МУК 4.2.2123-06

     
     
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Контроль сыворотки крови крупного рогатого скота
на присутствие посторонних вирусов и микоплазм

     
     
Дата введения: с момента утверждения

     
     
     1. РАЗРАБОТАНЫ: ФГУН "Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича" Роспотребнадзора (Н.В.Шалунова, З.Е.Бердникова, Е.М.Петручук).
     
     2. РЕКОМЕНДОВАНЫ К УТВЕРЖДЕНИЮ Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол N 2 от 11.07.06).
     
     3. УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 17 августа 2006 г.
     
     4. ВВЕДЕНЫ ВЗАМЕН: РД 42-28-14-88 "Контроль сыворотки крови крупного рогатого скота на отсутствие вирусов-контаминантов и микоплазм".
     
     

1. Область применения

     
     1.1. Методические указания устанавливают методы контроля коммерческой сыворотки крови крупного рогатого скота (далее - сыворотка) на присутствие посторонних вирусов и микоплазм. Сыворотка широко применяется при культивировании органов и тканей животных, используемых для приготовления профилактических и диагностических иммунобиологических препаратов и в научных исследованиях. Сыворотка является одним из компонентов питательных сред, используемых для культивирования первичных и перевиваемых клеточных культур.
     
     1.2. Методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, выпускающих и контролирующих медицинские иммунобиологические профилактические препараты.
     
     1.3. Методические указания также могут использоваться организациями, зарегистрированными в Российской Федерации, выпускающими и контролирующими медицинские иммунобиологические профилактические препараты, и специалистами научных лабораторий.
     
     

2. Общие положения

     
     Контроль сыворотки на присутствие посторонних вирусов предусматривает использование первично-трипсинизированных и перевиваемых клеточных культур, являющихся высокочувствительными и доступными для выявления наиболее часто встречающихся вирусов-контаминантов. В этих культурах хорошо размножаются с развитием цитопатических изменений вирусы парагриппа, инфекционного ринотрахеита, диареи и аденовирусы. Продолжительность контроля 28 сут.
     
     Контроль сыворотки на присутствие микоплазм предусматривает проведение двух методов:
     
     1. Микробиологический метод. Метод основан на выявлении роста микоплазм при внесении испытуемой сыворотки в питательные среды. Продолжительность контроля 21 сут.
     
     2. Метод индикаторной клеточной культуры (цитохимический метод).
     
     Метод основан на выявлении ДНК микоплазм, окрашенных флюорохромом Hoechst-33258 на индикаторной клеточной культуре Vero.
     
     Продолжительность контроля 3-5 сут.
     
     

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, оборудование,
реактивы и материалы

     
     3.1. При выполнении контроля должны быть применены следующие средства измерений, оборудование и вспомогательные устройства:
     

     
     3.2. При выполнении контроля должны быть применены следующие реактивы и материалы:
     

     
     
4. Требования безопасности

     
     Работу с микроорганизмами 3 и 4 групп проводят в соответствии с СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами".
     
     

5. Условия проведения контроля

     
     Подготовительные операции и испытания на присутствие посторонних вирусов и микоплазм проводят в чистых помещениях класса А/В (GMP) с ламинарным потоком воздуха при соблюдении правил асептики, при температуре (20±2) °С и относительной влажности 60-70%.
     
     

6. Контроль сыворотки на присутствие посторонних вирусов

     
     При выполнении контроля используют два вида клеточных культур: первично-трипсинизированные - тестикулы эмбрионов быка (ТБ) 4-6-месячного возраста и перевиваемые - почки быка (МДВК) или любые другие перевиваемые клеточные культуры почки крупного рогатого скота, в которые вносят исследуемые сыворотки. Принцип метода основан на появлении цитопатического действия (ЦПД) или гемадсорбции под действием вирусов-контаминантов.
     
     

6.1. Подготовка к выполнению контроля

     
     При подготовке к выполнению контроля сыворотки на присутствие посторонних вирусов должны быть выполнены следующие операции:
     
     6.1.1. Приготовление первично-трипсинизированной клеточной культуры тестикулов эмбрионов быка (ТБ).
     
     6.1.2. Доставляют тестикулы эмбрионов быков 4-6-месячного возраста с перевязанной мошонкой с мясокомбината в любом стерильном сосуде с 250-270 мл раствора Хенкса с 500 ед/мл бензилпенициллина калиевой или натриевой соли.
     
     6.1.3. Обжигают кожу мошонки над пламенем горелки и обрабатывают тампоном со спиртом.
     
     6.1.4. Срезают ножницами кожу с кончика мошонки и, подтягивая тестикулы за семенные канатики, извлекают их.
     
     6.1.5. Помещают тестикулы в стерильную чашку Петри и удаляют ножницами белочную оболочку.
     
     6.1.6. Переносят тестикулы в чашку Петри с 30-35 мл раствора Хенкса с 100 ед/мл антибиотика.
     
     6.1.7. Разрезают тестикулы вдоль и вылущивают ножницами содержимое в раствор Хенкса.
     
     6.1.8. Промывают ткань тестикулов до просветления жидкости 2-3 раза в растворе Хенкса с 500 ед/мл антибиотика.
     
     6.1.9. Помещают ткань тестикулов в колбу вместимостью 500 мл с перемешивающим стержнем, прилагаемым к магнитной мешалке.
     
     6.1.10. Нагревают 0,2%-й раствор трипсина до температуры (20±2) °С и наливают 100-150 мл в колбу. Колбу ставят на магнитную мешалку и включают ее. Скорость вращения перемешивающего стержня должна быть такой, чтобы жидкость не пенилась и стержень не ударялся о стенки колбы.
     
     Перемешивание проводят 5-6 мин.
     
     6.1.11. Сливают надосадочную жидкость после первого цикла трипсинизации в колбу для отходов.
     
     6.1.12. Проводят 4-5 циклов трипсинизации.
     
     6.1.13. Сливают надосадочную жидкость после каждого цикла во флаконы вместимостью 100 мл.
     
     6.1.14. Помещают флаконы в центрифугу и осаждают клетки при скорости 1000-1500 об/мин в течение 10-15 мин.
     
     6.1.15. Вынимают флаконы из центрифуги, сливают надосадочную жидкость в сосуд для отходов.
     
     6.1.16. Добавляют в каждый флакон к осадку клеток по 10-15 мл среды 0,5%-го гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса.
     
     6.1.17. Объединяют полученные суспензии клеток в один флакон и отбирают пипеткой (0,5±0,01) мл.
     
     6.1.18. Добавляют к 0,5 мл этой суспензии 0,5 мл 0,1%-го раствора метиленового синего и подсчитывают окрашенные клетки в камере Горяева при увеличении 70. Для точности результатов подсчет проводят в нескольких пробах. Количество клеток в 1 мл подсчитывают по формуле:
     

,

     
где  - концентрация клеток в 1 мл исходной суспензии;

     
      - среднее число клеток в нескольких пробах;
     
     0,9 - объем камеры Горяева в мм;
     
     1000 - число мм в 1 см;
     
     2 - коэффициент разведения суспензии добавленным объемом краски.
     
     6.1.19. Разводят суспензию клеток средой ДМЕМ во флаконе по п.6.1.17 с таким расчетом, чтобы в 1 мл содержалось 4-5х10 клеток/мл.
     
     6.1.20. Вносят в каждый из 2 флаконов вместимостью 1000 мл по 100-120 мл разведенной суспензии клеток и добавляют 10% сыворотки, предварительно отконтролированной на присутствие посторонних вирусов и микоплазм.
     
     

6.2. Культивирование и подготовка перевиваемой
клеточной культуры почки быка (МДВК)

     
     6.2.1. Готовят во флаконе вместимостью 100 мл 50 мл смеси, состоящей из равных объемов 0,02%-го раствора версена и 0,25%-го раствора трипсина и нагревают ее до температуры (20±2) °С.
     
     6.2.2. Просматривают флаконы с МДВК вместимостью 1000 мл под микроскопом при увеличении 70 и отбирают с полным монослоем клеток.
     
     6.2.3. Сливают питательную среду из флаконов в сосуд для отходов и добавляют смесь версена и трипсина.
     
     6.2.4. Оставляют клетки в смеси версена и трипсина при температуре (20±2) °С и наблюдают за ними визуально.
     
     6.2.5. Когда начнется "набухание" и слабое "отслоение" клеток от стекла (обычно через 15-20 мин), сливают смесь версена и трипсина в сосуд для отходов.
     
     6.2.6. Флаконы с клеточной культурой помещают при температуре (37±1) °С на 30-35 мин.
     
     6.2.7. Добавляют во флаконы по 50 мл среды ДМЕМ и встряхивают их так, чтобы все клетки отделились от стекла.
     
     6.2.8. Подсчитывают клетки в камере Горяева, как указано в п.5.1.18.
     
     6.2.9. Разводят клетки средой ДМЕМ с таким расчетом, чтобы в 1 мл содержалось 2х10 клеток/мл.
     
     6.2.10. Вносят в каждый из 2 флаконов по 100-120 мл разведенной суспензии клеток и добавляют 10% сыворотки, предварительно отконтролированной на присутствие посторонних вирусов и микоплазм.
     
     6.2.11. Через 5-6 сут просматривают флаконы под световым микроскопом и отбирают с полным монослоем клеток.
     
     

6.3. Выполнение контроля сыворотки на присутствие посторонних вирусов

     
     При выполнении контроля сыворотки на присутствие посторонних вирусов должны быть выполнены следующие операции:
     
     6.3.1. Отбирают по 1 флакону с клеточными культурами ТБ и МДВК для проверки испытуемой сыворотки и по 1 флакону с теми же культурами в качестве контрольных.
     
     6.3.2. Сливают питательную среду из флаконов в сосуд для отходов.
     
     6.3.3. Монослой клеток ТБ и МДВК промывают 3 раза средой ДМЕМ без сыворотки.
     
     6.3.4. Вносят пипеткой в каждый из двух флаконов вместимостью 1000 мл с клеточными культурами ТБ и МДВК по 25 мл испытуемой сыворотки так, чтобы разведение в среде не превышало 1:4 из расчета не менее 3 см площади на 1 мл сыворотки.
     
     Одновременно вносят пипеткой в каждый из двух контрольных флаконов вместимостью 1000 мл с клеточными культурами ТБ и МДВК по 25 мл сыворотки, ранее отконтролированной на присутствие посторонних вирусов и микоплазм.
     
     6.3.5. Инкубируют клеточные культуры ТБ и МДВК при температуре (20±2) °С (60±5) мин.
     
     6.3.6. Сливают сыворотку и добавляют в опытные и контрольные флаконы с культурами ТБ и МДВК по 75 мл среды ДМЕМ.
     
     Инкубируют при температуре (37±1) °С 14 сут.
     
     6.3.7. С целью обнаружения цитопатогенного действия (ЦПД) просматривают опытные и контрольные клеточные культуры под микроскопом на 2, 5, 7, 10 и 14 сут.
     
     6.3.8. Если в опытных и контрольных клеточных культурах не будет наблюдаться ЦПД, через 14 сут их трижды замораживают при температуре минус (20±2) °С и размораживают при температуре (37±2) °С.
     
     6.3.9. После размораживания культуры флаконы встряхивают, отбирают из каждого флакона с клеточными культурами ТБ и МДВК по 25 мл суспензии и вносят во флаконы с клетками того же вида. Два флакона с клеточными культурами ТБ и МДВК оставляют для контроля.
     
     6.3.10. Вносят в опытные и контрольные клеточные культуры ТБ и МДВК по 75 мл среды ДМЕМ.
     
     6.3.11. Клеточные культуры инкубируют при температуре (37±2) °С в течение 14 сут.
     
     Если в течение 14 сут в опытных и контрольных клеточных культурах не наблюдается ЦПД, их проверяют на наличие гемадсорбирующих вирусов.
     
     6.3.12. Сливают из флаконов питательную среду и промывают культуры 3 раза раствором Хенкса.
     
     6.3.13. Добавляют в опытные и контрольные клеточные культуры по 50 мл 0,25%-й взвеси куриных эритроцитов и эритроцитов морской свинки и инкубируют их при температуре (37±2) °С.
     
     6.3.14. Через 30-35 мин эритроциты из флаконов удаляют, а монослой промывают раствором Хенкса и просматривают под микроскопом при увеличении 70.
     
     

6.4. Учет результатов

     
     6.4.1. Если в клеточных культурах при первичной инокуляции сыворотки и в пассаже не выявлено ЦПД и не отмечено гемадсорбции, сыворотка признается пригодной.
     
     6.4.2. Если при исследовании наблюдается ЦПД или отмечается гемадсорбция в испытуемых клеточных культурах при отсутствии в контроле, сыворотку бракуют.
     
     6.4.3. Если ЦПД или гемадсорбция появились в контрольных и в опытных клеточных культурах, допускается однократный переконтроль сыворотки.
     
     

7. Контроль сыворотки на присутствие микоплазм

7.1. Микробиологический метод контроля сыворотки на присутствие микоплазм

     
     Обнаружение микоплазм микробиологическим методом предусматривает внесение исследуемой сыворотки в бульонную питательную среду, инкубирование в течение 7 сут и последующий высев на питательную среду, содержащую 0,3% агара.
     
     

7.2. Чувствительность микробиологического метода

     
     Микробиологический метод контроля сыворотки позволяет обнаруживать одну и более колоний микоплазм в объеме не более 100 мл сыворотки.
     
     

7.3. Приготовление бульонной среды

     
     7.3.1. Для приготовления 1 л среды к 200 мл триптического гидролизата бычьего сердца (содержание сухих веществ 8-10%) добавляют 400 мл мясного экстракта 1:2 (содержание сухих веществ 3,0-3,5%), экстракт хлебопекарных дрожжей из расчета 1,5 г сухих веществ на 1 л среды и 5,0 г хлорида натрия.
     
     7.3.2. С помощью 10%-го раствора NaOH устанавливают значение рН бульонной среды от 8,0 до 8,2.
     
     7.3.3. Среду нагревают до кипения, кипятят 2-3 мин, фильтруют через складчатый бумажный фильтр.
     
     7.3.4. Разливают по 300-305 мл во флаконы, закрытые ватно-марлевыми или резиновыми пробками и завальцованные алюминиевыми колпачками, и стерилизуют автоклавированием при температуре 110 °С 30 мин. С помощью 5%-го раствора соляной кислоты устанавливают рН от 7,8 до 8,0.
     
     7.3.5. Для приготовления среды, содержащей 0,3% агара, дополнительно вносят 3,0 г агара.
     
     Готовые среды хранят при температуре от 2 до 8 °С не более 4 мес.
     
     

7.4. Стерильность питательной среды

     
     7.4.1. Для испытания на стерильность отбирают не менее 2% от количества емкостей в серии. Определение проводят путем визуального просмотра каждого флакона с питательной средой после выдерживания в течение 44-48 ч при температуре (37±1) °С и 14 сут при температуре 20-25 °С.
     
     7.4.2. В случае пророста хотя бы в одном флаконе бракуют всю серию. Далее питательная среда не используется.
     
     

7.5. Определение ростовых свойств среды, содержащей 0,3% агара

     
     Каждую серию приготовленной среды проверяют на ростовые свойства, используя тест-штамм Mycoplasma arginini G 230 (ОСО 42-28-378-05).
     
     Среду считают чувствительной и признают годной, если результаты ее испытания соответствуют Инструкции по применению ОСО 42-28-378-05.
     
     

7.6. Подготовка сред для контроля

     
     7.6.1. Перед употреблением полужидкую среду, содержащую 0,3% агара, разогревают в водяной бане до полного расплавления агара и охлаждают до температуры 40-45 °С.
     
     7.6.2. Добавляют 15-20% нормальной сыворотки крови лошади без консерванта, предварительно проверенной на стерильность и присутствие микоплазм, и 100 ед/мл бензилпенициллина натриевой соли.
     
     7.6.3. Разливают по 10 мл в бактериологические пробирки и закрывают ватно-марлевыми пробками. Хранят среду при температуре от 2 до 8 °С не более 7 сут.
     
     

7.7. Выполнение контроля сыворотки на присутствие микоплазм
микробиологическим методом

     При выполнении контроля сыворотки микробиологическим методом должны быть выполнены следующие операции:
     
     7.7.1. Вносят (300±2) мл бульонной среды во флакон вместимостью 500 мл. Флакон закрывают ватно-марлевой пробкой.
     
     7.7.2. Вносят (100±2) мл исследуемой сыворотки в (300±2) мл бульонной среды. Смесь инкубируют 7 сут при температуре (37±1) °С и относительной влажности 80-90%.
     
     7.7.3. Отбирают 10 пробирок со средой, содержащей 0,3% агара, и вносят в каждую пробирку по (1,0±0,1) мл смеси исследуемой сыворотки и бульонной среды. Посев проводят прокалыванием всего столбика питательной среды, содержащейся в пробирке, концом пипетки вместимостью 1,0 мл, выпуская равномерно ее содержимое, начиная от дна до поверхности.
     
     7.7.4. Инкубируют посевы 14 сут при температуре (37±1) °С и относительной влажности 80-90%.
     
     

7.8. Учет результатов

     
     7.8.1. Учет результатов проводят путем визуального просмотра засеянных пробирок в проходящем свете на 4, 7, 10, 14 сут.
     
     7.8.2. Сыворотка считается свободной от микоплазм, если через 14 сут не обнаруживают роста микоплазм ни в одной из засеянных пробирок.
     
     7.8.3. В случае получения сомнительных результатов проводят повторный контроль.
     
     7.8.4. При повторном контроле, при наличии роста микоплазм хотя бы в одной пробирке, сыворотка считается контаминированной микоплазмами.
     
     

8. Контроль сыворотки на присутствие микоплазм методом
индикаторной клеточной культуры (цитохимический метод)

     Метод обнаружения микоплазм с использованием индикаторной клеточной культуры Vero основан на внесении испытуемой сыворотки в клеточную культуру и обработку препарата специфическим флюоресцирующим красителем Hoechst-33258, окрашивающим ДНК клеток и микоплазм. Возможно применение другого флюорохрома, аттестованного в ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Клеточную культуру Vero (или другую чувствительную к микоплазмам) получают из банка клеток, аттестованного в соответствии с требованиями ВОЗ в ГИСК им. Л.А.Тарасевича.
     
     

8.1. Подготовка к выполнению контроля на присутствие микоплазм
методом индикаторной клеточной культуры

     
     При подготовке к выполнению контроля сыворотки на присутствие микоплазм методом индикаторной клеточной культуры должны быть выполнены следующие операции: приготовление основного и рабочего раствора красителя Hoechst-33258, подготовка люминесцентного микроскопа, подготовка предметных стекол.
     

8.1.1. Приготовление основного и рабочего раствора Hoechst-33258

     
     Соблюдая стерильность, 5 мг концентрата Hoechst-33258 растворяют в 100 мл стерильной дистиллированной воды (основной раствор).
     
     Для получения рабочего раствора добавляют концентрат красителя в раствор Хенкса без индикатора в соотношении 1:9 и используют для окраски препаратов немедленно.
     

8.1.2. Подготовка люминесцентного микроскопа

     
     Используют для анализа препаратов фильтры: ФС1-4, СС15-2, БС8-2. Просматривают препараты при увеличении ок. 10, об. 90 масляная иммерсия, или об. 70 или об. 85 водная иммерсия.
     

8.1.3. Подготовка предметных стекол

     
     Промывают стекла в проточной водопроводной воде в течение 10-15 мин. Помещают стекла в сосуд с дистиллированной водой и кипятят 5-7 мин. После охлаждения до температуры 20-22 °С извлекают стекла с помощью пинцета и помещают в чашку Петри. Протирают каждое стекло стерильной салфеткой и помещают на 1 сут в смесь Никифорова, состоящую из равных объемов 96° этилового спирта и эфира для наркоза. Извлекают стекла с помощью пинцета из смеси Никифорова и протирают каждое стекло стерильной салфеткой. Стерилизуют стекла (30±2) мин при температуре (120±2) °С.
     
     

8.2. Выполнение контроля сыворотки на присутствие микоплазм
методом индикаторной клеточной культуры

     
     При проведении испытания на присутствие микоплазм методом индикаторной клеточной культуры выполняют следующие операции:
     
     8.2.1. Вносят 1 мл испытуемого материала в чашку Петри диаметром 90 мм, содержащую стерильное предметное стекло и 20-23 мл суспензии клеточной культуры Vero в концентрации 10 кл/мл.
     
     8.2.2. Инкубируют чашку Петри с клеточной культурой Vero в течение 3-5 сут при температуре (37±1) °С в анаэробных условиях до формирования 50-70% монослоя. Образование монослоя наблюдают в световом микроскопе при увеличении ок. 10, об. 20.
     
     8.2.3. Сливают культуральную жидкость, промывают препарат питательной средой или буфером (рН 7,2-7,4).
     
     8.2.4. Помещают предметное стекло на 30-35 мин в 96° этиловый спирт.
     
     Сливают спирт и высушивают препарат на воздухе.
     
     8.2.5. Добавляют рабочий раствор красителя Hoechst-33258 и окрашивают в темноте при температуре (37±1) °С в течение 30-35 мин.
     
     8.2.6. Сливают краситель, промывают препарат стерильной дистиллированной водой, подсушивают на воздухе и микроскопируют.
     
     

8.3. Учет результатов

     
     Учет результатов испытания на присутствие микоплазм методом окрашивания ДНК флюорохромом Hoechst-33258 на индикаторной культуре клеток Vero проводят путем просмотра препаратов в люминесцентном микроскопе.
     
     Микоплазмы выглядят, как однородно окрашенные тела сферической формы, имеющие вид отдельных, парных, цепочечных или нитевидных образований яркого зеленоватого свечения. Диаметр обычно находится в пределах 0,1-0,3 микрона.
     
     Микоплазмы в виде ярко светящейся зернистости на фоне темной цитоплазмы выявляют по периферии клеток и в межклеточном пространстве.
     
     Условно интенсивность контаминации микоплазмами обозначают знаками креста:
     
     1 крест - единичные микоплазмы в препарате;
     
     2 креста - небольшие скопления микоплазм в поле зрения;
     
     3 креста - отдельные микоплазмы и скопления в 20-50% клеток;
     
     4 креста - максимальное количество микоплазм в виде скоплений в межклеточном пространстве в каждом поле зрения.
     
     В качестве положительных контрольных образцов используют заведомо контаминированные микоплазмами клеточные культуры.
     
     Отрицательными контрольными образцами служат клеточные культуры, в которых описанные выше светящиеся образования не выявлены.
     
     Обнаружение микоплазм в препаратах на индикаторной клеточной культуре Vero свидетельствует о контаминации испытуемого материала микоплазмами.
     
     В случае получения сомнительных результатов следует проводить повторный контроль.
     
     Окончательный ответ о присутствии микоплазм в сыворотке будет учитывать результаты двух методов: микробиологического и метода индикаторной клеточной культуры.
     
     В случае обнаружения микоплазм хотя бы одним методом сыворотка считается контаминированной и бракуется.
     
     

Приложение

     
Таблица 1

     
Контроль сыворотки крови крупного рогатого скота на присутствие посторонних вирусов

     
     
Таблица 2

     
Контроль сыворотки крови крупного рогатого скота на присутствие микоплазм