ГОСТ Р 52415-2005

Группа Н19

     
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОЛОКО НАТУРАЛЬНОЕ КОРОВЬЕ - СЫРЬЕ

Люминесцентный метод определения количества мезофильных аэробных
и факультативно-анаэробных микроорганизмов

Fresh cow's milk - raw material.
Luminescent method of quantitative determination of the total amount of mesophilic
aerobic and elective anaerobic microorganisms

     
     
ОКС 67.100.10
ОКП 92 2000

Дата введения 2007-01-01

     
     
Предисловие

     
     Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"
     
     Сведения о стандарте
     
     1 РАЗРАБОТАН ООО "Люмтек"
     
     2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 186 "Молоко и молочные продукты"
     
     3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 23 декабря 2005 г. N 331-ст
     
     4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
     
     
     Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте национального органа Российской Федерации по стандартизации в сети Интернет
     
     

     1 Область применения

     
     Настоящий стандарт распространяется на сырое натуральное коровье молоко - сырье (далее - молоко) и устанавливает люминесцентный метод определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) от 50 тыс. до 20000 тыс. КОЕ/см. Наименьший предел обнаружения КМАФАнМ - не менее 50 тыс. КОЕ/см.
     
     Требования к молоку установлены в ГОСТ Р 52054.
     
     

     2 Нормативные ссылки

     
     В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
     
     ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения
     
     ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия
     
     ГОСТ Р 51917-2002 Продукты молочные и молокосодержащие. Термины и определения
     
     ГОСТ Р 52054-2003 Молоко натуральное коровье - сырье. Технические условия
     
     ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
     
     ГОСТ 2228-81 Бумага мешочная. Технические условия
     
     ГОСТ 2405-88 Манометры, вакуумметры, мановакуумметры, напоромеры, тягомеры и тягонапоромеры. Общие технические условия
     
     ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия
     
     ГОСТ 3145-84 Часы механические с сигнальным устройством. Общие технические условия
     
     ГОСТ 6709-72 Реактивы. Вода дистиллированная. Технические условия
     
     ГОСТ 8218-89 Молоко. Метод определения чистоты
     
     ГОСТ 9225-84 Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа
     
     ГОСТ 10157-79 Аргон газообразный и жидкий. Технические условия
     
     ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
     
     ГОСТ 12290-89 Картон фильтровальный для пищевых жидкостей. Технические условия
     
     ГОСТ 22649-83 Стерилизаторы воздушные медицинские. Общие технические условия
     
     ГОСТ 22967-90 Шприцы медицинские инъекционные многократного применения. Общие технические требования и методы испытаний
     
     ГОСТ 23932-90 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические условия
     
     ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования
     
     ГОСТ 24861-91 (ИСО 7886-84) Шприцы инъекционные однократного применения
     
     ГОСТ 26668-85 Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов
     
     ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу
     
      ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний
     
     ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой
     
     Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте национального органа Российской Федерации по стандартизации в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться замененным (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
     
     

     3 Термины, определения, обозначения и сокращения

     
     3.1 В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ Р ИСО 5725-1 и ГОСТ Р 51917.
     
     3.2 В настоящем стандарте применены следующие обозначения и сокращения:
     
     КМАФАнМ - количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов;
     
     АТФ - аденозин-5'-трифосфат;
     
     ВРN-реагент - растворитель соматических клеток, белка и жира молока;
     
     КОЕ - колониеобразующие единицы.
     
     

     4 Методика определения

     
     Метод основан на:
     
     - растворении соматических клеток, белка и жира молока BPN-реагентом;
     
     - фильтровании полученного раствора молока через бактериальный мембранный фильтр;
     
     - растворении отфильтрованных микроорганизмов диметилсульфоксидом;
     
     - измерении люминесценции полученного раствора, расчете молярной концентрации АТФ микроорганизмов и выражении ее значения в КОЕ/см молока.
     
     4.1 Средства измерений и вспомогательные устройства
     
     Прибор "Биотокс-7", обеспечивающий измерение люминесценции в диапазоне длин волн от 380 до 600 нм по [1].
     
     Люминометрическая кювета полистирольная диаметром 10 мм, вместимостью 0,35 см, дно которой выполнено из бактериального мембранного фильтра с порами 0,45 мкм (приложение А, рисунок 1) [2].
     
     Штатив для люминометрических кювет (приложение А, рисунок 2) [2].
     
     Шприц медицинский вместимостью 5 см по ГОСТ 22967, ГОСТ 24861.
     
     Наконечник резиновый к медицинскому шприцу (приложение А, рисунок 3) [2].
     
     Колба вместимостью 5 см, 100 см, 1 дм по ГОСТ 1770.
     
     Пипетки автоматические, позволяющие дозировать объемы: 0,02, 0,05, 0,2 и 1 см [3].
     
     Наконечники к автоматическим пипеткам стерильные [4].
     
     Термометр стеклянный жидкостной (нертутный), диапазон измерения 0 °С - 100 °С, цена деления шкалы 1 °С по ГОСТ 28498.
     
     Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.
     
     Шкаф сушильный, позволяющий поддерживать температуру (165±5) °С.
     
     Стерилизатор воздушный медицинский по ГОСТ 22649 или стерилизатор паровой медицинский, позволяющие поддерживать температуру (121±2) °С.
     
     Баня водяная, позволяющая поддерживать температуру (45±1) °С.
     
     Перегонная установка (см. приложение Б).
     
     Весы лабораторные с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ±0,02 мг по ГОСТ 24104.
     
     Установка для получения деионизированной воды по [5].
     
     Пипетка стеклянная номинальной вместимостью 50 см 2 кл. по ГОСТ 29169.
     
     Эксикатор по ГОСТ 23932.
     
     Вакуумметр по ГОСТ 2405.
     
     4.2 Реактивы и материалы
     
     АТФ-реагент для биолюминесцентного определения АТФ, чистый сухой, содержащий люциферзу светляков, Д-люциферин, соль магния, компоненты буферной системы, стабилизаторы [6].
     
     Вода деионизированная с электропроводимостью не более 0,1 мкСм, получаемая в соответствии с инструкцией к установке по 4.1.
     
     Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
     
     АТФ сухой с содержанием основного вещества не менее 99% [7].
     
     BPN-реагент чистый сухой с массовой долей неионного детергента не более 5%, содержащий компоненты буферной системы и комплекс протеаз [8].
     
     Промывочный раствор для подготовки образцов к АТФ-метрии, чистый, с массовой долей неионного детергента не более 1% [9].
     
     Диметилсульфоксид [10].
     
     Кислота соляная по ГОСТ 3118, х.ч.
     
     Аргон по ГОСТ 10157.
     
     Фильтровальная бумага по ГОСТ 12026 или фильтровальный картон по ГОСТ 12290.
     
     Бумага мешочная по ГОСТ 2228.
     
     Спирт этиловый по ГОСТ Р 51652.
     
     Допускается применение других средств измерений, вспомогательных устройств с метрологическими и техническими характеристиками, а также реактивов и материалов по качеству не уступающим приведенным выше.
     
     4.3 Отбор проб
     
     Отбор проб - по ГОСТ 9225 и ГОСТ 26809.
     
     4.4 Подготовка к измерениям
     
     4.4.1 Приготовление водного раствора с массовой долей соляной кислоты от 1% до 2%
     
     В мерную колбу вместимостью 1 дм (см. 4.1) наливают от 100 до 200 см дистиллированной воды и доливают пипеткой (см. 4.1) 50 см соляной кислоты (см. 4.2). Приливают дистиллированную воду до метки.
     
     4.4.2 Подготовка посуды, инструментов и материалов
     
     Лабораторную посуду, инструменты и материалы (полоски фильтровальной бумаги или фильтровального картона размером 4х12 см, завернутые в бумагу (см. 4.2), стерилизуют в соответствии с ГОСТ 26668 (пункт 1.2).
     
     Колбу для отбора молока вместимостью 100 см (см. 4.1) кипятят в водном растворе соляной кислоты по 4.4.1 в течение 15 мин и ополаскивают дистиллированной водой. Затем колбу стерилизуют в сушильном шкафу при температуре (160±5) °С в течение 2 ч с последующим охлаждением в эксикаторе (см. 4.1) либо в стерилизаторе при температуре (121±2) °С в течение (30±1) мин с последующим охлаждением в эксикаторе (см. 4.1).
     
     4.4.3 Очистка диметилсульфоксида с помощью перегонки
     
     Диметилсульфоксид перегоняют в потоке аргона при температуре (72,0±0,2) °С и остаточном давлении 15 мм рт.ст. Для шлифов перегонной установки (см. 4.1) использование смазки не допускается. Перегнанный диметилсульфоксид хранят в стеклянной посуде без доступа света в течение 30 дней при температуре не выше 4 °С.
     
     4.4.4 Подготовка раствора АТФ-реагента
     
     В упаковку с сухим АТФ-реагентом (см. 4.2) автоматической пипеткой, позволяющей дозировать 1 см, вносят деионизированную воду по 4.2 в объеме, указанном на этикетке упаковки, и осторожно перемешивают покачиванием. Если для испытания используют несколько упаковок с сухим АТФ-реагентом, то их содержимое после добавления деионизированной воды объединяют в одну упаковку с помощью автоматической пипетки. Перед использованием раствор АТФ-реагента выдерживают от 15 до 30 мин. Полученный раствор используют в течение 6 ч.
     
     4.4.5 Приготовление контрольного образца АТФ с молярной концентрацией () - 1·10моль/см
     
     Взвешивают (0,2755±0,0001) г АТФ (см. 4.2), растворяют его деионизированной водой в мерной колбе вместимостью 5 см (молярная концентрация водного раствора АТФ - 0,1 моль/см).
     
     0,5 см водного раствора АТФ вносят в мерную колбу вместимостью 5 см и доводят объем раствора до метки диметилсульфоксидом по 4.4.3 (молярная концентрация полученного раствора АТФ в диметилсульфоксиде - 1·10 моль/см). Данную процедуру повторяют еще девять раз, последовательно растворяя 0,5 см вновь получаемых растворов диметилсульфоксидом в мерных колбах вместимостью 5 см.
     
     Допускается использовать для приготовления контрольного образца лиофильно высушенную смесь АТФ с инертными наполнителями, обеспечивающую после ее растворения молярную концентрацию АТФ 1·10 моль/см.
     
     4.4.6 Измерение люминесценции контрольного образца АТФ
     
     Люминометрическую кювету помещают в кюветное отделение прибора для измерения люминесценции и последовательно вносят в нее 0,02 см контрольного образца АТФ по 4.4.5 и 0,05 см деионизированной воды, а также 0,05 см раствора АТФ-реагента по 4.4.4. Раствор перемешивают прокачиванием: трижды набирая содержимое люминометрической кюветы в наконечник автоматической пипетки вместимостью 0,05 см и возвращая его в люминометрическую кювету. Измеряют люминесценцию .
     
     Процедуру измерения люминесценции контрольного образца АТФ проводят дважды. АТФ-реагент считают пригодным для проведения испытаний, если для среднеарифметического значения двух результатов наблюдений люминесценции выполняется условие: 500 усл.ед.
     
     4.4.7 Подготовка пробы молока
     
     Из объединенной пробы молока по ГОСТ 9225 отбирают 250 см молока, фильтруют его через иглопробивную ткань в соответствии с требованиями ГОСТ 8218 (см. разделы 2, 3). Предварительно ткань стерилизуют при температуре (121±2) °С в течение (30±1) мин, охлаждают в эксикаторе до температуры (20±2) °С. Предварительно поверхность установки для фильтрования молока обрабатывают этиловым спиртом (см. 4.2) и высушивают.
     
     4.5 Проведение измерений
     
     4.5.1 Отбирают 50 см отфильтрованного молока по 4.4.7 и помещают в колбу вместимостью 100 см, подготовленную по 4.4.2. Молоко подогревают до температуры (20±2) °С и перемешивают.
     
     4.5.2 Автоматической пипеткой отбирают 1 см молока по 4.5.1, вносят его в упаковку с ВРN-реагентом и перемешивают ее содержимое. Упаковку выдерживают в водяной бане при (45±1) °С в течение 10 мин.
     
     4.5.3 Люминометрическую кювету устанавливают на стопку из трех-пяти полосок фильтровальной бумаги или на одну полоску фильтровального картона по 4.4.2, помещенных в штатив для люминометрических кювет (приложение А, рисунок 2). В люминометрическую кювету автоматической пипеткой вместимостью 0,2 см вносят 0,2 см раствора по 4.5.2 и продавливают его в фильтровальную бумагу или фильтровальный картон, создавая избыточное давление воздуха с помощью шприца с резиновым наконечником (приложение А, рисунок 3). Стопку фильтровальной бумаги или полоску фильтровального картона в штативе для люминометрических кювет периодически перемещают так, чтобы после фильтрования под люминометрической кюветой она оставалась сухой.
     
     Если фильтрование затруднено, то процедуру по 4.5.2 повторяют с увеличением времени выдерживания упаковки в водяной бане до 20 мин.
     
     4.5.4 В люминометрическую кювету по 4.5.3 автоматической пипеткой вместимостью 0,2 см вносят 0,2 см промывочного раствора (см. 4.2) и продавливают его в фильтровальную бумагу или фильтровальный картон, создавая избыточное давление с помощью шприца с резиновым наконечником. Стопку фильтровальной бумаги (или полоску фильтровального картона) в штативе для люминометрических кювет периодически перемещают так, чтобы после фильтрования под люминометрической кюветой она оставалась сухой.
     
     4.5.5 Подготовленную люминометрическую кювету по 4.5.4 помещают в кюветное отделение прибора для измерения люминесценции и автоматической пипеткой вместимостью 0,02 см вносят в нее 0,02 см диметилсульфоксида по 4.4.3. Через 1 мин автоматической пипеткой вместимостью 0,05 см в люминометрическую кювету вносят последовательно 0,05 см деионизированной воды и 0,05 см раствора АТФ-реагента по 4.4.4. Раствор перемешивают прокачиванием: трижды набирая содержимое люминометрической кюветы в наконечник автоматической пипетки и возвращая его в люминометрическую кювету. Измеряют люминесценцию анализируемой пробы .
     
     4.5.6 Процедуры по 4.5.3-4.5.5 проводят дважды.
     
     4.6 Обработка результатов
     
     4.6.1 За результат измерений люминесценции контрольного образца принимают среднеарифметическое значение двух результатов наблюдений , если их повторяемость (сходимость) не превышает 10% среднеарифметического значения.
     
     4.6.2 За результат измерений люминесценции анализируемой пробы принимают среднеарифметическое значение двух результатов наблюдений , если их повторяемость (сходимость) не превышает 10% среднеарифметического значения.
     
     4.6.3 В случае, если повторяемость превышает 10%, процедуры по 4.4.6 и 4.5.2-4.5.5 повторяют.
     
     4.6.4 Молярную концентрацию АТФ , моль/см, в анализируемой пробе рассчитывают по формуле
     

,                                                  (1)

     
где  - коэффициент, учитывающий концентрирование микроорганизмов в люминометрической кювете при фильтровании раствора;
     
      - молярная концентрация АТФ в контрольном образце, 1·10 моль/см по 4.4.6;
     
      - среднеарифметическое значение двух результатов наблюдений люминесценции контрольного образца АТФ по 4.4.6, усл.ед.;
     
      - среднеарифметическое значение двух результатов наблюдений люминесценции анализируемой пробы, усл.ед.
     
     4.6.5 Количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов определяют по таблице 1.
     
     
Таблица 1
     

     
     
Приложение А
(обязательное)

     
Вспомогательные устройства для фильтрования молока

     
Рисунок 1 - Люминометрическая полистирольная кювета

               
Рисунок 2 - Штатив для люминометрической кюветы

          
Рисунок 3 - Резиновый наконечник к медицинскому шприцу

     
     
Приложение Б
(рекомендуемое)

     
Перегонная установка

       
1 - нагреватель; 2 - термометр; 3 - холодильник; 4 - вакуумметр; 5 - охлаждаемая склянка;
6 - приемник фракций; 7 - круглодонная колба; 8 - капилляр

Рисунок Б.1

     
     
Библиография

     
     
     
Текст документа сверен по:
официальное издание
М.: Стандартинформ, 2006