МУК 4.1.1899-04  

     

     Методические указания


4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Атомно-абсорбционное измерение массовых концентраций селена
в эритроцитах и плазме крови

Дата введения: 2004-05-01

     УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 3 марта 2004 г.
     
     

1. Область применения

     
     Методические указания устанавливают количественный атомно-абсорбционный анализ плазмы (сыворотки) и эритроцитов крови на содержание селена в диапазоне концентраций 0,001-0,02 мкг/см.
     
     

2. Характеристика определяемого элемента

     
     Молекулярная масса - 78,96
     
     Регистрационный номер CAS: 7782-49-2
     
     Селен - темно-серый, с коричневым оттенком порошок,  221 °С,  685,3 °С, плотность 4,79.
     
     При обычной температуре селен устойчив к действию воздуха, кислорода, воды, концентрированной соляной и разбавленной серной кислот, хорошо растворяется в концентрированной азотной кислоте. С фтором, хлором, бромом селен на холоде образует галогениды, с водородом взаимодействует при температуре 350-400 °С, образуя селеноводород. При сжигании на воздухе или в кислороде образуется оксид селена (SeO), последний при растворении в воде дает селенистую кислоту.
     

Токсикологическая характеристика определяемого элемента

     
     Селен обладает двойственными свойствами, с одной стороны, необходим для жизни, с другой - является токсичным элементом. Селен выполняет роль катализатора ряда ферментативных реакций, участвует в реакции окислительно-восстановительных процессов, является стабилизатором плазматических ядерных и внутриклеточных мембран, обладает антиокислительными свойствами и в некоторых биохимических реакциях заменяет витамин Е.
     
     Механизм токсического действия селена связан с замещением серы в биохимически активных веществах в процессе метаболизма, селен входит в активный центр глютатионпероксидазы. По характеру действия соединения селена несколько напоминают соединения мышьяка, обладают политропным действием. В ряде случаев его воздействие вызывает изменение ткани зубов, заболевания ногтей, желудочно-кишечные нарушения, нервные расстройства. Химическая форма селена может изменяться после контакта с влажными слизистыми оболочками, с потом. Соединения селена более токсичны, чем элементарный селен. Диапазон физиологически оптимальных концентраций селена узок, при уровне ниже минимального предела отмечается увеличение риска возникновения и развития кардиологических и ряда онкологических заболеваний, ослабление антиоксидантной защиты организма. Изменения содержания селена происходят раньше в плазме (сыворотке), чем в эритроцитах.
     
     Нормальной концентрацией селена в плазме (сыворотке) крови считается диапазон от 0,053 до 0,105 мкг/см.
     
     

3. Погрешность измерений

     
     Методика обеспечивает выполнение измерений массовой концентрации селена с погрешностью, не превышающей ±28%, при доверительной вероятности 0,95.
     
     

4. Метод измерений

     
     Метод основан на минерализации проб плазмы и эритроцитов крови концентрированной азотной кислотой и пероксидом водорода, получении летучего гидрида селена, его термическом разложении и последующем измерении резонансного поглощения линии селена на атомно-абсорбционном спектрометре.
     
     Нижний предел измерения концентрации селена в минерализате 0,001 мкг/см.
     
     

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы

     
5.1. Средства измерения, вспомогательные устройства и материалы

     
     5.1.1. Атомно-абсорбционный спектрометр КВАНТ-2А, ГКНЖ 30.00.000, ТУ 4434-030-29903757-99, оснащенный гидридной приставкой ГРГ-107, ГКНЖ 46.00.000 ТУ 4434-030-29903757-99 и источником излучения для определения селена (лампой полого катода).
     
     5.1.2. Весы лабораторные ВЛР-200, ГОСТ 24104-88Е.
     
     5.1.3. Колбы мерные 2-25-2; 2-50-2; 2-100-2; 2-200-2; 2-250-2, ГОСТ 1770-74Е.
     
     5.1.4. Пипетки мерные 4(5)-1-1; 4(5)-1-2; 4(5)-1-5; 4(5)-1-10; 4(5)-1-20, ГОСТ 29227-91.
     
     5.1.5. Пробирки мерные, вместимостью 10 см, ГОСТ 25336-82Е
     
     5.1.6. Стаканы Н-1-10 ТХС, Н-1-25; Н-1-100, ГОСТ 25336-82Е
     
     5.1.7. Колба коническая, вместимостью 100 см, ГОСТ 25366-82Е.
     
     5.1.8. Термометр лабораторный шкальный ТЛ-2; пределы 0-200 °С, цена деления 0,1 °С, ГОСТ 215-73Е.
     
     5.1.9. Электроплитка бытовая, ГОСТ 14919-83.
     
     5.1.10. Аналитический реактор для минерализации проб РМП-25, изготовленный НПО "Метрология" г.Казань (аналитический автоклав), МУК 4.1.985-00.
     
     5.1.11. Термостат с автоматической регулировкой температуры до 200 °С.
     
     5.1.12. Ацетилен технический, в баллонах, ГОСТ 5457-75.
     
     5.1.13. Аргон газообразный в баллонах, ТУ 21-12-79.
     
     5.1.14. Часовое стекло.
     
     5.1.15. Центрифуга лабораторная клиническая Опн-3, ТУ 5375-4260-76.
     

5.2. Реактивы

     
     5.2.1. Вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72 или бидистиллированная.
     
     5.2.2. Натрия гидроксид, ГОСТ 4328-77.
     
     5.2.3. Боргидрид натрия (тетрагидроборат натрия), ТУ 1-92-162-90.
     
     5.2.4. Пероксид водорода ос.ч., ГОСТ 10929-76.
     
     5.2.5. Стандартный образец состава раствора ионов селена с массовой концентрацией селена 1,0 мг/см; ГСО 7779-2000.
     
     5.2.6. Кислота азотная ос.ч., ГОСТ 11125-73.
     
     5.2.7. Кислота соляная ос.ч., ГОСТ 14261-77.
     
     5.2.8. Гепарин для инъекций, N сертификата соответствия 50-20-70546 от 29.07.02.
     
     5.2.9. Натрия хлорид, ГОСТ 4233-77.
     
     5.2.10. Мочевина, ГОСТ 6691.
     
     Допускается использование других средств измерений, вспомогательного оборудования, материалов и реактивов с техническими и метрологическими характеристиками и квалификацией не хуже приведенных в разделе.
     
     

6. Требования безопасности

     
     6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88.
     
     6.2. При выполнении измерений с использованием атомно-абсорбционного спектрометра соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.
     
     6.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением, необходимо соблюдать "Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением" (ПБ-10-115-96), утвержденные постановлением Госгортехнадзора России 18.04.95 N 20 и ГОСТ 12.2.085.
     
     6.4. Реакционный блок ГРГ-107 предохраняют от ударов и резких толчков, не допускают перекосов сосудов в генераторе.
     
     Неиспользованные растворы боргидрида натрия перед утилизацией дезактивируют в вытяжном шкафу избыточным объемом 10%-ного раствора азотной кислоты в толстостенном сосуде объемом 500 см.
     
     

7. Требования к квалификации оператора

     
     К выполнению измерений и обработке результатов допускают лиц с высшим или среднеспециальным образованием, имеющих опыт работы в химической лаборатории, овладевших персональным компьютером и программным обеспечением на уровне пользователя, техникой эксплуатации пламенно-абсорбционного спектрометра типа "Квант", генератора ртутно-гидридного ГРГ-107.
     
     

8. Условия измерений

     
     8.1. Приготовление растворов и подготовку проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20±5 ) °С, атмосферном давлении 84-106 кПа и относительной влажности воздуха не более 80%.
     
     

9. Подготовка к выполнению измерений

     
9.1. Отбор, подготовка и хранение проб

     
     Кровь берут из вены в количестве 5 см. В пробирку с кровью вносят 0,1 см гепарина, перемешивают, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Отделяют плазму от эритроцитов. Эритроциты отмывают дважды физиологическим раствором.
     
     Плазму и эритроциты минерализуют отдельно в аналитических автоклавах по следующей схеме: 1 см плазмы и эритроцитов помещают в тефлоновые стаканчики автоклава, добавляют по 1,5 см концентрированной азотной кислоты, через 15-20 мин добавляют 1 см 36%-ного пероксида водорода, закрывают крышкой, герметизируют в металлическом корпусе. Автоклав помещают в термостат, выдерживают при Т - 190 °С 60 мин, вынимают, охлаждают. В тефлоновый стаканчик добавляют 1,5 см концентрированной соляной кислоты и нагревают при температуре 95 °С в течение 30 мин, охлаждают и добавляют 0,2 см 10%-ного раствора мочевины. Для получения "холостой" пробы в тефлоновый стакан помещают 1 см бидистиллированной воды, 1 каплю гепарина, 1,5 см азотной кислоты, 1 см 36%-ного пероксида водорода и поступают как описано выше. Объем полученного минерализата плазмы, эритроцитов, холостой пробы доводят 6 М раствором соляной кислоты до 10 см. Пробы готовы к измерению. При невозможности немедленного анализа минерализаты хранят в холодильнике. Срок хранения 1 месяц.
     

9.2. Приготовление растворов

     
     9.2.1. Раствор соляной кислоты молярной концентрации 6 моль/дм.
     
     486 см соляной кислоты 1,19 г/см помещают в мерную колбу, вместимостью 1 дм, доводят объем до метки дистиллированной водой.
     
     9.2.2. Стандартный раствор N 1 с массовой концентрацией селена 50 мкг/см. Готовят из стандартного раствора ионов селена с массовой концентрацией 1,0 мг/см. Вскрывают ампулу, содержимое выливают в сухую пробирку, отмеряют пипеткой 5 см, переносят его в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят до метки 6 М раствором соляной кислоты. Срок хранения 3 месяца.
     
     9.2.3. Стандартный раствор N 2 с массовой концентрацией 0,5 мкг/см. Готовят из раствора N 1. Отбирают 1 см в коническую колбу, вместимостью 100 см, добавляют 50 см 6 М раствора соляной кислоты, нагревают на плитке в течение 20-30 минут, не допуская сильного кипения, переносят полученный раствор в мерную колбу вместимостью 100 см. Коническую колбу из-под раствора несколько раз промывают 6 М раствором соляной кислоты, сливая в мерную колбу. Полученный раствор доводят до метки 6 М раствором соляной кислоты. Срок хранения 1 месяц.
     
     9.2.4. Стандартный раствор N 3 с массовой концентрацией селена 0,020 мкг/см. Готовят из раствора N 2. Пипеткой переносят 4 см в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят до метки 6 М раствором соляной кислоты. Срок хранения 1 день.
     
     9.2.5. Стандартный раствор N 4 с массовой концентрацией селена 0,010 мкг/см. Готовят из раствора N 2. Отбирают пипеткой 2 см в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят до метки 6 М раствором соляной кислоты. Срок хранения 1 день.
     
     9.2.6. Стандартный раствор N 5 с массовой концентрацией 0,005 мкг/см. Готовят из раствора N 2. 1 см раствора селена с концентрацией 0,5 мкг/см переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят до метки 6 М раствором соляной кислоты. Срок хранения 1 день.
     
     9.2.7. Стандартный раствор N 6 с массовой концентрацией селена 0,002 мкг/см. Готовят из раствора N 3 с массовой концентрацией селена 0,020 мкг/см. Отбирают пипеткой 10 см в мерную колбу вместимостью 100 см, доводят 6 М раствором соляной кислоты до метки.
     
     9.2.8. Стандартный раствор N 7 с массовой концентрацией 0,001 мкг/см. Готовят из раствора N 4 с массовой концентрацией селена 0,010 мкг/см. Отбирают 10 см в мерную колбу на 100 см и доводят до метки 6 М раствором соляной кислоты.
     
     9.2.9. Раствор гидроксида натрия с массовой долей - 1%. Готовят растворением 1 г гидроксида натрия в 99 см бидистиллированной воды.
     
     9.2.10. Раствор боргидрида натрия с массовой долей 1,5%. 1,5 г боргидрида натрия растворяют в 98,5 99* см 1%-ного раствора гидроксида натрия. Раствор выдерживают не менее одного часа под часовым стеклом, переливают в полиэтиленовую банку с крышкой. Срок хранения 1-2 недели.
________________
     * Текст соответствует оригиналу. - Примечание .
     
     9.2.11. Раствор натрия хлорида с массовой концентрацией 0,9% (физиологический раствор). Готовят растворением 0,9 г натрия хлорида в 99,1 99* см бидистиллированной воды.
________________
     * Текст соответствует оригиналу. - Примечание .
     

9.3. Подготовка к работе спектрометра и гидридной приставки ГРГ-107

     
     - Установить при выключенном приборе спектральную лампу на селен.
     
     - Открыть вентиль воздушной магистрали.
     
     - Открыть вентиль на баллоне с горючим газом.
     
     - Установить с помощью редукторов необходимое давление для ацетилена 0,12-0,18 МПа (1,2-1,8 атм.); для аргона и воздуха 3-4 атм.
     
     - Подготовить к работе ртутно-гидридную приставку в соответствии с руководством по эксплуатации ГКНЖ 46.00.000 РЭ, генератор ртутно-гидридный ГРГ-107.
     
     - Включить компьютер и произвести запуск компьютерной программы.
     
     - Включить кнопку "Сеть" и нажать кнопку "Сброс" на передней панели спектрометра.
     
     - С помощью компьютерной программы загрузить выбранную методику на селен. Программа автоматически установит значения параметров прибора (токов спектральных ламп, напряжение питания ФЭУ).
     
     - После выхода в графический экран добиться максимального значения интенсивности в канале лампы полого катода селена (за счет уточнения длины волны, юстировки спектральных ламп).
     
     - Оставаясь в графическом экране, произвести, в случае необходимости, корректировку считанных из методики значений токов спектральных ламп и напряжения питания ФЭУ.
     
     - После корректировки значения сигналов в каналах лампы полого катода и дейтериевой лампы должны быть близки к 100.
     
     - Подать команду на зажигание пламени "поджечь".
     
     - Промыть горелку, при горящем пламени опустить капилляр в промывочный раствор (6 М раствор соляной кислоты) на 1 мин.
     
     Рабочие параметры, устанавливаемые на спектрометре и условия определения селена для ртутно-гидридного генератора, диапазон определяемых концентраций представлены в табл.1.
     
     

Таблица 1

     
Рабочие параметры спектрометра и условия определения селена

     
     
9.4. Установление и контроль градуировочной характеристики

     
     Градуировочную характеристику, выражающую зависимость величины абсорбции от массовой концентрации селена (мкг/см) устанавливают путем измерения величины абсорбции стандартных растворов, приготовленных согласно табл.2.
     
     

Таблица 2

     
Установление градуировочной характеристики при определении селена

     
     
     Замеряют величину абсорбции указанных градуировочных растворов и холостой пробы по алгоритму программы спектрометра.
     
     В реакционный сосуд "Р" помещают с помощью пипетки 10 см градуировочного раствора или холостой пробы, устанавливают сосуд в реакционный блок, проводят измерение.
     
     Проводят по пять параллельных измерений со всеми пятью указанными градуировочными растворами.
     
     Программа компьютера строит по средним значениям результатов измерений абсорбции градуировочный график.
     
     Перед каждым началом работы, а также в процессе работы через 10-15 измерений уточняют вызванную из памяти компьютера градуировку по одному или двум растворам.
     
     

10. Выполнение измерений

     
     При проведении измерений концентраций селена в пробах выполняют следующие операции:
     
     - Заполняют сосуд для раствора реагента - раствором боргидрида натрия, объемом не более 40 см.
     
     - В реакционный сосуд вносят дозированный объем подготовленной пробы (10 см).
     
     - Оба сосуда устанавливают в соответствующий блок генератора "ГРГ-107".
     
     - Подают с помощью компьютера команду "измерение".
     
     - Выполняют измерения "холостой" пробы.
     
     При замерах концентраций селена в пробах свыше 0,02 мкг/см пробы разбавляют.
     
     

11. Вычисление результатов измерений

     
     Массовую концентрацию селена в мкг/см в эритроцитах и плазме (сыворотке) крови вычисляют по формуле:
     

 мкг/см, где

     
      - массовая концентрация селена в анализируемой пробе в мкг/см;
     
      и  - концентрация селена в анализируемом растворе (после минерализации) и "холостой пробы", мкг/см.     
     
  

12. Оформление результатов измерений

     
     Результат количественного анализа представляют в виде ± мкг/см, Р=0,90, =0,283·.
     
     

13. Контроль погрешности измерений

     
Таблица 3

     
Результаты метрологической аттестации методики КХА

     
     
13.1. Оперативный контроль воспроизводимости

     
     Образцами для контроля могут быть пробы плазмы и эритроцитов крови.
     
     Объем отобранной для контроля пробы должен соответствовать удвоенному объему, необходимому для проведения анализа по методике. Минерализат, полученный после обработки пробы делят на две равные части и анализируют в точном соответствии с прописью методики, варьируя условия проведения анализа, т.е. получают два результата в разных лабораториях или в одной, используя при этом разные наборы мерной посуды, разные партии реактивов. Два результата анализа не должны отличаться друг от друга на величину допускаемых расхождений между результатами анализа.
     

, где

     
      - результат анализа рабочей пробы;
     
      - результат анализа этой же пробы, полученный другим аналитиком с использованием другого набора мерной посуды и других партий реактивов;
     
      - допускаемые расхождения между результатами анализа одной и той же пробы.
     
     Норматив воспроизводимости вычисляют по формуле:
     
     , где
     
     2,77, при 2, Р=0,95
     
      - показатель воспроизводимости (характеристика случайной составляющей погрешности, соответствующая содержанию компонента в пробе).
     
     2,77(0,00021+0,0124С); 0,00058+0,034С
     
     При превышении норматива оперативного контроля воспроизводимости эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива  выявляют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля и устраняют их.
     

13.2. Оперативный контроль погрешности

     
     Оперативный контроль погрешности выполняют в одной серии с КХА рабочих проб. Образцами для контроля являются пробы плазмы и эритроцитов. Минерализат, полученный после обработки делят на две равные части, первую из которых анализируют в точном соответствии с прописью методики, получают результат анализа исходной рабочей пробы - , вторую разбавляют в два раза и снова делят на две равные части, первую из которых анализируют в точном соответствии с прописью методики, получая результат анализа рабочей пробы, разбавленной в два раза - , а во вторую часть делают добавку анализируемого компонента () и анализируют в точном соответствии с прописью методики, получая результат анализа рабочей пробы, разбавленной в два раза с добавкой - .
     
     Решение об удовлетворительной погрешности принимают при выполнении условия:
     
     , где
     
      - результат анализа рабочей пробы;
     
      - результат анализа рабочей пробы, разбавленной в два раза;
     
      - результат анализа рабочей пробы, разбавленной в два раза, с добавкой анализируемого компонента;
     
      - величина добавки анализируемого компонента;
     
      - норматив оперативного контроля погрешности.
     

     
     
14. Нормы затрат времени на анализ

     
     Для проведения анализа одной пробы на содержание селена требуется 4 ч.
     
     
     
Текст  документа сверен по:
официальное издание
Определение химических соединений
в биологических средах: Методические указания
МУК 4.1.1896-4.1.1900-04. -
М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора
Минздрава России, 2004