МУК 4.2.1008-00

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ


Метод микробиологического измерения концентрации клеток
микроорганизма Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В 99 - продуцента
витамина B в воздухе рабочей зоны

    
    
Дата введения 2000-12-21

    
    
    1. РАЗРАБОТАНЫ к.б.н. Бару Р.В., к.б.н. Лапчинской А.В. (Государственный научный центр по антибиотикам).
    
    2. УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем министра здравоохранения Российской Федерации 21 декабря 2000 г.
    
    3. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.
    

1. Общие положения и область применения

    
    Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В 99 - продуцента витамина В в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 м воздуха.
    
    Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТа 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования" и ГОСТа Р 8.563-96  Методики выполнения измерений".
    
    Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.
    
    Методические указания одобрены и рекомендованы секцией "Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды" Проблемной комиссии "Научные основы гигиены окружающей среды".
    

2. Характеристика штамма-продуцента витамина В

    
    Микроорганизм Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В 99 является продуцентом витамина  В. Штамм растет на агаризованных средах на основе мелассы при температуре 28 °С. В течение 3 суток образует округлые колонии 1-2 мм белого цвета. Морфологически представляет собой грамотрицательные подвижные палочки размером 0,45-0,85x0,6 мкм. Штамм устойчив к следующим антибиотикам: левомицетину, линкомицину, полимиксину М, ристомицину, цефалотину и эритромицину.
    
    Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 2000 кл/м.
    
    

3. Пределы измерений

    
    Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток продуцента витамина В в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 м воздуха при доверительной вероятности 0,95.
    
    

4. Метод измерений

    
    Метод основан на аспирации из воздуха клеток продуцента витамина В на поверхность плотной питательной среды и подсчета выросших колоний по типичным морфологическим признакам.
    

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

    
    При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.
    

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

5.2. Реактивы, растворы

    Антибиотики: левомицетин, линкомицин, полимиксин М, цефалотин, эритромицин.
    

    
    Среда: меласса - 100-150 г; (NH)2HPO - 1,3 г; MgSО 7HO - 1,0 г; (NH)SO - 0,5 г; MnSOHO - 0,1 г; ZnSO7HO - 0,1 г; агар Difco - 20 г; вода дистиллированная - до 1000 мл; рН - 6,8-7,0; стерилизация 121 °С, 30 минут.
    
    

6. Требования безопасности

    
    При выполнении измерений концентрации клеток продуцента витамина В в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.
    
    6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.
    
    6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.
    
    6.3. Руководство "Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности" (1980), "Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977).
    
    6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
    

7. Требования к квалификации операторов

    
    К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
    

8. Условия измерений

    
    Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха 20±5 °С, атмосферном давлении 630-800 мм рт.ст. и влажности воздуха не более 80%.
    

9. Проведение измерения

9.1. Условия отбора проб воздуха

    Для определения продуцента витамина В воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (1-10 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента.
    
    Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
    
    

9.2. Выполнение анализа

    
    Метод предполагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний, выросших на 2-3 сутки после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.
    
    Селективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор антибиотика (левомицетин, линкомицин, цефалотин и др.) из расчета 30 мкг на 1 мл среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.
    
    После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 28 °С. Через 48-72 часа производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.
    

10. Вычисление результатов измерения

    
    Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м воздуха производят по формуле:
    

, кл/м,

где - концентрация клеток продуцента в воздухе;
    
- количество колоний продуцента, выросших на чашке;
    
    1000 - коэффициент пересчета на 1 м воздуха;
    
- объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).
    
    В случае невозможности использования аппарата Кротова рекомендуется применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 60 минут (при определении концентрации микроорганизма в атмосферном воздухе). При использовании этого метода пользуются следующим расчетом концентрации клеток продуцента:
    
    эмпирически установлено, что за 5 мин на площадь 100 см оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, за 1 мин - 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм (радиус 8 см) равна 78,54 см.
    
    Составляем пропорцию:
    
    на 100 см за 1 мин оседает 2 л воздуха
    
    на 78,54 см          -                л
    
= 1,57 л/мин
    
    Следовательно, на стеклянную чашку Петри за 1 мин оседает 1,57 л воздуха
    
    Надо определить количество клеток в 1 м воздуха.
    
    На 1 чашку (диаметр 100 мм) за 1 мин оседает количество микробов, содержащихся в 1,57 л воздуха, за Т мин - 1,57·Т л.
    
    В этом количестве содержится колониеобразующих единиц (микробных клеток - спор, обрывков мицелия), а в 1 м воздуха содержится -
    

    Пример: за 30 мин седиментации выросло 12 колоний микроорганизма. В 1 м воздуха содержится
    

  клетки

11. Оформление результатов измерений

    
    Результаты измерений оформляют протоколом по форме.
    
    Протокол N
    количественного микробиологического анализа штамма-продуцента
    Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В 99 в воздухе рабочей зоны.
    

    
    Результаты микробиологического анализа
    

    
    
    Ответственный исполнитель
    
    Научный руководитель
    
    

Список литературы

    1. ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования".
    
    2. ГОСТ 8.563-96. ГСИ. "Методики выполнения измерений".
    
    3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности. М. - 1980. - 27 с.
    
    4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. М. - 1977. - 7 с.
    
    
    
Текст документа сверен по:
официальное издание
М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора
Минздрава России, 2001