1. Общие положения и область применения

    
    
    1.1. Настоящие методические указания устанавливают основные принципы организации контроля и методику проведения лабораторных исследований пищевых продуктов по выявлению в них бактерий Listeria monocytogenes.
    
    При контроле пищевых продуктов на загрязненность патогенными микроорганизмами в СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования к безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов" предусматривается новый микробиологический показатель "Listeria monocytogenes - не допускаются" в 25 г продуктов массового назначения и в 50-100 г для продуктов детского и специализированного питания.
    
    Проведение контроля на Listeria monocytogenes позволит получить реальную картину ситуации в Российской Федерации, оценить степень загрязненности пищевой продукции и дать оценку эффективности принимаемых мер в целях обеспечения ее безопасности в плане новых и вновь возникающих возбудителей инфекций с пищевым путем передачи для здоровья и жизни человека.
    
    1.2. Методические указания предназначены для применения в лабораториях учреждений государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации, осуществляющих контроль за качеством продовольственного сырья и пищевых продуктов, в т.ч. импортируемых в Российскую Федерацию, гигиеническую оценку и выдачу санитарно-эпидемиологических заключений, а также бактериологическую диагностику заболеваний с пищевым путем передачи; в лабораториях других организаций, аккредитованных в установленном порядке на право проведения контроля безопасности пищевой продукции и продовольственного сырья; в организациях, независимо от форм собственности, осуществляющих производственный контроль продовольственного сырья и пищевых продуктов в процессе промышленного производства и выпуска продукции.
    
    1.3. Методические указания являются обязательными при контроле пищевых продуктов в ходе проведения противоэпидемических мероприятий при возникновении вспышек, а также в порядке осуществления санитарно-эпидемиологического надзора.
    
    1.4. Организация проведения контроля пищевых продуктов на Listeria monocytogenes.
    
    Лабораторный контроль за отсутствием Listeria monocytogenes в пищевых продуктах, где нормируется этот показатель, проводится:
    
    - в порядке надзора за соблюдением установленных требований в области обеспечения качества и безопасности пищевых продуктов в ходе проверок изготовления и оборота пищевой продукции, оказания услуг в сфере торговли и общественного питания;
    
    - при экспертизе продукции и подтверждении соответствия требованиям нормативных документов для целей гигиенической оценки и выдачи санитарно-эпидемиологических заключений;
    
    - при контроле за безопасностью продукции изготовителем (производственный контроль);
    
    - в ходе проведения противоэпидемических мероприятий и при эпидрасследовании заболеваний.
    
    1.5. При проведении контроля безопасности по показателю Listeria monocytogenes согласно Положению о государственной санитарно-эпидемиологической службе, утвержденному постановлением Правительства Российской Федерации от 24 июля 2000 г. N 554, должен осуществляться периодический отбор образцов пищевой продукции.
    
    1.5.1. Порядок контроля и кратность исследований должны устанавливаться в соответствии с методическими и инструктивными документами, утвержденными или согласованными в установленном порядке органами государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации, при этом необходимо учитывать специфику производства, степень его эпидзначимости, материально-техническое оснащение и т.п.
    
    Особого внимания должны заслуживать предприятия, вырабатывающие продукты детского питания, детские молочные кухни, пищеблоки детских лечебно-профилактических учреждений, стационаров для онкологических, гематологических больных, домов ребенка, родильных домов, домов престарелых и инвалидов и т.п.
    
    При проведении текущего надзора рекомендуемая минимальная периодичность выборочного лабораторного контроля пищевой продукции массового потребления - 1 раз в квартал; для детского и диетического питания - 2 раза.
    
    1.5.2. При производственном контроле организация и периодичность лабораторных исследований продукции по показателю Listeria monocytogenes должна устанавливаться изготовителем продукции в соответствии с действующими санитарными правилами и согласовываться с учреждениями государственной санитарно-эпидемиологической службы по месту расположения предприятия-изготовителя.
    
    1.5.3. Контроль пищевых продуктов по показателю Listeria monocytogenes с целью гигиенической оценки для выдачи санитарно-эпидемиологических заключений и подтверждения соответствия установленным требованиям при проведении экспертизы осуществляется в уполномоченных лабораториях центров госсанэпиднадзора или других организаций, аккредитованных в установленном порядке.
    
    1.6. В пищевых продуктах, предназначенных для непосредственного употребления в пищу, в отношении которых отсутствуют микробиологические нормативы или данные о возможности выделения Listeria monocytogenes, контроль Listeria monocytogenes не проводится, однако в случае заболеваний людей и/или нарушений в области обеспечения качества и безопасности пищевых продуктов образцы таких продуктов должны быть направлены на лабораторное исследование.
    
    1.7. Организация лабораторных исследований на Listeria monocytogenes.
    
    Допускается организация лабораторных исследований путем их поэтапного выполнения в лабораториях учреждений госсанэпидслужбы различных уровней. При отсутствии возможности идентификации выделенных культур последние могут быть переданы в лаборатории, располагающие соответствующей материально-технической базой и квалифицированным персоналом, для выдачи окончательного результата.
    
    

2. Сущность метода

    
    
    Методические указания содержат описание метода выявления бактерий Listeria monocytogenes, основанного на высеве определенного количества продукта в жидкие селективные среды, инкубировании посевов, выявлении в этих посевах бактерий, способных расти и образовывать типичные колонии на агаризованных дифференциально-диагностических средах. Принадлежность выделенных культур к Listeria monocytogenes определяется по биохимическим, морфологическим и другим свойствам.
    
    Метод выявления L. monocytogenes в пищевых продуктах основан на применении специальных селективных и дифференциально-диагностических сред. Селективность сред по отношению к сопутствующей микрофлоре обеспечивается включением в их состав хлорида лития, акрифлавина, циклогексимида, налидиксиновой кислоты, полимиксина или других антибиотиков. Внесение эскулина и цитрата аммония железа позволяет подтверждать наличие листерий по почернению среды за счет гидролиза эскулина в присутствии ионов Fe+. Подтверждающие тесты родовой и видовой идентификации включают окраску по Граму, определение подвижности выделенных на агаризованных средах типичных по физиологическим и морфологическим признакам культур, их способности восстанавливать нитраты до нитритов, сбраживать рамнозу, ксилозу и маннит, способности к гидролизу лецитина на ГРМ-среде с активированным углем, а также определение наличия В-гемолиза на кровяном агаре и дифференциацию L. monocytogenes от других гемолизирующих листерий в САМР-тесте с контрольными штаммами Staphylococcus aureus и Rhodococcus equi.
    
    При необходимости для выявления L. monocytogenes в пищевых продуктах проводится постановка реакции нарастания титра фага (РНФ).
    
    Предлагаемый метод обнаружения L. monocytogenes, гармонизированный с Международным стандартом ISO 11290-111996, предусматривает определение наличия или отсутствия L. monocytogenes в нормируемой массе продукта в соответствии с нормативами СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования к безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов", выраженными в альтернативной форме и основанными на существующей системе отбора образцов и оценки результатов анализа по двухклассной системе.
    
    Методические указания также содержат описание методики кондуктометрического определения L. monocytogenes в пищевых продуктах с использованием микробиологического анализатора "Бак Трак". Метод кондуктометрического анализа основан на регистрации изменений импеданса - сопротивления питательной среды, которые происходят в процессе роста и метаболической активности микроорганизмов.
    
    

3. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды

    
    Допускается использование других коммерческих питательных сред и диагностических препаратов аналогичного назначения для проведения исследований в соответствии с данным документом. При их применении следует руководствоваться рекомендациями изготовителя.
    
    Питательные среды и биологические препараты импортного производства должны иметь международный сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000. Питательные среды и препараты отечественного производства должны вырабатываться по нормативной документации, утвержденной в установленном порядке.
    
    

4. Подготовка к анализу

4.1. Приготовление растворов и реактивов
    

_______________
    * Возможно следует читать ГОСТ 10444.8-88. Примечание .
    

4.2. Приготовление питательных сред

    
    Среды промышленного изготовления, поименованные в п.3.3.2, готовятся согласно прописям на этикетке или в соответствии с рекомендациями фирмы.
    
    Допускается применение сред лабораторного приготовления по п.п.4.2.1-4.2.10.
    
    Приготовление питательных сред Pre-Media 403A и BiMedia 401А, 402А, 403A для определения листерий проводят в соответствии с МУК 4.2.590-96 "Бактериологические исследования с использованием микробиологического экспресс-анализатора "Бак Трак 4100".
    
    4.2.1. Питательный агар с 1% глюкозы и питательный бульон с 1% глюкозы (МПА с 1% глюкозы, МПБ с 1% глюкозы) готовят в соответствии с ГОСТ 10444.1.
    
    4.2.2. Триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом (TSYEB)/Триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA).
    
    Состав среды (г/л): ферментативный гидролизат казеина - 17,0; пептон соевый - 3,0; натрий хлористый - 5,0; фосфат калия однозамещенный - 2,5; глюкоза - 2,5; дрожжевой экстракт - 6,0; агар микробиологический (для TSYEA) - 15,0.
    
    Компоненты растворяют в 1000 см дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают рН 7,3±0,2 и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин.
    
    4.2.3. Среды селективного обогащения типа бульона Фрейзера.
    
    Приготовление основы среды (г/л): ферментативный гидролизат казеина - 5,0; пептон - 5,0; мясной экстракт - 5,0; дрожжевой экстракт - 5,0; натрий хлористый - 20,0; калия дигидрофосфат -1,35; натрия гидрофосфат - 12,0; эскулин - 1,0; литий хлористый - 3,0; железа аммонийного цитрат - 0,25 - растворяют в 1000 см дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают рН 7,2±0,2 и автоклавируют при 121 °С 15 мин.
    
    Перед употреблением в основу среды вносят асептически раствор селективных компонентов следующего состава:
    
    4.2.3.1. Для приготовления среды типа бульона Фрейзера первичного обогащения*: налидиксовой кислоты - 10 мг, акрифлавина гидрохлорид - 12,5 мг растворить в 10 см стерильного 0,2 N гидроксида натрия.
_______________
    * Допускается при приготовлении среды типа бульона Фрейзера первичного обогащения готовить основу среды без добавления эскулина и цитрата железа аммонийного.
    
    
    4.2.3.2. Для приготовления среды типа бульона Фрейзера вторичного обогащения: налидиксовой кислоты - 20 мг, акрифлавина гидрохлорид - 25 мг растворить в 10 см стерильного 0,2 N гидроксида натрия.
    
    Готовые среды разливают в стерильные колбы или пробирки и хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °С.
    
    4.2.4. PALCAM-агар (полимиксин-акрифлавин-лития хлорид-цефтазидим-эскулин-маннитол-агар) - селективная дифференциально-диагностическая среда для выделения листерий.
    
    Приготовление основы среды (г/л): пептон мясной ферментативный - 23,0; дрожжевой экстракт - 3,0; крахмал - 1,0; натрия хлорид - 5,0; эскулин - 0,8; лития хлорид- 15,0; железа аммония цитрат - 0,5; глюкоза - 0,5; маннит - 10,0; феноловый красный - 0,08; агар -15,0 - растворяют в 1000 см дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают рН 7,0±0,2 и автоклавируют при 121 °С 15 мин.
    
    К стерильной расплавленной основе среды добавляют асептически раствор селективных компонентов следующего состава: акрифлавин - 0,005; полимиксин "В" - 100000 ед.; цефтазидим - 0,02 в 10 см стерильной дистиллированной воды.
    
    Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри и хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °С.
    
    4.2.5. Селективная дифференциально-диагностическая среда для выделения листерий типа Оксфорд-агара.
    
    Приготовление основы среды (г/л): пептон мясной ферментативный - 23,0; крахмал кукурузный - 1,0; натрия хлорид - 15,0; эскулин - 1,0; лития хлорид - 15,0; железа аммония цитрат - 0,5; глюкоза - 0,5; агар - 15,0 растворяют в 1000 см дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают рН 7,0±0,2 и автоклавируют при 121 °С 15 мин.
    
    К стерильной расплавленной основе среды добавляют асептически раствор селективных компонентов следующего состава: акрифлавина гидрохлорид - 0,005; циклогексимид - 0,4, колистина сульфат* - 0,02, цефатетан* - 0,002, фосфомицин* - 0,01 мг в 10 см50%-ного этилового спирта.
_______________
    * Допускается замена комплекса перечисленных антибиотиков на полимиксин в количестве 500000 ед. на 1 л.
    
    
    Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри и хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °С.
    
    4.2.6. Кровяной агар.
    
    К растопленному и охлажденному до 45-50 °С питательному агару с 1% глюкозы (п.4.2.1) добавляют 5% по объему дефибринированной крови животных. Разливают в чашки Петри диаметром 90 мм по 15 см среды и подсушивают при 37 °С.
    
    Засев производят в теплые чашки.
    
    4.2.7. Питательный агар с эритроцитами барана. Дефибринированную или стабилизированную цитратом кровь барана центрифугируют в асептических условиях 30 мин при 900 об/мин. Надосадочную жидкость сливают. Осадок суспендируют в стерильном физиологическом растворе до первоначального объема, добавляют в количестве 5% по объему к растопленному и охлажденному до 45-50 °С питательному агару (п.4.2.1). Разливают в чашки Петри по 10 см, подсушивают при 37 °С. Чашки используют для посева теплыми.
    
    4.2.8. Среда для определения подвижности: 20 г гидролизата казеина ферментативного, 6 г пептона мясного ферментативного и 5 г агара растворяют в 1000 см дистиллированной воды, устанавливают рН 7,3±0,2, разливают в пробирки по 5-7 см и автоклавируют при 121 °С 15 мин.
    
    4.2.9. Среды Гисса по ГОСТ 10444.1 с маннитом, рамнозой, ксилозой. 10 г пептона ферментативного и 5 г натрия хлористого растворяют в 1000 см дистиллированной воды и добавляют 10 г соответствующего углевода. Устанавливают рН 7,1±0,1, вносят 10 мл индикатора Андреде (также возможно использование индикатора бромкрезолового пурпурного, "ВР" и др.), разливают в пробирки и стерилизуют при 112 °С в течение 20 мин.
    
    4.2.10. Среда для определения лецитиназной активности листерий. К среде ГРМ N 1 перед стерилизацией добавляют активированный уголь, растертый до порошкообразного состояния, до концентрации 0,5% (вес/объем). Желток куриного яйца разводят в 150 мл физиологического раствора и добавляют 5% по объему к стерилизованному и охлажденному до 40-50 °С питательному агару. Разливают в чашки Петри по 20 см и подсушивают при 37 °С. Аналогично готовят среду с добавлением желтка, но без добавления активированного угля.
    
    

5. Отбор и подготовка проб пищевых продуктов для анализа

5.1. Общие положения по отбору и подготовке проб

    
    Отбор и подготовку проб продукции производят в соответствии с ГОСТ 26668-85 "Методы отбора проб для микробиологических анализов", ГОСТ 26669-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов", МУК 4.2.577-96 "Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов", ГОСТ Р 51446 (ИСО 7218-96), а также в соответствии с действующими ГОСТ и НД на конкретные виды продуктов.
    
    Масса или объем отбираемых проб должны быть достаточными для проведения исследования и минимально вдвое превышать аналитический образец. Из точечных проб составляют навеску массой 25±0,1 г (50-100 г - для продуктов детского, лечебного и специализированного питания).
    
    От продукции в потребительской таре в мелкой фасовке пробы отбирают в количестве одной или нескольких единиц в зависимости от массы или объема потребительской тары, с тем чтобы количество было достаточным для проведения анализа.
    
    От продукции в транспортной или потребительской таре больших размеров или неупакованной пробы отбирают из разных мест с различной глубины, включая поверхность.
    
    Для микробиологических анализов пробы отбирают до взятия проб на физико-химические и органолептические анализы стерильным инструментом в стерильную посуду. При этом от образца отбирают несколько точечных проб из разных мест, которые измельчают и перемешивают, из них составляют навеску 25 г.
    
    Замороженные продукты предварительно размораживают до температуры внутри продукта 0-(-1) °С; продукты, содержащие жиры (сливочное масло, мороженое) нагревают до температуры 40-45 °С и перемешивают.
    
    Отобранные образцы перемешивают и измельчают или доводят до однородной консистенции по ГОСТ 26669, из измельченной суспензии составляют навеску необходимой массы.
    
    При посевах высококислотных или щелочных (с рН<6 или >7,5) жидких и твердых продуктов для предотвращения снижения рН питательных сред на 0,5 и более, рН продукта перед посевом доводят до (7,0±0,2) по ГОСТ Р 50480.
    

5.2. Отбор и подготовка проб молока, молочных продуктов, сыров, мороженого

    
    Отбор и подготовку проб продуктов проводят согласно ГОСТ 3622-68 "Молоко и молочные продукты. Отбор и подготовка их к испытанию" и 9225-84 "Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа".
    
    Кисломолочные продукты, сыр, творог, творожные изделия и пастообразные продукты тщательно измельчают с помощью гомогенизаторов перистальтического типа или ножевых и подвергают нейтрализации, масло сливочное и мороженое растапливают до сметанообразной консистенции.
    

5.3. Отбор и подготовка проб мяса, мясных полуфабрикатов, мяса птицы и птицепродуктов, колбасных изделий и других мясопродуктов

    
    Отбор и подготовку проб мяса, субпродуктов, мясных полуфабрикатов, колбасных изделий и других мясных продуктов проводят по ГОСТ 21237 "Мясо. Методы бактериологического анализа", ГОСТ 4288 "Изделия кулинарные и полуфабрикаты из рубленного мяса", ГОСТ 9958, ГОСТ 9792 "Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц".
    
    Массу навески отбирают в соответствии с п.6.1.
    
    Отбор и подготовку проб мяса птицы, субпродуктов и птичьих полуфабрикатов проводят по ГОСТ Р 50396.0 "Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы отбора проб и подготовка к микробиологическим исследованиям".
    

5.4. Отбор и подготовка проб плодоовощной продукции

    
    Отбор и подготовку к анализу проб плодоовощной продукции проводят согласно ГОСТ 26668, ГОСТ 26669, ГОСТ 26313 "Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб", кроме подготовки к анализу проб поверхностно контаминированных и пюреобразных продуктов. Для поверхностно-контаминированной и быстрозамороженной плодоовощной продукции подготовку проводят согласно "Инструкции по микробиологическому контролю быстрозамороженной плодоовощной продукции" (МЗ СССР 29.09.89, прил.1, п.1.3). Для анализа поверхностно-контаминированной продукции готовят суспензию добавлением к навеске массой (100±30) г, отобранной из трех единиц тары или фасовки, 0,1%-ного пептонно-солевого раствора в количестве, равном массе навески. При этом 1 см полученной суспензии оценивают как 1 г (см) продукта.
    
    Из измельченных плодов, овощей, полуфабрикатов и пюреобразных и жидких отбирают раздельно навески массой по (100±30) г из трех единиц тары или фасовки и готовят объединенную пробу массой в соответствии с п.6.1.
    

5.5. Отбор и подготовка проб рыбы, нерыбных объектов промысла и продуктов, вырабатываемых из них

    
    Отбор и подготовку проб проводят согласно "Инструкции по санитарно-микробиологическому контролю производства пищевой продукции из рыбы и морских беспозвоночных" N 5319-91 от 22.02.91 и ГОСТ 7631-85 "Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Правила приемки, органолептические методы оценки качества, методы отбора проб для лабораторных испытаний".
    
    Отбор проб свежей, охлажденной и мороженой рыбы проводят от 2 точечных образцов, мышечная ткань в которых составляет не менее 25 г по ГОСТ 7631-85. Из каждой точечной пробы стерильным инструментом вырезают спинные мышцы с кожей, перемешивают и отвешивают 25 г, затем измельчают с помощью гомогенизаторов перистальтического типа или ножевых и гомогенизируют в 225 см среды накопления.
    

5.6. Продукты детского, лечебного питания и их компоненты

    
    Отбор и подготовку проб продуктов детского, лечебного питания и их компонентов проводят согласно МУК 4.2.577-96 "Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов".
    
    Отобранные пробы продуктов перед исследованием тщательно перемешивают, кисломолочные продукты нейтрализуют (на 10 см/г исследуемого продукта или его первого разведения для сухих кисломолочных продуктов, напитка или закваски добавляют 1,0 смстерильного раствора двууглекислого натрия с массовой концентрацией 100 г/см). Сыр, творог, творожные изделия и пастообразные продукты тщательно измельчают и нейтрализуют. Топленое масло или молочный жир расплавляют при температуре 40-45 °С и перемешивают до получения однородной эмульсии.
    
    

6. Проведение анализа

    
    
    6.1. Подготовленную в соответствии с п.5. навеску исследуемого продукта (гомогената, смыва с поверхности) в количестве 25 г (см) вносят в одну из сред для первичного обогащения в количестве 225 см (по п.п.3.3.2.2, 4.2.3.1). При необходимости анализа других масс продукта их посев проводят в среду также в соотношении 1:9 по объему.
    
    Посевы термостатируют при 37 °С в течение (24±2) ч. При росте листерий на средах предобогащения, содержащих эскулин и цитрат железа аммонийного, наблюдается почернение среды за счет гидролиза гликозида эскулина до глюкозы и эскулетина. Эскулетин реагирует с ионами железа, образуя комплекс черного или оливкового цвета. На других средах почернения не отмечаются.
    
    6.2. После термостатирования продукта в среде для первичного обогащения 0,1 см суспензии пересевают в 10 см одной из жидких сред для вторичного обогащения по п.п.3.3.2.2, 4.2.3.2. Посевы термостатируют при температуре (37±1) °С в течение 48 ч. В средах с эскулином отмечают почернение как признак возможного присутствия бактерий рода Listeria.
    
    6.3. Из пробирок после термостатирования, независимо от наличия или отсутствия признаков роста, и в т. ч. почернения, делают пересев по 0,1 см на поверхность двух чашек Петри с одной из агаризованных дифференциально-диагностических сред по п.п.3.3.2.3, 4.2.4, 4.2.5. Посевной материал растирают стерильным шпателем. Допускается проводить пересев петлей штрихом. Чашки со средами предварительно подсушивают.
    
    Посевы термостатируют при температуре (37±1) °С в течение 24-48 ч.
    
    6.4. Проведение анализа без этапа вторичного обогащения. При посеве продуктов с низким исходным уровнем микробной контаминации и при отсутствии признаков роста в жидкой среде (помутнение, почернение и др.) допускается проводить пересев на чашки с агаризованными дифференциально-диагностическими средами сразу после этапа первичного обогащения по п.6.2.
    
    6.5. При отсутствии роста на чашках с дифференциально-диагностическими средами типа Оксфордского агара и PALCAM-агара анализ прекращают и дают заключение об отсутствии L. monocytogenes в исследованной пробе продукта.
    
    6.6. При обнаружении характерного роста на чашках отбирают 3-5 колоний для их дальнейшего изучения.
    
    На средах типа PALCAM-агара через 24 ч инкубирования листерии формируют мелкие, серовато-зеленые или оливково-зеленые колонии с черным ореолом, диаметром 0,5-1,0 мм, иногда с черным центром. Через 48 ч колонии диаметром 1,0-2,0 мм приобретают зеленую окраску с углубленными центрами, окруженными черным ореолом. Кокковая микрофлора (бактерии родов Staphylococcus, Enterococcus) образует желтые колонии за счет ферментации маннита.
    
    На Оксфордском агаре (Oxford agar) листерии, выращенные в течение 24 ч, мелкие (1 мм), сероватые, окруженные черным ореолом. Через 48 ч - более темные, около 2 мм в диаметре, с черным ореолом и углубленным центром.
    
    При появлении сплошного роста листерий производят пересев бактериологической петлей из зон наибольшего почернения среды штрихами на 2-3 чашки Петри с селективной дифференциально-диагностической питательной средой (Оксфордский или PALKAM-агар) для получения изолированных колоний. Посевы термостатируют аналогично п.6.3.
    
    6.7. Отобранные характерные колонии, подозрительные на принадлежность к Listeria monocytogenes, пересевают на среды:
    
    МПА с 1% глюкозы (п.4.2.1), триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA) по п.3.3.2.1 или 4.2.2 для получения изолированных колоний, которые подвергают дальнейшему изучению.
    
    Посевы термостатируют при температуре 30 °С в течение 24 ч.
    
    6.8. Идентификация выделенных культур. Для определения принадлежности выделенных микроорганизмов к роду Listeria полученные на средах культивирования чистые культуры микроскопируют по Граму, определяют наличие у них каталазы, подвижность при двух температурах инкубирования - 22 и 37 °С, способность к ферментации маннита и ставят реакцию нитрат-редукции.
    
    6.8.1. Окраска по Граму. Бактерии рода Listeria являются грамположительными тонкими короткими палочками, спор не образуют.
    
    6.8.2. Каталазную активность культур определяют в соответствии с ГОСТ 30425 по способности каталазы разлагать перекись водорода с выделением пузырьков газа. Реакцию ставят с охлажденной до комнатной температуры суточной культурой на стерильном предметном стекле. Изолированную колонию, взятую с поверхности питательной среды, растирают на стекле и пипеткой наносят каплю 3%-ного раствора перекиси водорода. Если через 30-60 с на стекле появляются пузырьки газа, то считают результаты реакции положительными. Параллельно ставят контрольную пробу.
    
    Бактерии рода Listeria являются каталазоположительными.
    
    6.8.3. Подвижность культур определяют посевом уколом в среды по п.3.3.2.3 и 4.2.8 и инкубированием при двух температурах - 25 и 37 °С в течение 48-72 ч.
    
    Бактерии рода Listeria подвижны при 20-25 °С (образуют характерный рост вокруг линии укола, похожий на зонтик) и неподвижны (или слабоподвижны) при 35-37 °С.
    
    6.8.4. Для определения способности сбраживать углеводы культуры пересевают на пестрый ряд в среды Гисса по п.п.3.3.2.3 или 4.2.9. Посевы термостатируют 7 дней при 37 °С, наличие ферментативной активности в отношении углеводов определяют по изменению окраски сред за счет образования кислоты.
    
    Большинство бактерий рода Listeria не утилизируют маннит (за исключением L. grayi и L. grayi subsp. murrayi).
    
    6.8.5. Постановку реакции нитрат-редукции проводят по ГОСТ 10444.8-88. Бактерии рода Listeria не восстанавливают нитраты до нитритов (за исключением L. grayi и L. grayi subsp. murrayi).
    
    Обнаружение в посевах грамположительных коротких тонких палочек, каталазоположительных, не восстанавливающих нитраты до нитритов, не утилизирующих маннит, подвижных при 25 °С и неподвижных при 37 °С, указывает на принадлежность выделенных на дифференциально-диагностических средах культур с характерной морфологией к роду Listeria.
    
    Для подтверждения принадлежности выделенных листерий к виду L. monocytogenes определяют способность к ферментации рамнозы, ксилозы, наличие лецитиназной и бета-гемолитической активности и проводят постановку КАМП-теста (CAMP-test). Дифференцирующие признаки видов рода Listeria указаны в табл.1.
    
    

Таблица 1

    
    
    Для видовой дифференциации выделенных культур листерий допускается использовать биохимические тест-системы API Listeria фирмы "BioMerieux". При их применении следует руководствоваться рекомендациями изготовителя.
    
    6.8.6. Наличие способности ферментировать рамнозу и ксилозу - определяют аналогично п.6.8.4. Бактерии L. monocytogenes утилизируют рамнозу с образованием кислоты и не утилизируют ксилозу.
    
    6.8.7. Бета-гемолитическую активность исследуемых культур определяют по образованию зон просветления за счет растворения эритроцитов вокруг колоний при посеве на поверхность кровяного агара, приготовленного с добавлением стерильной дефибринированной крови барана или кролика. Посевы на кровяном агаре (п.п.3.3.2.3, 4.2.6) термостатируют при 37 °С в течение 24 ч.
    
    Listeria monocytogenes обладают -гемолитической активностью (образуют узкие четкие зоны просветления вокруг колоний).
    
    6.8.8. Постановку КАМП-теста проводят для дифференциации L. monocytogenes от других видов листерий, обладающих гемолитической активностью.
    
    Для проведения теста 2-3-суточные культуры гемолитических штаммов Staphylococcus aureus и Rhodococcus equi засевают на кровяной агар с эритроцитами барана двумя параллельными штрихами на расстоянии 5,0-5,5 см, как показано на рис.1.
    

Рис.1.

S - посев Staphylococcus aureus; R - посев Rhodococcus equi.

    Между вертикальными штрихами St. aureus и Rh. equi засевают параллельными штрихами исследуемые культуры листерий на расстоянии друг от друга не менее 1 см и от вертикальных штрихов - 0,5 см. В качестве контрольных используют тест-штаммы L. monocytogenes и L. ivanovii. Инкубацию проводят 24 ч при 37 °С. Отмечают форму и размеры зон гемолиза около вертикальных штрихов роста стафилококка и родококка.
    
    Listeria monocytogenes дает расширение зоны гемолиза около штриха St. aureus (положительный КАМП-тест) и имеет отсутствие изменений зоны гемолиза рядом со штрихом Rh. equi (отрицательный КАМП-тест).
    
    6.8.9. Для определения лецитиназной активности дно двух чашек Петри со средой ГРМ N 1, содержащих: 1 чашка - желток куриного яйца и активированный уголь, 2 чашка - желток куриного яйца без активированного угля - делят на несколько секторов или квадратов, исследуемые культуры и контрольные штаммы листерий пересевают параллельно короткими штрихами на соответствующие секторы чашек, содержащих и не содержащих уголь. Инкубируют 48 ч при 37 °С. Чашки просматривают в проходящем свете и определяют наличие активности в присутствии и в отсутствии активированного угля, сравнивая с контрольными высевами музейных штаммов. Listeria ivanovii дает плотную зону помутнения шириной 3-6 мм независимо от присутствия активированного угля. Listeria monocytogenes дает аналогичную зону помутнения в присутствии активированного угля и не дает при отсутствии угля. Другие виды листерий не дают зоны помутнения.
    
    6.9. Учет результатов. Результат оценивают по каждой исследованной пробе отдельно. В образце продукта констатируют присутствие Listeria monocytogenes, если при посеве на селективные среды выделены короткие неспорообразующие грамположительные палочки, каталазоположительные, подвижные при 25 °С и неподвижные при 37 °С, утилизирующие эскулин, сбраживающие с образованием кислоты рамнозу и не сбраживающие маннит и ксилозу, не восстанавливающие нитраты до нитритов, обладающие бета-гемолитической активностью, дающие положительную реакцию в КАМП-тесте со Staphylococcus aureus и отрицательную - с Rhodococcus equi, проявляющие лецитиназную активность на среде ГРМ N 1 с добавлением желтка куриного яйца и в присутствии активированного угля.
    
    Результаты выявления Listeria monocytogenes в определенной навеске продукта записывают: "Listeria monocytogenes обнаружены в 25 г (см) (в 50-100 г - для продуктов детского, лечебного и специализированного питания) продукта" или "Listeria monocytogenes не обнаружены в 25 г (см) (в 50-100 г - для продуктов детского, лечебного и специального питания) продукта".
    
    Результат оценивают по каждой пробе отдельно.
    
    

7. Проведение исследования с использованием
кондуктометрического анализатора "Бак Трак"

7.1. Предварительное обогащение - 1 этап

    
    Для предварительного обогащения используется среда Рге-Media 403A.
   
    Необходимое количество продукта, в котором регламентируется отсутствие L. monocytogenes, смешивают со средой Pre-Media 403А в соотношении 1/10, затем образец гомогенизируют и инкубируют в течение 24 ч.

7.2. Обогащение - 2 этап

    
    Для обогащения используют одну из сред BiMedia 401А, BiMedia 402A, BiMedia 403А.
    
    Среду BiMedia 403А (401А, 402А) оставляют уравновеситься при комнатной температуре в течение 12 ч. Устанавливают температуру 37 °С на приборе "Бак Трак".
    
    В основном меню программы "Бак Трак" устанавливают следующие параметры.
    

Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters)

    Добавляют в каждую измерительную ячейку по 10 см среды BiMedia и вносят по 0,1 см предобогащенного образца, тщательно перемешивают содержимое, вращая ячейку между ладонями (не переворачивая).
    
    Для контроля среды используют одну измерительную ячейку с 10 см среды BiMedia (без инокулята).
    
    Выбирают в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (Start Measurement) и начинают измерения.
    
    После того как каждая позиция в блоке будет отмаркирована как свободная на экране монитора, измерительные ячейки помещают в прибор "Бак Трак". Измерение начинается автоматически через 1 ч после загрузки ячеек в прибор. Рост микроорганизмов и время определения изменения импеданса (IDT) записываются автоматически.
    
    Учет результатов.
    
    Образец загрязнен листериями, если изменение импеданса превышает 15%-ное пороговое значение по Е-параметру в течение 30 ч.
    
    Подтверждение Listeria-позитивных образцов. В случае положительного ответа на листерии проводится подтверждение роста и идентификация до L. monocytogenes с высевом на селективные питательные среды в соответствии с п.п.6.3-6.8. Высев производится непосредственно из измерительной ячейки.
    
    Выросшие культуры подвергают идентификации по п.6.8.
    
    Учет результатов и выдача ответа по п.6.9.
    
    

8. Выявление Listeria monocytogenes в реакции нарастания титра фага (РНФ)

    
    
    РНФ может быть использована в качестве дополнительного метода для обнаружения L. monocytogenes в пищевых продуктах (при проведении противоэпидемических мероприятий и при эпидрасследовании).
    
    Реакция нарастания титра фага - быстрый специфический метод обнаружения листерий, обеспечивающий выявление возбудителя в исследуемом материале без выделения культуры.
    
    РНФ основана на свойстве индикаторного бактериофага строго специфично размножаться в клетках гомологичного микроба. Размножение бактериофага сопровождается увеличением количества его частиц и повышением титра.
    
    8.1. В реакции применяют листериозные бактериофаги L2A и L4A. Штаммы L. monocytogenes I (9-127) и II (9-72) серогрупп. Питательные среды, содержащие 0,5% глюкозы: мясопептонный бульон, 1,5%-ный и 0,7%-ный мясопептонный агар.
    
    8.2. При постановке РНФ с пробами пищевых продуктов отвешивают 25 г исследуемого материала, измельчают, помещают в колбу емкостью 1000 см и добавляют 250 см МПБ. Смесь в течение 5-10 мин встряхивают, затем 9 см переносят в бактериологическую пробирку N 1 (опыт).
    
    8.3. Бактериофаги используют в рабочем разведении (10000 фаговых корпускул в 1 см). Для этого их растворяют в МПБ до исходного объема, указанного на этикетке ампулы, а затем на МПБ отдельными пипетками делают пять последовательных десятикратных разведений (в последнем разведении титр бактериофага составит 1х10).
    
    Смесь фагов готовят путем смешивания равных объемов фага L2A и L4A в рабочем разведении.
    
    8.4. Для контроля титра бактериофага, который ставят один на группу анализов, проводимых одновременно, в пробирку N 2 (контроль) вносят 9 см МПБ.
    
    8.5. В пробирки N 1 и 2 вносят по 1 см смеси фага в рабочем разведении (рис.2) и выдерживают их в течение 16-24 ч при комнатной температуре, после чего в пробирки добавляют по 1 см хлороформа. Содержимое тщательно встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 30-40 мин. Хлороформ оседает на дно, надосадочную жидкость подвергают дальнейшим исследованиям.
    
    8.6. При использовании смеси фагов из опытной и контрольной пробирок (N 1 и 2) берут по 0,2 см и переносят по 0,1 см в две пробирки, содержащие по 0,9 см МПБ (один ряд для обнаружения фага L2A, а другой - L4A), а затем из каждой пробирки готовят еще одно десятикратное разведение.
    
    8.7. Готовят взвесь штаммов I и II серогруппы по стандарту мутности 10 ед. путем разведения суточной агаровой культуры в физиологическом растворе. Во все пробирки с разведенным материалом добавляют по 0,1 см взвеси, штамма 1 серогруппы для выявления фага L2A или штамма II серогруппы для обнаружения фага L4A.
    
    Содержимое пробирок засевают методом агаровых слоев по Грациа. Для этого накануне дня исследования в бактериологические чашки Петри разливают по 10 см1,5%-ного МПА; МПА можно разлить в чашки Петри и в день исследования, но в этом случае поверхность агара необходимо предварительно подсушить в течение 40-50 мин при 37 °С или 2 ч при комнатной температуре. Для второго слоя используют расплавленный и охлажденный до 48-50 °С 0,7%-ный МПА, который следует использовать в течение часа, так как позже он приобретает гелеобразную консистенцию и непригоден для исследования.
    

Рис.2. Схема постановки РНФ для обнаружения листерий.

    
    Затем в пробирки пипеткой вносят по 2,5-3 см расплавленного и охлажденного до 48-50 °С 0,7%-ного МПА. Содержимое быстро и тщательно перемешивают вращением пробирки между ладонями и выливают в чашку Петри. Смесь легким покачиванием чашки равномерно распределяют вторым слоем на поверхности 1,5%-ного МПА. Чашки оставляют на ровном месте на 20-30 мин (до застывания 0,7%-ного МПА), затем переворачивают и инкубируют при комнатной температуре.
    
    8.8. Учет реакции проводят через 16-24 ч инкубирования посевов.
    
    В опытных пробах и контроле титра фага подсчитывают число негативных колоний во всех чашках. Негативные колонии - округлые, хорошо заметные на фоне бактериального роста, прозрачные участки, образующиеся в результате лизиса бактерий.
    
    При учете результатов сравнивают количество негативных колоний на чашках соответствующих разведений.
    
    8.9. Результаты реакции оценивают по увеличению титра бактериофага (количества негативных колоний):
    
    - увеличение количества негативных колоний в опытной пробе по отношению к контролю в 5 и более раз (хотя бы по одному из разведений) оценивается как положительный результат, менее чем в 5 раз - отрицательный;
    
    - сплошной лизис или лизис с островками оценивается как положительный результат.
    
    8.10. При получении положительного результата РНФ дают заключение, что в исследуемом материале (пробе) обнаружены бактерии рода Listeria.
    
    

9. Биологические исследования

    
    
    Биологические исследования (постановку биопроб на мышах) выделенных культур и их серологическую диагностику в реакции агглютинации проводят в ходе противоэпидемических мероприятий и при эпидрасследовании заболеваний в соответствии с методическими рекомендациями "Лабораторная диагностика листериоза животных и людей, меры борьбы и профилактики". М., 1987 (утв. 04.09.86) [16].
    
    

10. Требования безопасности

    
    
    Исследования пищевых продуктов на наличие Listeria monocytogenes проводят в соответствии с СанПиН 1.2.731-99* "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами".
_________________
    * Вероятно ошибка оригинала. Следует читать СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами". Примечание .
   
    

Библиографический список

    
    
    1. Федеральный закон "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" от 30 марта 1999 г. N 52-ФЗ.
    
    2. Положение о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации, утвержденное постановлением Правительства Российской Федерации от 24 июля 2000 г. N 554.
    
    3. Положение о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании, утвержденное постановлением Правительства Российской Федерации от 24 июля 2000 г. N 554.
    
    4.СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования к безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов".
    
    5. ГОСТ 26668-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических исследований".
    
    6. ГОСТ 26669-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов".
    
    7. ГОСТ 26670-91 "Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов".
    
    8. ГОСТ 10444.1-84 "Консервы. Приготовление растворов, красок, индикаторов, питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе".
    
    9. ГОСТ 9225-84 "Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа".
    
    10. ГОСТ 9792-73 "Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила приемки и методы отбора проб".
    
    11. ГОСТ 9958-81 "Изделия колбасные и продукты из мяса. Методы бактериологического анализа".
    
    11 ГОСТ 21237-75 "Мясо. Методы микробиологического анализа".
    
    13. ГОСТ 4288-76 "Изделия кулинарные и полуфабрикаты из рубленого мяса. Правила приемки и методы испытания".
    
    14. ГОСТ 7631-85 "Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Правила приемки, органолептические методы оценки качества, методы отбора проб для лабораторных испытаний".
    
    15. МУК 4.2.590-96 "Бактериологические исследования с использованием микробиологического экспресс-анализатора "Бак Трак 4100" /Минздрав России. М., 1997.
    
    16. Методические рекомендации "Лабораторная диагностика листериоза животных и людей, меры борьбы и профилактики" (утв. Минздравом СССР 04.09.86).
    
    17. "Инструкция по санитарно-микробиологическому контролю тушек, мяса птицы, птицепродуктов, яиц и яйцепродуктов на птицеводческих и птицеперерабатывающих предприятиях" (утв. Главветупром; согл. зам. Главного государственного санитарного врача СССР 30.08.90).
    

    18. СанПиН 2.3.4.050-96 "Производство и реализация рыбной продукции".
    
    19. СанПиН 2.3.4.545-96 "Производство хлеба, хлебобулочных и кондитерских изделий".
    
    20. СанПин 2.3.4.551-96 "Производство молока и молочных продуктов".
    
    21. СанПиН 42-123-4423-87 "Нормативы и методы микробиологического контроля продуктов детского питания, изготовленных на молочных кухнях системы здравоохранения".
    
    22. СанПиН 1.2.731-99* "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами".
_________________
    * Вероятно ошибка оригинала. Следует читать СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами". Примечание .
    
    
    23. СанПиН 2.3.6.1066-01* "Санитарно-эпидемиологические требования к организации торговли и обороту в них продовольственного сырья и пищевых продуктов".
_________________
    * Вероятно ошибка оригинала. Следует читать СП  2.3.6.1066-01 "Санитарно-эпидемиологические требования к организации торговли и обороту в них продовольственного сырья и пищевых продуктов". Примечание .
    
          
    24. "Инструкция по порядку и периодичности контроля за содержанием микробиологических и химических загрязнителей в молоке и молочных продуктах на предприятиях молочной промышленности" (утв. Минсельхозпромом России, согл. Госкомсанэпиднадзором России 28.12.95).

    25. "Санитарные правила для предприятий пищеконцентратной промышленности" (утв. Минздравом СССР 01.03.76).
    
    26. "Ветеринарно-санитарные правила для предприятий (цехов) переработки птицы и производства яйцепродуктов" (утв. Минздравом СССР 6.03.87).
    
    27. "Инструкция по порядку и периодичности контроля за содержанием микробиологических и химических загрязнителей в мясе, птице, яйцах и продуктах их переработки" (утв. Минсельхозпромом России; согл. Минздравом России 27.06.00).
    
    28. "Инструкция по микробиологическому контролю производства мороженого" (утв. ТК 186 по стандартизации (молоко и молочные продукты); согл. зам. Главного государственного санитарного врача России 10.03.93).
    
    29. "Инструкция по санитарно-бактериологическому контролю производства маргарина и майонеза на предприятиях маргариновой промышленности" (утв. Госагропромом СССР 21.11.88).
    
    30. "Порядок санитарно-микробиологического контроля при производстве мяса и мясных продуктов" (утв. Минсельхозпромом России 15.12.95).
    

    31. "Инструкция по микробиологическому контролю производства высокостойких безалкогольных напитков. ИК 10-5031536-105-91" (утв. Госагропромом СССР; согл. Минздравом СССР 28.06.91).
    
    32. "Инструкция по микробиологическому контролю быстрозамороженной плодоовощной продукции" (утв. Госагропромом СССР; согл. Минздравом СССР 29.09.89).
    

    33. МУК 4.2.577-96 "Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов".
    
    
    
Текст документа сверен по:
официальное издание
М.: Федеральный центр
госсанэпиднадзора
Минздрава России, 2002