Законы :: от 2001-06-06 N 4.2.1054-01

Адрес документа: http://law.rufox.ru/view/20/1200025581.htm

МУК 4.2.1054-01

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

3.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Измерение концентраций микроорганизмов-продуцентов,
бактериальных препаратов и их компонентов
в атмосферном воздухе населенных мест

Дата введения 2001-10-01

    1. ПОДГОТОВЛЕНЫ: д.м.н. М.В.Далин (Российский Университет дружбы народов), к.м.н. Н.П.Сергеюк (Научно-исследовательский центр "ЭКОС") на основании материалов секции "Гигиенические аспекты биотехнологии микробного загрязнения окружающей среды" Проблемной Комиссии "Научные основы гигиены окружающей среды"

    2. РЕКОМЕНДОВАНЫ К УТВЕРЖДЕНИЮ Комиссией по госсанэпиднормированию Минздрава России (прот. N 7 от 28.04.01)

    3. УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 6 июня 2001 г.

    4. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ

1. Общие положения и область применения

    Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентраций промышленных микроорганизмов и бактериальных препаратов в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне от 100 до 5000 клеток в 1 м воздуха.

    Методические указания разработаны с целью обеспечения микробиологического контроля концентрации промышленных микроорганизмов и бактериальных препаратов в атмосферном воздухе населенных мест и оценки соответствия уровня их содержания гигиеническим нормативам на основе учета требований ГОСТов 17.2.4.02-81 "Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ" и 8.653-96. ГСИ "Методики выполнения измерений".

    Методические указания предназначены для центров госсанэпиднадзора, санитарных лабораторий биотехнологических предприятий, микробиологических лабораторий, научно-исследовательских институтов, работающих в области гигиены окружающей среды и аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

2. Характеристика штамма микроорганизма

    2.1. Таксономическое положение штамма

    2.2. Морфология колоний и клеток. (Данные по каждому штамму для п.п.2.1, 2.2 представлены в табл.)

3. Пределы измерений

    Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток микроорганизма в воздушной среде в диапазоне концентраций от 10 до 5000 клеток в 1 м воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

    Метод основан на аспирации из воздуха клеток микроорганизма на поверхность плотной питательной среды и подсчете выросших колоний по типичным морфологическим признакам.

5. Средства измерений, оборудование, вспомогательные устройства, материалы

    При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

	Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова)	ТУ 64-12791-77
	Импактор микробиологический ИМБ-15
	Прибор для бактериологического анализа воздуха "Флора-100"
	Термостаты электрические суховоздушные или водяные
	Автоклав электрический	ГОСТ 9586-75
	Бокс, оборудованный бактерицидными лампами
	Холодильник бытовой
	Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200
	Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа "Биолам" Л-211
	Лупа с увеличением 10 х	ГОСТ 25706-83
	Чашки Петри бактериологические плоскодонные стеклянные, диаметром 100 мм
	Пробирки биологические, вместимостью 20 и 35 мл	ГОСТ 10515-75
	Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл	ГОСТ 10515-75
	Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл	ГОСТ 1770-74
	Секундомер	ГОСТ 9586-75
	Барометр	ГОСТ 24696-79
	Марля медицинская	ГОСТ 9412-77
	Вата медицинская гигроскопическая	ГОСТ 25556-81

5.2. Питательные среды

	Агар микробиологический	ГОСТ 17206-96
	Селективная среда (среда для каждого штамма микроорганизмов представлена в табл.).

6. Требования безопасности

    При выполнении измерений концентрации клеток в воздушной среде соблюдают следующие требования.

    Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТу 12.1.005-88.

    Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТу 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

    Руководство "Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности" (1980), "Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977).

    Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

    К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Проведение измерения

8.1. Условия отбора проб воздуха

    Для определения концентрации микроорганизма производят отбор проб воздуха при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время отбора пробы воздуха 20 мин. Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы. В том случае, если определяется концентрация микроорганизмов, имеющих обильный воздушный мицелий, отбор производят в жидкостные поглотители с последующим разведением и посевом на плотную питательную среду.

8.2. Выполнение анализа

    Метод предполагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний, выросших на 3-4 сутки после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний.

    Селективную среду тщательно перемешивают и разливают по 20 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. При необходимости в селективную среду добавляют компоненты, подавляющие рост посторонней микрофлоры. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

    После отбора проб воздуха чашки Петри инкубируют в термостате и производят подсчет выросших типичных колоний. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.

9. Вычисление результатов измерения

    Расчет концентрации клеток в перерасчете на 1 м воздуха производят по формуле:

кл/м, где

     - концентрация клеток в воздухе;

     - количество колоний, выросших на чашке;

    1000 - коэффициент перерасчета на 1 м воздуха;

     - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

    Для консорциумов микроорганизмов используют следующую методику подсчета:

, где

     - концентрация консорциума (КОЕ/м);

     - концентрация контрольного микроорганизма (КОЕ/м);

     - содержание контрольного микроорганизма в консорциуме (%).

    Контрольные микроорганизмы, входящие в состав консорциумов (препаратов, созданных на основе живых микроорганизмов и включающих в себя два и более штаммов), представлены в табл. с пометкой КМ, там же приведены торговые названия препаратов.

Используемые сокращения и условные обозначения

    АС - Агаризованная среда

    МПА - Мясо-пептонный агар

    МСЭА - Агар с экстрактом мозга и сердца

    РНСП - Роды с неясным систематическим положением

    САС - Синтетическая агаризованная среда

    ВЗ - Выброс запрещен

Пояснение к таблице

    Микроорганизмы, сведения о которых представлены в табл., разделены на группы, не являющиеся формальными таксономическими категориями, но подразделяющие штаммы на легко определяемые фенотипические единицы.

    Таксономическое положение каждого штамма определено до уровня семейства за исключением т.н. "Родов с неясным систематическим положением" согласно "Определителю бактерий Берджи" (М., "Мир", 1997).

    Для каждого из штаммов микроорганизмов представлена селективная твердая питательная среда и специальные добавки в среду, необходимые для подавления посторонней микрофлоры.

    Колонка "Примечания" содержит сведения об особенностях штамма как упрощающих его идентификацию (способность к образованию какого-либо пигмента, специфическая ферментативная активность и т.д.), так и создающих возможность экспресс-диагностики.

Таблица

Идентификация микроорганизмов и условия их культивирования

N п/п

ПДК aтм., кл/м

Таксономическое положение

Питательная среда (базовая)

Добавки в питательную среду для подавления посторонней микрофлоры

Условия культиви- рования (время инкубации
и t °C)

Морфологические признаки колоний

Примечания

Грамотрицательные аэробные/микроаэрофильные палочки и кокки

Семейство: Neisseriaceae. Род: Аcinetobacter Вид: oleovorum
s/paraffinicum
шт. ВСБ 712

МПА

Спирт этиловый рект. 2 мл/100 мл среды

1 сутки
38 °C

Круглые с ровным краем, блестящие, бесцветные,
d - 3-4 мм

300

Вид species
шт. ВСБ 644

МПА

Спирт этиловый рект. 2 мл/100 мл среды

3 суток
37 °C

Округлые, гладкие, слабо выпуклые, с ровным краем, светлые, d - З мм

500

Семейство: Azotobacteriaceae Род: Azotobacter
Вид: Vinelandii (Lipman) шт. Ф.ч-1

Мясная вода/МПА-1/1, пептон 10,0, натрий хлористый 5,0, глюкоза 10,0, агар 2,0, рН 7,2-7,4

Амфотерицин
10 мкг/мл, стрептомицина сульфат 250 мкг/мл

2-3 суток 28 °C

Мелкие, выпуклые, плотные, маслянисто- блестящие, вросшие в агар

Синтезирует водорастворимый пигмент, флуоресцирующий в УФ-лучах

200

Семейство: Pseudomonaceae Род: Pseudomonas Вид: fluorescens
шт. К3б

МПА

Нафталин
2 мл/100 мл среды

2 суток
28 °C

Полупрозрачные, глянцевые, слегка опалесцирующие,
в центре небольшое уплотнение в виде точки, d - 1,4-2,2

При добавлении нафталина -
темно-коричневая окраска

2000

шт. ST

МПА

Фенол, ацетон, стирол (2 мл/100 мл среды)

2 суток
28 °C

Глянцевые, опалесцирующие
d - 2 мм

Вид: stutzeri
шт. 367-1

Картофельный агар

Низкомолекулярные спирты (кроме метанола)
2 мл/100 мл среды

2 суток
32 °C

Светло-серые, круглые, в центральной части угристые, бежевые, край волнистый прозрачный

КМ, препарат "Деваройл"

1000

РНСП
Род: Acetobacter
Вид: methylicum
шт. ВСБ-924

САС
с метанолом

Метанол
2 мл/100 мл среды (pН 4,5)

3 суток 30-35 °C

Выпуклые, гладкие, серовато-белые, слизистой консистенции

Грамположительные палочки и кокки, образующие эндоспоры

200

Семейство: Bacillaceae Род: Bacillus
Вид: polymixa шт.-

Различные агаризованные среды (белково- витаминный агар, кукурузо- пептонный агар)

Амфотерицин В
(10 мкг/1 мл среды) либо Полимиксин М

1 сутки 30-37 °C

Круглые, в центре выпуклые, шероховатые, с лопастным краем, желтовато- сероватого цвета,

200

шт. F-12

d - 2-2,5 мм

1000

Bид: Subtilis
шт. 265-76

Грамположительные неспорообразующие палочки правильной формы

2000

Семейство: Lactobacillaceae
Род: Lactobacillus Вид: cazei шт. 21

Среда Рогози МПА

Желчь

7-8 суток 30 °C

Мелкие, круглые колонии. Глубинные колонии с выростими

КМ препарата "Байкал"

Факультативные анаэробные грамотрицательные палочки

ВЗ

Семейство: Enterobacteriaceae Род: Esherihia
Вид: соli. шт. 1864

Среда Эндо

Ампициллин
200 мкг/1 мл среды

1 сутки
27 °C

Выпуклые, с блестящей поверхностью, ровными краями, легко эмульгирующие в солевом растворе, не пигментированные

ГИЖ

ВЗ

шт. 472-Т23

ВЗ

шт. ТДГ-6

ВЗ

шт. 436

Актиномицеты и родственные микроорганизмы. Группа коринеформных бактерий

Грамположительные неспорообразующие палочки неправильной формы

100

Семейство: Actinomycetaceae Род: Actinomyces Вид: rozeolus
шт. Z-219

Кровяной агар МСЭА, среда Гаррода

7-14 суток

"Паукообразная" колония с многочисленными ветвящимися нитями

Отбор в жидкостный поглотитель

3000

Семейство: Corynebacteriaceae Pод: Corynebacterium Вид: glutamicum
шт. ВКПМ-B5115

МПА

Грамицидин
10 мкг/мл среды

3 суток
32 °C

Желтоватого цвета с ровным краем, d не более 5 мм

1000

шт. ВСБ206-L

МПА

Грамицидин 50 мкг/мл

3 суток
32 °C

Желтоватые или желтые с ровным краем, d - 5мм

5000

Семейство: Brevibacteriaceae Род: Brevibacterium Вид: flavum
шт. ВНИИ Генетика 50-72(ВКПМ-B37-57)

Агар Хоттингера

3 суток
32 °С

Серовато-белые или кремовые, круглые, выпуклые, с ровным краем, влажно блестящие, d - Змм

Для роста нуждаются в тиамине

ВЗ

Вид: lactofermentum шт. НИТИА-89

Агар Хоттингера

3 суток 29-31 °C

Твердые, крупные, кремового цвета

Нокардиоформные актиномицеты

200

Семейство: Nocardiaceae
Род: Nocardia
Вид: mediterranii

САС (Красильникова, Гаузе1) и органические АС

Амфотерицин В
5 мкг/мл

8-12 суток 28 °C

Крупные, чашевидные или плоские складчатые, крошащиеся. Воздушный мицелий отсутствует. Растворимый пигмент на разных средах от зеленовато-бурого до ржавого или красновато- коричневого

Ускоренный метод основан на способности выделять рифамицин, который образует зоны задержки роста тест-культуры (St. Aureus 209 3)

5000

РНСП Род: Rhodoсoсcus
Вид: eritropolis
шт. 367-2, 367-6

АС Раймонда

Нефть или нефтепродукты
2 мл/100 мл среды

4 суток
30-32 °C

Оранжевые или ярко-оранжевые, круглые, выпуклые с ровным краем, блестящие

КМ препарата "Деваройл"

5000

Вид: maris шт. 367-5

Картофельный агар

Нефть или нефтепродукты
2 мл/100 мл среды

4 суток
30-32 °C

Ярко-оранжевые, круглые, выпуклые с ровным краем, блестящие

КМ препарата "Деваройл"

5000

Вид: ruber шт.1418 (ВКМ Ас 1513 D)33

Картофельный агар

4 суток
30 °C

Красные, круглые, выпуклые, слизистые

Актинопланы

Семейство: Micromonosporaceae Род: Micromonospora Вид: atratavinosa
Sp. Nov. 1573
шт. 184 R

САС Гаузе1

Амфотерицин В
20 мкг/1 мл среды сизомицин
2000 мкг/мл среды

10-12 суток
37 °C

Черные, выпуклые, со складчатой поверхностью,
d - 3-5 мм, воздушного мицелия не образуют

Черный или темно- коричневый пигмент

500

Вид: purpurea Var Violaceae

САС Гаузе1

Амфотерицин В
10 мкг/мл среды

10 суток 35 °С

Поднимаются круто от поверхности среды, хорошо развит септированный мицелий

Розовый или розоватый пигмент

Стрептомицеты и близкие к ним роды

500

Семейство: Streptomycetaceae Род: Streptomyces Вид: aureofaciens
шт. 0,19 (8)

Среда Хоттингера

Амфотерицин В
20 мкг/мл среды

10-12 сут
28 °C

Обильный воздушный мицелий серого цвета. Колонии плоские, слабо складчатые, с кратером в центре

Отбор в жидкостный поглотитель

500

шт. STR 2255

Округлые, выпуклые, серого цвета, с хорошо развитым воздушным мицелием, выделяют в среду темный пигмент

Отбор в жидкостный поглотитель. Ускоренный метод - учет зон задержки роста тест-культуры Bac. Subtilis на агаре Хоттингера

300

Вид: cinnamonensis шт. НИЦБ 109

ISP на основе агара Difco

Олеандомицин или линкомицин
15 мкг/мл среды

3-4 сут
28 °C

Серо-белые, округлые, радиально-
складчатые, с фестончатым краем и выпуклым более темным центром

Отбор в жидкостный поглотитель

300

Вид: eritreus шт. 851

Среда ЭР-1

Эритромицина основание (фосфат) 250-500 мкг/мл среды

10-14 сут
32 °C

Колонии с обильным воздушным мицелием, труднофрагмен-
тируемым. Вегетативные гифы 0,5-2,0 мкм в диаметре

Отбор в жидкостный поглотитель. Ускоренный метод основан на способности продуцировать антибиотик, который определяется по задержке зон роста тест-культуры (Bac. Subtilis 6633)

500

Вид: kanamyceticus

Среда Гаузе1

Амфотерицин В
10 мкг/мл среды

12 сут
28 °C

Округлые, плоские, d - 6 мм. Воздушный мицелий белый, обильный, субстратный - светло-коричневый

Отбор в жидкостный поглотитель. Ускоренный метод основан на способности продуцировать антибиотик, который определяется по задержке зон роста тест-культуры Bac. Subtilis ATCC 6633 (споры)

500

Вид: noursei шт.153/55

Крахмально- аммиачная среда

Амфотерицин В
10 мкг/мл среды

5 сут
27 °C

Белые с раздельной складчатостью, приподнятым центром, плоским волнистым краем. Воздушный мицелий серого цвета

Отбор в жидкостные поглотители

300

Вид: rimosus
шт. 1-43

АС с кукурузным экстрактом и картофельным крахмалом

Амфотерицин В
20 мкг/мл среды

8-12 сут
27 °C

Радиально складчатые, в центре - кратер, субстратный мицелий - коричневый, воздушный - светло-серый,
хорошо развит

Отбор в жидкостный поглотитель. Ускоренный метод основан на выделении в среду антибиотика и задержке зон роста тест-культуры (Bac. Subtilis вар. L2)

ВЗ

Род: Streptoverticillium
Вид: griseocameum

САС

Неомицин, лизоцим

8 сут
25-30 °C

Небольшие обособленные, дымка воздушного мицелия бархатная или хлопьевидная, розовато-бежевого цвета с сиреневым оттенком

Отбор в жидкостные поглотители. Розовато-
бежевый пигмент

Микобактерии

2000

Семейство: Mycobacteriасeае Род: Mycobacterium Вид: species
шт. В 3805

Кукурузно- мучной глицериновый агар

7 сут 35-40 °C

Воздушного мицелия не образует

Возможно образование пигмента

Грибы и дейтеромицеты

500

Род: Acrimonium
Вид: chrizogenum
шт. 298-А

АС/обрат, 1/1

Стрептомицин
500 мкг/мл среды

9-11 суток 28 °C

Выпуклые, правильно-
складчатые, белого цвета, с зубчатыми краями

Ускоренный метод основан на способности выделять протеазу, которую выявляют по образованию зон просветления среды вокруг колоний

200

Род: Candida
Вид: Famata
шт. ВСБ-641

Сусло-агар

Дрожжевой гидролизат. Стрептомицин
50 ЕД/1 мл среды

2-3 суток 32-34 °C

Однородные, гладкие, белые, с ровным краем

При посеве по трубочкам Эйнгорна с дрожжевой водой и глюкозой брожения нет

Вид: lipolitica шт. 367-3

Картофельный агар, МПА, сусло-агар, минеральная среда Раймонда

Нефтепродукты
2 мл/100 мл среды

2 суток 30-32 °C

Беловатые, матовые, плоские, край волнистый, образует псевдомицелий

Отбор в жидкостные поглотители, КМ препарата "Деваройл"

100

Вид: tropicalis
шт. ВСБ-928

Картофельный агар САС

З суток
30 °C

Круглые, беловатые, на 3-4 день псевдомицелий

Отбор в жидкостные поглотители

100

Вид: Utilis
шт. ВСБ-651

Картофельный агар, сусло-агар

2 суток
30 °C

Белые, матовые, образует псевдомицелий

Отбор в жидкостные поглотители

500

Род: Fuzidium
Вид: coccineum
шт. 108

Сусло-агар, среда N 9 (ГФ Х)

Амфотерицин В 10 мкг/мл среды

9-14 суток 24 °C

Круглые, складчатые, серовато-розовые с белым, слегка фестончатым краем, мицелий выражен слабо

Ускоренный метод основан на выделении фузидиевой кислоты, подавляющей рост тест-культуры (Вас, Мyсоides HB2)

500

Род: Penicilium
Вид: chrisogenum

Агаризованная среда Чапека, Райстрика

Канамицин
25-50 мкг/мл среды (неомицин, сизомицин)

9-10 суток 24 °C

Бежевые, складчатые, центр приподнят, края неровные, обратная сторона светло-коричневая

Ускоренный метод основан на выделении бензилпенициллина, подавляющего рост тест-культуры (St. Aureus 209 P)

500

Семейство: Entomophtorасеае Род: Entomophtorа

Сабуро- декстрозный агар

Карбенициллин
150 мкг/мл среды, амфотерицин -
10 мкг, полимиксин М 250 мкг

4-5 суток 25 °С

Округлые, складчатые, приподнятые к центру, серовато-
кремового цвета

200

Род: Рichia
Вид: membrana faciens

Кукурузный агар

3 суток 30-34 °C

Кремовато-серого цвета, бархатистые, край лопастной, поверхность мучнистая, хорошо развитый ветвящийся псевдомицелий

Отбор в жидкостные поглотители

500

Род: Trichoderma
Вид: reesei
шт. NIBT 18.2-33

Сусло-агар

Карбенициллин 150 мкг/мл среды

4-5 суток 28-30 °С

Круглые, с гладкой подошвой, слегка приподнятые над поверхностью среды, край волнистый, образует мицелий

Отбор в жидкостные поглотители. Выделяет ярко-желтый пигмент

    Текст документа сверен по:
    официальное издание
    М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора
    Минздрава России, 2001