МУК 4.1.1452-03

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств дикамбы в зерне, соломе,
зеленой массе растений, воде и почве газожидкостной
и тонкослойной хроматографией

Дата введения 2003-06-30

     УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 24 июня 2003 г.
     
     

1. Вводная часть

     Фирма-производитель: "Гарда", Индия.
     
     Торговое название: дикамба.
     
     Название действующего вещества по ISO: дикамба.
     
     Название действующего вещества по IUPAC: 3,6-дихлор--анисовая кислота.
     
     Структурная формула:
     

     Эмпирическая формула: CHClO.
     
     Молекулярная масса: 221,05.
     
     В чистом виде белые кристаллы с  114-116 °С. Упругость паров при 25 °С 4,5·10 Па (3,4·10 мм рт.ст.). Разлагается при 200 °С. Растворимость при 25 °С в воде 6,5 г/л, ацетоне 810 г/л, дихлорметане 260 г/л, диоксане 1,18 г/л, этаноле 922 г/л. Растворимость в воде натриевой соли 360 г/л, калиевой соли - 480 г/л, диметиламинной соли 720 г/л по эквиваленту кислоты.
     
     Коэффициент распределения -октанол-вода  0,60 (при рН 5); - 0,80 (при рН 7); - 0,24 (при рН 9).
     
     ПДК в воде 0,02 мг/л, ПДК в почве 0,2-0,25 мг/кг.
     
     МДУ в зерне хлебных злаков "не допускается". Норматив "не допускается" установлен при нижнем пределе методом ТСХ 0,3-0,5 мг/кг и методом ГЖХ 1,5 мг/кг см. в книге "Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде" /Под ред. М.А.Клисенко, М.: Колос, 1997, с.188-238.
     
     МДУ в США в зерне - 0,5 мг/кг, в молоке - 0,05 мг/кг.
     
     

2. Методика определения дикамбы в зерне, соломе,
зеленой массе растений, воде и почве

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

     Метод основан на извлечении дикамбы из подкисленной пробы диэтиловым эфиром, очистке экстракта перераспределением в водно-щелочную среду, а затем, после подкисления раствора, в хлороформ с последующей доочисткой сублимацией в вакууме. Для зеленой массы растений перед сублимацией проводится очистка активированным углем.
     
     Определение дикамбы проводят ГЖХ в виде метилового эфира или ТСХ.
     

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

     Метрологическая характеристика метода представлена в табл.1.
     
     

Таблица 1

Метрологическая характеристика метода

     
     
2.1.3. Избирательность метода

     Метод селективен. Селективность метода обеспечивается сочетанием метода ГЖХ с использованием двух альтернативных колонок, а ТСХ - двух альтернативных систем подвижных растворителей.
     
     

2.2. Реактивы и материалы

2.3. Приборы, аппаратура и посуда

2.4. Отбор проб

     Отбор проб для анализа проводят в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", утвержденными Минздравом СССР от 21.08.79 N 2051-79.
     
     

2.5. Подготовка к определению

2.5.1. Приготовление стандартных растворов

     Для приготовления стандартного раствора 1 с содержанием 100 мкг/мл в мерную колбу вместимостью 100 мл помещают навеску дикамбы (10 мг), взятую с точностью до ±0,2 мг. Навеску растворяют в ацетоне и доводят до метки тем же растворителем.
     
     Для приготовления раствора 2 из раствора 1 пипеткой отбирают 1 мл и переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят до метки ацетоном.
     
     Стандартные растворы стабильны при хранении в холодильнике в течение 6 месяцев.
     

2.5.2. Для ГЖХ определения

     2.5.2.1. Приготовление диазометана
     
     В круглодонную колбу 1 вместимостью 100 мл, снабженную капельной воронкой с байпасом и обратным холодильником, помещают 12 г (0,2 моля) КОН, 6 мл метилового спирта, 6 мл или 6,1 г (0,12 моля) гидразин-гидрата. Колбу охлаждают до +5 °С смесью воды со льдом и начинают медленно, по каплям прибавлять из капельной воронки 10 мл (0,12 моля) хлороформа, постепенно увеличивая скорость. При этом реакционная масса становится желтой.
     
     Выделяющийся в ходе реакции диазометан через обратный холодильник, соединенный с капилляром стеклянным переходом, поступает в двугорлую колбу-приемник 2, вместимостью 100 мл, содержащую 50 мл осушенного серного эфира. Колба 2 погружена в баню, содержащую смесь воды со льдом.
     
     По окончании прибавления хлороформа реакционную колбу нагревают до 40 °С на водяной бане для полного удаления диазометана из реакционной массы. После обесцвечивания реакционной массы и стенок холодильника реакцию считают законченной. Диазометан хранят в склянке с притертой пробкой в морозильной камере.
     
     2.5.2.2. Подготовка газохроматографической колонки
     
     Для газохроматографического анализа используют готовый товарный носитель хроматон N-AW-DMCS (0,16-0,20 мм) с 5% SE-30 и хроматон N-AW-DMSC (0,16-0,20 мм) с 5% OV-17. Хроматографическую колонку заполняют насадкой с подсоединением слабого вакуума. Достаточная плотность набивки обеспечивается равномерной загрузкой и непрерывным постукиванием по колонке. Колонку кондиционируют при скорости азота 30 мл/мин в режиме программирования температуры от 50 до 220 °С со скоростью нагрева 2 °С/мин, а затем в изотермическом режиме при температуре 220 °С в течение 6-8 ч без подсоединения колонки к детектору.
     
     Общую подготовку прибора к работе проводят согласно инструкции.
     

2.5.3. Для ТСХ измерения

     2.5.3.1. Приготовление градуировочных растворов
     
     Градуировочные растворы дикамбы в ацетоне с концентрацией от 10 до 60 мкг/мл готовят соответствующим разбавлением стандартного раствора в пробирках с притертыми пробками вместимостью 5 мл, согласно табл.2.
     
     

Таблица 2

     
     
     Допустимый срок хранения градуировочных растворов при комнатной температуре не более 10 дней.
     
     2.5.3.2. Приготовление проявляющих растворов
     
     Проявляющий реагент. Растворяют 0,5 г AgNO в 5 мл дистиллированной воды, добавляют 5 мл концентрированного аммиака до растворения осадка и 90 мл ацетона. Хранить в темном месте.
     
     2.5.3.3. Приготовление хроматографической камеры
     
     Хроматографическую камеру за 1 час до начала хроматографирования заливают смесью подвижных растворителей хлороформ-ацетон (3:1) и хлороформ - уксусная кислота (20:1). Объем подвижных растворителей в камере должен по высоте находиться не выше, чем на 0,7-1,0 см от дна камеры.
     
     

2.6. Подготовка проб к анализу

     Зерно размалывают на кофейной мельнице до консистенции манной крупы. Отбирают навеску массой 20 г. Солому и зеленую массу растений измельчают ножом или ножницами и отбирают навески массой 5 г. Почву просеивают через почвенное сито отбирают навески массой 20 г.
     
     

2.7. Проведение определения

2.7.1. Экстракция и очистка экстрактов

     Зерно. Навеску анализируемой пробы (20 г) помещают в коническую колбу вместимостью 500 мл, добавляют 2%-й HPO, тщательно увлажняют пробу. Дикамбу экстрагируют этиловым эфиром трижды, порциями 100, 80 и 70 мл при помощи механического встряхивания колбы в течение 30 и два раза по 15 мин. Декантируют экстракт через складчатый бумажный фильтр в круглодонную колбу вместимостью 500 мл. Дважды промывают остаток в колбе и фильтр диэтиловым эфиром, порциями по 30 мл.
     
     Объединенный экстракт концентрируют с помощью ротационного вакуумного испарителя до объема 30-40 мл. Остаток переносят в делительную воронку вместимостью 150 мл и несколько раз ополаскивают колбу 20%-м щелочным раствором KCl, общим объемом 20 мл. Промывные воды также переносят в делительную воронку и проводят экстракцию калиевой соли дикамбы путем встряхивания воронки в течение одной-двух минут. После разделения слоев, нижнюю, водную фазу, сливают в другую делительную воронку вместимостью 150 мл. Экстракцию повторяют еще один раз тем же количеством раствора KCl.
     
     Объединенный водный раствор подкисляют серной кислотой, разбавленной водой (1:10), до рН 1 и трижды экстрагируют дикамбу хлороформом, порциями один раз по 30 и два раза по 20 мл. Хлороформный экстракт порциями фильтруют через слой безводного сульфата натрия в грушевидную колбочку вместимостью 50 мл. Каждую порцию фильтрата концентрируют с помощью ротационного вакуумного испарителя до объема 2-3 мл. Фильтр со слоем сульфата натрия промывают 5 мл хлороформа. Последнюю порцию сконцентрированного экстракта количественно, хлороформом, переносят в патрон сублиматора. На горячей водяной бане из сублиматора полностью отгоняют растворитель, регулируя равномерное распределение остатка по дну сублиматора. В патрон помещают "палец" сублиматора, подсоединяют холодную воду и вакуум. Сублимацию дикамбы проводят на кипящей водяной бане в течение 30 мин при давлении 0,2 мм рт.ст. После окончания сублимации дикамбу смывают с "пальца" сублиматора в грушевидную колбочку вместимостью 25 мл ацетоном, общим объемом 15 мл. С помощью ротационного вакуумного испарителя из колбочки полностью отгоняют растворитель. К сухому остатку пипеткой добавляют 0,5 мл гексана, колбочку закрывают пробкой на шлифе и стенки колбы ополаскивают растворителем. Далее определение проводят методом ТСХ по п.2.7.3.
     
     При определении дикамбы методом ГЖХ по п.2.7.2 к сухому остатку пипеткой добавляют 2 мл раствора диазометана в диэтиловом эфире. Через 10-15 мин диазометан и эфир полностью отдувают слабым током воздуха. К сухому остатку пипеткой добавляют 4 мл гексана. Колбочку закрывают пробкой на шлифе и ее стенки тщательно ополаскивают растворителем.
     
     Солома, зеленая масса растений. Навеску анализируемой пробы массой 5 г помещают в коническую колбу вместимостью 500 мл, добавляют 10 мл 2%-й НPO, тщательно увлажняют пробу и проводят экстракцию дикамбы и получение ее калиевой соли, как описано выше для зерна. Водно-щелочной слой, содержащий калиевую соль дикамбы, трижды промывают гексаном, порциями 2 раза по 20 мл и один раз по 10 мл. Гексановый слой отбрасывают, а к водно-щелочному слою добавляют суспензию 0,5 г активированного угля в 30 мл диэтилового эфира. Колбу интенсивно встряхивают, а затем ее содержимое фильтруют через складчатый бумажный фильтр в делительную воронку. Уголь на фильтре промывают 10-15 мл щелочного раствора KCl. После разделения слоев, нижнюю, водную фракцию переносят в другую делительную воронку, а эфирную фракцию отбрасывают. Водный раствор подкисляют до рН 1 разбавленной (1:10) серной кислотой и дальнейшее определение проводят так же, как описано выше для зерна.
     
     Вода. Пробу воды (500 мл) помещают в делительную воронку вместимостью 1 л, добавляют 10 мл 2%-й НPO и трижды экстрагируют дикамбу из воды хлороформом, порциями по 50 мл. Хлороформные экстракты объединяют в плоскодонной колбе вместимостью 250 мл, сушат над безводным сульфатом натрия (~20 г) и порциями декантируют хлороформный раствор в грушевидную колбочку вместимостью 50 мл. Каждую порцию раствора концентрируют с помощью ротационного вакуумного испарителя до объема 1-2 мл. Оставшийся в колбе осушитель дважды промывают хлороформом, порциями по 10 мл. Каждую порцию раствора декантируют в грушевидную колбочку и концентрируют. Из последней порции раствора полностью отгоняют растворитель.
     
     Метилирование дикамбы и дальнейшие операции проводят по схеме, описанной выше для зерна.
     
     Определение дикамбы в воде проводят только методом ГЖХ.
     
     Почва. Анализ почвы проводят так же, как анализ зерна.
     

2.7.2. Определение газожидкостной хроматографией

     Из 4 мл подготовленного по п.2.7.1 экстракта в хроматограф вводят 2 мкл.
     
     Условия хроматографирования:
     

     
     Количественное определение проводят методом соотношения со стандартом по высоте пиков.
     
     Серию стандартов готовят следующим образом: в 5 пробирок, вместимостью 5 мл, с пробками на шлифах, пипеткой вносят из стандартного раствора 2 0,1; 0,2; 0,4; 1,0 и 2,0 мл, что соответствует 0,1; 0,2; 0,4; 1,0 и 2,0 мкг дикамбы. Из пробирок на горячей водяной бане или слабым током воздуха полностью отгоняют растворитель. К сухому остатку пипеткой одновременно с рабочей пробой добавляют по 2 мл раствора диазометана. Через 10-15 мин эфир и диазометан отдувают слабым током воздуха. К сухому остатку пипеткой добавляют 4 мл гексана. Пробирку закрывают пробкой на шлифе и ее стенки тщательно обмывают растворителем. Параллельно с рабочей пробой в хроматограф вводят по 2 мкл полученных растворов. Расчет проводят по стандартному раствору, высота пика которого наиболее близка к высоте пика рабочей пробы.
     

2.7.3. Определение тонкослойной хроматографией

     На пластинку силуфол или сорбфил микрошприцем на 100 мкл или микропипеткой с оттянутым концом наносят 100 мкл (0,1 мл) полученного раствора. Справа и слева от рабочей пробы таким же образом наносят серию стандартных растворов дикамбы (1, 2, 3, 4, 5, 6 мкг). Необходимо следить, чтобы диаметр пятна наносимого раствора не превышал 0,5 см.
     
     После высушивания пятен пластинку помещают в хроматографическую камеру, в которую за 30 мин до начала хроматографирования был налит подвижный растворитель. На пластинках силуфол хроматограмму развивают в системе подвижных растворителей хлороформ-уксусная кислота (40:1) или хлороформ-этилацетат-уксусная кислота (15:15:1); на пластинках сорбфил - сначала в системе хлороформ-ацетон (3:1), а затем, после высушивания хроматограммы, в системе хлороформ - уксусная кислота (20:1). После развития хроматограмму высушивают на воздухе, а затем из пульверизатора сначала обрабатывают проявляющим реагентом, а затем помещают под лампу УФ света на 3 мин. Дикамба проявляется на пластинке в виде коричневых пятен на светло-сером фоне с 0,25±0,05. Линейный диапазон определения 1-6 мкг. Пятна стабильны в течение одного часа, после чего фон темнеет.
     
     

2.8. Обработка результатов анализа

2.8.1. При ГЖХ определении

     Содержание дикамбы в анализируемой пробе () в мг/кг, мг/л, вычисляют по формуле:
     

, мг/кг, мг/л,

     
где  - количество стандарта, введенного в хроматограф, нг;
     
      - высота пика рабочей пробы, мм;
     
      - высота пика стандарта, мм;
     
      - общий объем рабочего раствора, мл;
     
      - объем аликвоты, вводимой в хроматограф, мкл;
         
      - навеска анализируемого образца в г, или объем анализируемой воды в мл.
     
     Если при введении в хроматограф получаются слишком большие пики или происходит зашкаливание, к рабочему раствору пипеткой добавляют замеренное количество гексана и анализируют более разбавленный раствор.
     

2.8.2. При ТСХ определении

     Количественное определение дикамбы в пробе проводят путем сравнения площади и интенсивности окраски пятен рабочей пробы и серии стандартов.
     
     Содержание дикамбы в анализируемой пробе () в мг/кг, мг/л вычисляют по формуле:
     

, мг/кг, мг/л,

     
где  - количество дикамбы, найденное в хроматографируемой пробе, мкг;
     
      - общий объем рабочего раствора, мл;
     
      - объем аликвоты, отобранный для хроматографирования, мл;
          
      - навеска анализируемого образца в г или объем анализируемой воды в мл.
     
     

3. Требования безопасности

     Соблюдать требования безопасности, принятые для работы с пестицидами, легковоспламеняющимися жидкостями, в частности с диэтиловым эфиром.
     
     Полное отсутствие открытого огня в лаборатории!!!
     
     Соблюдать "Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях, отделениях, отделах санитарно-эпидемиологических учреждений системы МЗ СССР" N 2455-81 от 20.10.81, а также меры предосторожности при работе с ядовитым и взрывоопасным диазометаном.
     
     

4. Разработчики