МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОМУ ИЗМЕРЕНИЮ СОДЕРЖАНИЯ
ФОСФАМИДА НА КОЖЕ

     
     
     УТВЕРЖДЕНЫ заместителем Главного государственного санитарного врача СССР В.И.Чибураевым 28 сентября 1989 г. N 5137-89
     
     

     0,0-Диметил-S-(N-метилкарбамоилметил)дитиофосфат.
     
     Товарное название: фосфамид, диметоат, рогор, БИ-58.
     
     Химически чистый фосфамид - белое кристаллическое вещество с Т.пл. 49,9-50,9 °С. Давление насыщенных паров при 20 °С 8,5·10 мм рт.ст. (1,2·10 Па), хорошо растворим в воде - 3,9%, в ацетоне, хлороформе, метаноле, плохо в алкановых углеводородах. При нагревании изомеризуется. Достаточно быстро гидролизуется в щелочной среде, более устойчив в кислой.
     
     

1. Характеристика методики

     
     Методика основана на экстракции фосфамида из пробы органическим растворителем, очистке и последующем определении методами газожидкостной или тонкослойной хроматографии.
     
     В качестве смывающей жидкости используется дистиллированная вода.
     
     Диапазон измеряемого содержания - 0,008-0,4 мг/см.
     
     Определению не мешают диазинон, циклоат, эптам, метоксихлор, линдан.
     
     Граница суммарной погрешности не превышает ±20%.
     
     ПДУ фосфамида на коже 0,02 мг/см.
     
     

2. Реактивы и растворы

     
     Фосфамид, х.ч.
     
     Стандартный раствор N 1 с содержанием 1 мг/мл готовят растворением 100 мг фосфамида в мерной колбе на 100 мл. Соответствующим разведением в гексане готовят стандартный раствор N 2 с содержанием фосфамида 0,1 мг/мл. Растворы устойчивы 1 месяц.
     
     Азот, водород в баллонах с редукторами.
     
     Азот ОСЧ, ГОСТ 9293-74, содержание кислорода не более 0,003% (для работы на ЭЗД или ДПР).
     
     Насадка хроматографической колонки:
     
     Для ТИД хроматон N-AW-DMCS с 5% SE-30, для ЭЗД (или ДПР) хроматон N-AW-DMCS с 5% ХЕ-60, зернение носителей 0,16-0,2 мм.
     
     Ацетон, х.ч., ГОСТ 2603-79.
     
     Гексан, ч., ТУ 6-09-3375-78.
     
     Хлороформ, х.ч., ТУ 6-09-4263-76.
     
     Лимонная кислота, х.ч., ГОСТ 3652-69, 2%-ный раствор.
     
     Соляная кислота, х.ч., ГОСТ 3118-77, 0,1 н раствор.
     
     Бромфеноловый синий, ч.д.а., ТУ 6-09-1058-76.
     
     Гидроксид натрия, х.ч., ГОСТ 4328-77, 20%-ный раствор.
     
     Натрий сернокислый безводный, ч.д.а., ГОСТ 4166-76.
     
     Серебро азотнокислое, х.ч., ГОСТ 1277-75, 0,5%-ный водноацетоновый раствор (1 часть воды + 3 части ацетона).
     
     Хлористый палладий, ч., МРТУ 6-09-1964-72.
     
     Проявляющие реагенты:
     
     ПР N 1 - бромфеноловый синий. Взвешивают 50 мг бромфенолового синего, растворяют в 10 мл ацетона и затем разбавляют до 100 мл раствором азотнокислого серебра. Срок хранения в холодильнике до 1 месяца.
     
     ПР N 2 - хлористый палладий. Взвешивают 0,2 г хлористого паладия, вносят в колбочку вместимостью 100 мл, приливают 2 капли концентрированной соляной кислоты, помещают колбу в водяную баню при 60-70 °С на 10-15 мин. Периодически встряхивают до полного растворения содержимого колбы. Доводят объем раствора до 100 мл водой. Срок хранения в холодильнике до 1 месяца.
     
     ПР N 3 - 2,6-дибром-N-хлорхинонимин, х.ч., 0,5%-ный раствор в гексане.
     
     ПР N 4 - азотнокислое серебро. Взвешивают 1 г азотнокислого серебра и растворяют в 99 мл воды. Опрыскивают пластинки после гидролиза 20%-ным раствором гидроксида натрия. Хранят реактив в холодильнике до 2 недель.
     
     Подвижная фаза: хлороформ-ацетон-гексан (3:1:1), гексан-ацетон (3:2) и хлороформ.
     

     Натрий хлористый, х.ч., ГОСТ 4233-77, 10%-ный раствор.
     
     Вата гигроскопическая, обезжиренная кипячением в дистиллированной воде в течение 30 мин и высушенная.
     
     Алюминия оксид, II степени активности для хроматографии, ТУ 6-09-3916-75.
     
     Кальций сернокислый безводный, ч.д.а., ГОСТ 3210-74.
     
     Хроматографические пластинки "Силуфол", 15х15 см.
     
     

3. Приборы и посуда

     
     Газовый хроматограф с термоионным (ТИД) или электроннозахватным (ЭЗД) (или детектором постоянной скорости рекомбинации (ДПР)) детектором.
     
     Ротационный вакуумный испаритель ИР-IМ с набором колб, ТУ 2811-917-74, или аналогичный аппарат для отгонки растворителей.
     
     Аппарат для встряхивания.
     
     Термостат.
     
     Колбы мерные, цилиндры, ГОСТ 1770-74.
     
     Пипетки, микропипетки, ГОСТ 20292-74*.
_______________
     * Действуют ГОСТ 29169-91, ГОСТ 29227-91-ГОСТ 29229-91, ГОСТ 29251-91-ГОСТ 29253-91. - Примечание изготовителя базы данных.     

     
     Склянки химические вместимостью 50-100 мл, ГОСТ 13394-72.
     
     Воронки химические, ГОСТ 8613-75.
     
     Воронки делительные, ГОСТ 8613-75.
     
     Колбы грушевидные (для отгонки растворителей), ГОСТ 10394-72.
     
     Хроматографическая камера, ГОСТ 10565-75.
     
     Камера для опрыскивания пластинок, ГОСТ 10565-75.
     
     Пульверизатор стеклянный, ГОСТ 10391-74.
     
     Баня водяная, ТУ 64-12350-76.
     
     Стеклянные капилляры для нанесения проб на хроматографические пластинки.
     
     Стеклянные пластинки, размер 9х12 или 12х15 см.
     
     Микрошприц МШ-10.
     
     Колонки стеклянные хроматографические длиной 1 м и внутренним диаметром 3 мм.
     
     Секундомер.
     
     Лупа измерительная.
     
     

4. Проведение измерения  

Условия проведения смыва

     
     Смыв с кожных покровов (5х5) см проводят способом обмыва. Для этого в фарфоровую чашку наливают 20 мл воды. Ватным тампоном 0,3 г, смоченным в воде, обмывают участок поверхности кожи (5х5) см сверху вниз. При этом тампон несколько раз опускают в чашку с водой. Одновременно проводят смыв с кожи у рабочих, не контактирующих с фосфамидом.
     

Условия анализа

     
     Ватный тампон тщательно отжимают стеклянной палочкой, переносят на воронку с фильтром и промывают дважды по 20 мл дистиллированной водой. Растворы объединяют, фильтруют, подкисляют 0,1 н раствором HCI до рН 4-5, раствор перемешивают, приливают 30 мл 10% раствора хлористого натрия и дважды экстрагируют в делительной воронке 20 мл хлороформа в течение 30-40 мин. Хлороформ отделяют. Хлороформные экстракты объединяют, пропускают через безводный сернокислый натрий, фильтруют. Отгоняют растворитель примерно до 0,2-0,5 мл. Остаток испаряют при комнатной температуре досуха. К сухому остатку приливают 1 мл гексана.
     

Газохроматографический анализ

     
     Определение фосфамида проводят с использованием термоионного детектора или детектора постоянной скорости рекомбинации. В случае применения термоионного детектора стеклянную хроматографическую колонку заполняют хроматоном N-AW-DMCS с 5% жидкой фазы SE-30. При анализе фосфамида с использованием детектора постоянной скорости рекомбинации применяют хроматон N-AW-DMCS с 5% ХЕ-60.
     
     Кондиционирование колонки проводят в течение 12 часов при температуре термостата 200 °С при отключенном детекторе.
     
     Для анализа берут 1-2 мкл пробы. Для количественного определения используют метод абсолютной калибровки. Для этого готовят градуировочные растворы с содержанием 0,2 мкг/мл, 0,4 мкг/мл, 0,8 мкг/мл, 2 мкг/мл, 10 мкг/мл фосфамида соответствующим разведением стандартного раствора N 2. Срок хранения градуировочных растворов 2 дня.
     
     На основании полученных данных строят градуировочный график зависимости площади пика от заданной концентрации. Площадь пика измеряют умножением высоты на ширину, измеренную на половине высоты, полученной из пяти параллельных определений.
     

Условия калибровки и анализа должны быть идентичны.

     
Анализ методом тонкослойной хроматографии

     
     Готовят хроматографические пластинки с оксидом алюминия. Взвешивают 50 г оксида алюминия, просеянного через сито 100 меш., прибавляют 5 г безводного сернокислого кальция и 75 мл воды. Встряхивают в колбе до образования однородной массы. Наливают тонким слоем на 10 стеклянных пластинок размером (9х12) см или 8 пластинок (12х15) см. Сушат на воздухе около 10-12 ч. Хранят в эксикаторе. 0,1 мл анализируемой пробы наносят на хроматографическую пластинку на линию старта. Из стандартного раствора N 2 готовят градуировочные растворы с содержанием фосфамида 5 мкг/мл, 10 мкг/мл, 20 мкг/мл, 40 мкг/мл, 80 мкг/мл, 100 мкг/мл. Слева и справа от пробы наносят 0,1 мл градуировочных растворов, что соответствует содержанию 0,5 мкг, 1 мкг, 2 мкг, 4 мкг, 8 мкг, 10 мкг фосфамида. Диаметр пятна не должен превышать 5 мм. Пластинку помешают в хроматографическую камеру, куда предварительно за 15-20 мин наливают одну из подвижных фаз хлороформ-ацетон-гексан (3:1:1), гексан-ацетон (3:2), хлороформ. После поднятия фронта растворителя на высоту 10-12 см пластинку извлекают из камеры, оставляют до улетучивания растворителей, а затем применяют один из проявляющих реагентов.
     
     Если хроматографирование проводят на пластинках "Силуфол", то используют проявляющие реагенты NN 1 или 2; или 3. После опрыскивания пластинки ПР N 1, через 15-20 мин опрыскивают 2% раствором лимонной кислоты. Фосфамид и его метаболит 0 аналог окрашиваются в синий цвет на светло-желтом фоне пластинки. Если применяют ПР N 2, то сразу же после опрыскивания фосфамид окрашивается в светло-коричневый цвет (иногда с желтоватой серединой). После опрыскивания ПР N 3 пластинку следует поместить в сушильный шкаф при 110-115 °С на 2-3 мин. На светлом фоне пластинки зона локализации фосфамида окрашивается в ярко-красный цвет, а 0 аналога - в рябиново-желтый. Величина  фосфамида - 0,55-0,6,  0 аналога - 0,2-0,25.
     
     Если хроматографирование проводили на пластинках с оксидом алюминия в подвижной фазе - хлороформ, то используют проявляющий реагент - ПР N 4. После улетучивания следов хлороформа пластинку опрыскивают 20%-ным раствором гидроксида натрия, а после подсушивания слоя - ПР N 4. Помещают в сушильный шкаф при 105-110 °С на 5 минут. Зона локализации фосфамида и некоторых его метаболитов окрашивается в серо-черный цвет. Величина  фосфамида = 0,4, карбметоксиметилдитиофосфата = 0,5, диметилдитиофосфорной кислоты = 0,3,  0 аналога = 0,15-0,2.
     
     Для количественной оценки с помощью промасленной миллиметровой бумаги измеряют размеры и вычисляют площадь пятна фосфамида на хроматограмме пробы и стандарта, наиболее близкого по размерам к пятну пробы.
     

Расчет концентрации

     
     Концентрацию фосфамида в мг/см рассчитывают по формуле:
     

,

     
где  - количество фосфамида во всей пробе, мг;

     
      - площадь исследуемой части тела, см.