНК-содержащими препаратами. При подготовке смесей для проведения амПЦР каждую пробирку открывают только перед отбором или внесением проб, а по окончании манипуляции сразу же закрывают. Запрещается открывать одновременно несколько микропробирок с пробами и оставлять их открытыми на длительное время.
     
     
     7.7. После завершения реакции микропробирки необходимо передать в помещение, в котором будет проводиться гибридизация. Отбор пробы для гибридизации проводится из-под слоя минерального масла в случае его использования.
     
     7.8. Подготовка проб для амПЦР и их гибридизации с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе в одном помещении не допускается. Реакционные смеси после амплификации содержат в высоких концентрациях фрагменты ДНК, контаминация которыми помещений, оборудования и реактивов может привести к получению ложноположительных результатов.
     
     

8. Проведение ДНК-гибридизации

     
     8.1. Приготовить рабочие разведения раствора 20хSSC (3М NaCI, 0,3 М цитрат натрия, рН 7,4): 2хSSC, 0,1% SDS; 0,1хSSC; 0,1хSSC, 0,1% SDS; 0,01хSSC. Для приготовления 100 см раствора можно воспользоваться табл.2.
     
     

Таблица 2

     
Приготовление рабочих растворов SSC

     

Раствор

20хSSC

10%-й SDS

НО дист.

2хSSC, 0,1% SDS

10 см

1 см

89 см

0,1xSSC

0,5 см

-

99,5 см

0,1xSSC, 0,1% SDS

0,5 см

1 см

98,5 см

0,01хSSC

0,05 см

-

99,95 см

     
     
     8.2. Микропробирки с продуктами амплификации ДНК центрифугировать 1-2 с для сбора пробы на дне пробирки и держать далее только в вертикальном положении. Добавить в каждую микропробирку 5 мм 20хSSC и 0,2 мм 10% SDS, перемешать и центрифугировать 1-2 с. Распределить полученную смесь по поверхности микрочипа, содержащей зоны иммобилизованных олигонуклеотидов.
     
     8.3. Поместить микрочип во влажную камеру (например, в чашку Петри со смоченным дистиллированной водой бумажным фильтром) и поставить на 1 ч в воздушный термостат с температурой 42 °С.
     
     8.4. По окончании реакции капли смыть буфером 2хSSC, 0,1% SDS и затем тщательно промыть чип следующими растворами:
     
      2хSSC, 0,1% SDS - 1 раз 5 мин;
     
      0,1хSSC, 0,1% SDS - 2 раза по 5 мин;
     
      0,1хSSC - 5 раз по 1 мин;
     
      0,01хSSC в течение 10 с.
     
     

9. Проведение ферментного анализа

     
     9.1. Исходный стрептавидин-пероксидазный конъюгат разбавить в 200 раз буфером 1хSSC, содержащим 1% BSA (бычий сывороточный альбумин), из расчета 25 мм на микрочип. Например, необходимо проанализировать 5 микрочипов. Для этого потребуется 25х5=125 мм раствора конъюгата. Готовят с небольшим избытком, 150 мм раствора. Для этого 1,5 мг BSA растворяют в 150 мм 1хSSC, а затем добавляют 0,75 мм исходного конъюгата.
     
     9.2. Нанести 25-30 мм разведенного конъюгата на рабочую зону микрочипа и поместить его на 30 мин во влажную камеру при комнатной температуре.
     
     9.3. Смыть конъюгат раствором 1хSSC.
     
     9.4. Залить микрочип раствором 2хSSC и промыть 5 мин.
     
     9.5. Промыть микрочип раствором 1хSSC.
     
     9.6. Непосредственно перед применением приготовить раствор субстрата - диаминобензидина (ДАБ). Для этого растворить таблетку ДАБ в 1 см буфера 0,1хSSC, добавить 30 мм 3%-го раствора пероксида водорода и перемешать. Раствор использовать немедленно.
     
     9.7. Залить рабочую зону микрочипа раствором субстрата и выдержать от 2 до 10 минут при комнатной температуре. В случае положительной реакции появляются коричневые пятна окисленного субстрата.
     
     9.8. Промыть микрочип дистиллированной водой, встряхнуть капли воды и поместить в термостат 42 °С на 5-10 мин. После сушки микрочип с окрашенными зонами необходимо хранить в темном месте.
     
     

10. Сканирование биологических микрочипов

     
     10.1. В соответствии с руководством по эксплуатации, поставляемым в комплекте с аппаратно-программным комплексом "ДЕГМИГЕН-001", подготовить сканер микрочипов к работе.
     
     10.2. Поместить микрочип в рамку для сканирования, зафиксировать его и закрыть рамку.
     
     10.3. Запустить программу сканирования, функционирующую в диалоговом режиме, дождаться появления на мониторе приглашения к сканированию и только после этого вставить рамку с микрочипом в приемное окно детектора.
     
     10.4. После завершения сканирования микрочипа необходимо сохранить изображение (прилож.1Б), присвоив файлу соответствующее имя.
     
     10.5. Для завершения работы с программой сканирования следует нажать в диалоговом окне клавишу "ВЫХОД".
     
     

11. Анализ изображений биочипов

     
     11.1. Запустить программу обработки изображения микрочипа "Arra".
     
     11.2. Ввести оцифрованное изображение в программу, для этого нужно выбрать опцию меню "Файл", и затем открыть изображение. В появившемся диалоговом окне выбрать формат, в котором представлены изображения, и выбрать в списке нужный файл, после чего изображение появится в основном окне программы.
     
     11.3. Провести операцию разметки матрицы, чтобы совместить центры измерительных зондов с центрами пятен решетки в изображении, для этого выбрать опцию меню "Анализ" и затем "Разметка матрицы". Разметка начинается с рисования прямоугольника, боковые стороны которого проходят через центры узлов крайних столбцов. Для этого нужно щелкнуть левой кнопкой мыши в центре левого верхнего пятна/ячейки. Затем, держа кнопку нажатой, переместить правую нижнюю вершину появившегося прямоугольника в центр нижнего правого узла.
     
     11.4. В результате предварительной разметки на экране появится четырехугольник с внутренними линиями, расположенными равномерно, в соответствии с заданным числом столбцов матрицы.
     
     11.5. Чтобы завершить разметку и закрыть диалоговое окно, нужно нажать клавишу "Принять".
     
     11.6. После завершения базовой разметки проводят автоматическую коррекцию положения зондов. Для этого в меню выбирается опция "Настройки/Автоматическая подстройка".
     
     11.7. Для анализа результатов нужно выбрать опцию меню "Анализ" - "Показать результаты".
     
     11.8. По окончании измерений программа предоставляет возможность подготовки и распечатки протокола испытаний (прилож.2). Для этого нужно выбрать опцию меню "Файл" и затем "Заполнить протокол". После этого появится окно с формой для заполнения. После того как она будет заполнена, нажать кнопку "Выход".
     
     

12. Интерпретация результатов

     
     12.1. Появление регистрируемого компьютерной программой Arra оптического сигнала в одной, нескольких или во всех пяти зонах гибридизации, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды, указывает на присутствие рекомбинантной ДНК, свидетельствующей о наличии ГМО растительного происхождения в анализируемом образце (пробе).
     
     12.2. Отсутствие регистрируемого оптического сигнала во всех пяти гибридизационных зонах, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды, указывает на неимение рекомбинантной ДНК, что свидетельствует о том, что анализируемый образец (проба) не имеет ГМО растительного происхождения.
     
     12.3. Появление оптического сигнала в зоне гибридизации при использовании отрицательного контроля амплификации свидетельствует о получении ложноположительного результата. Причиной может быть загрязнение реактивов и/или оборудования. В этом случае необходимо обработать поверхности лабораторных столов и оборудования раствором 1Н соляной кислоты, заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ.
     
     12.4. Отсутствие оптического сигнала при использовании положительного контроля амплификации, свидетельствует о получении ложноотрицательного результата. Причиной могут быть потеря активности одного из компонентов реакционной смеси для амПЦР и/или гибридизации с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе. В этом случае необходимо заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ.
     
     

13. Организация рабочих мест

     
     Организация рабочих мест для проведения исследований, описанных в настоящих методических указаниях, проводится в соответствии с МУК 4.2.1902-04 "Определение генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции".
     
     

Нормативные ссылки

     
     1. Федеральный закон "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" от 30.03.99 N 52-ФЗ (в редакции от 09.05.2005 N 45-ФЗ).
     
     2. Закон Российской Федерации "О защите прав потребителей" от 07.02.92 N 2300-I (в редакции от 21.12.2004 N 171).
     
     3. Постановление Правительства Российской Федерации "Об утверждении Положения о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании" от 24.07.2000 N 554 (в редакции от 15.09.2005 N 569).
     
     4. Постановление Правительства Российской Федерации "О Положении об осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора в Российской Федерации" от 15.09.2005 N 569.
     
     5. Постановление Правительства Российской Федерации "Об утверждении Положения о Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" от 30.06.2004 N 322.
     
     6. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации "О порядке проведения санитарно-эпидемиологической экспертизы пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников" от 08.11.2000 N 14.
     
     7. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации "Об усилении надзора за пищевыми продуктами, полученными из ГМИ" от 31.12.2004 N 13.
     
     8. СанПиН 2.3.2.1078-01 "Продовольственное сырье и пищевые продукты. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов".
     
     9. ГОСТ 5904-82 "Изделия кондитерские. Правила приемки, методы отбора и подготовки проб".
     
     10. ГОСТ 9163-90 "Консервы мясные и мясорастительные. Сосиски. Технические условия".
     
     11. ГОСТ 12292-00 "Консервы рыбные с растительными гарнирами. Технические условия".
     
     12. ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб".
     
     13. ГОСТ 12430-66 "Продукция сельскохозяйственная. Методы отбора проб при карантинном досмотре и экспертизе".
     
     14. ГОСТ 26313-84 "Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб".
     
     15. ГОСТ 22617.0-77 "Семена сахарной свеклы. Правила приемки и методы отбора проб".
     
     16. ГОСТ 27668-88 "Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб".
     
     17. ГОСТ 26312.1-84 "Крупа. Правила приемки и методы отбора проб".
     
     18. ГОСТ 9792-73 "Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила приемки и методы отбора проб".
     
     19. ГОСТ 7631-85 "Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Правила приемки, органолептические методы оценки качества, методы отбора проб для лабораторных испытаний".
     
     20. ГОСТ 12036-85 "Семена сельскохозяйственных культур. Правила приемки и методы отбора проб".
     
     21. ГОСТ Р 51447-99 "Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб".
     
     22. ГОСТ 17109-88 "Соя. Требования при заготовках и поставках".
     
     23. ГОСТ 19341-73 "Консервы рыбные. Печень рыб с растительными добавками. Технические условия".
     
     24. ГОСТ 26809-86 "Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу".
     
     25. ГОСТ 27853-88 "Овощи соленые и квашеные, плоды и ягоды моченые. Приемка, отбор проб".
     
     26. ГОСТ 28741-90 "Продукты питания из картофеля. Приемка, подготовка проб и методы испытаний".
     
     27. ГОСТ 29142-91 "Семена масличных культур. Отбор проб".
     
     28. ГОСТ 13634-90 "Кукуруза. Требования при заготовках и поставках".
     
     29. ГОСТ 15877-70 "Кукуруза сахарная консервированная. Технические условия".
     
     30. ГОСТ 17110-71 "Соя (промышленное сырье). Требования при поставках. Технические условия".
     
     31. ГОСТ Р 50436-92 "Зерновые. Отбор проб зерна".
     
     32. ГОСТ Р 50437-92 "Бобовые культуры в мешках. Отбор проб".
     
     32. ГОСТ Р 51926-2002 "Консервы. Икра овощная. Технические условия".
     
     34. ГОСТ ИСО 2170-97 "Зерновые и бобовые. Отбор проб молотых продуктов".
     
     

Приложение 1

     
Пример гибридизационной картины продуктов амПЦР
на биологическом микрочипе

     
     

     А
             

     
     

      Б
          

          
     
     A - схема негелевого биологического микрочипа для идентификации ГМИ растительного происхождения;
     
     Б - гибридизационная картина на экране компьютера, полученная в результате анализа генетически модифицированной сои, содержащей промотор 35S и терминатор nos.
     
     

Приложение 2

Форма протокола испытаний по идентификации генно-инженерно-
модифицированных организмов (ГМО) растительного происхождения
с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе

     
ПРОТОКОЛ ИСПЫТАНИЙ

Серия АБ N 0000000

     

N_____от "__" __________200__г.

Продукция

Производитель сырья или продукции

Предъявитель сырья или продукции

Отбор проб произведен в соответствии с нормативным документом на соответствующую группу сырья или продукции

Акт отбора проб и техническое задание на испытания N ___от

Испытания проведены на основании требований

Номер образца

Характеристика испытуемого образца (маркировка, вид и состояние упаковки, этикетки, штрих кода)

в образцах N _______ отсутствует, а в образце N ______ присутствует

Маркировка:

Годен до

Штриховой код

     
     Результаты испытаний
     

Номер образца

Трансгенные последовательности

35S

gus

nos

nptll

ocs






     
     

Результаты анализа

Исполнители:

        подпись

          подпись

        подпись

          подпись

Руководитель испытательной лаборатории

подпись

М. П.

Фамилия, инициалы

Заключение распространяется на образец, представленный на испытания.

     
     
     
Текст документа сверен по:
официальное издание
Бюллетень нормативных и методических
документов госсанэпиднадзора, Выпуск N 4(22), 2005