МУК 4.1.1921-04
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Определение остаточных количеств Пираклостробина
в воде, почве, ягодах винограда, виноградном соке и яблоках
методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Дата введения: с момента утверждения
1. РАЗРАБОТАНЫ Московской сельскохозяйственной академией им. К.А.Тимирязева, Учебно-научным центром "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" (авторы В.А.Калинин, А.В.Довгилевич, Е.В.Довгилевич, Н.В.Устименко).
2. УТВЕРЖДЕНЫ Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 11 августа 2004 г.
3. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.
1. Вводная часть
Фирма производитель: БАСФ, Германия.
Торговое название: Кабрио, Кабрио Топ.
Название действующего вещества по ИСО: Пираклостробин.
Название действующего вещества по ИЮПАК: метил-N-{2-[1-(4-хлорфенил)-1Н-пиразол-3-илоксиметил]фенил} (N-метокси)карбамат.
Структурная формула:
Эмпирическая формула: CHCINО
Молекулярная масса: 387,8
Химически чистый Пираклостробин представляет собой белый или светло-бежевый кристаллический порошок без запаха.
Температура плавления: 63,7-65,2 °С.
Давление паров 2,6х10 мПа (при 20 °С).
Коэффициент распределения октанол-вода - 3,99 (22 °C).
Растворимость в воде - 1,9 мг/л (при 20 °С).
Растворимость в органических растворителях (г/л при 20 °С): ацетон - более 200, ацетонитрил - более 980, изопропанол - 40, метанол - 140.
Сохраняется в водной среде более 30 дней при рН 5,7 и температуре 25 °С; подвержен фотолизу в воде - ДТ составляет менее 2 ч. В почве период полураспада составляет 2-37 дней.
Краткая токсикологическая характеристика. Пираклостробин относится к малоопасным по острой оральной (СД для крыс - более 5000 мг/кг), дермальной токсичности (СД для крыс - более 2000 мг/кг) и умеренно опасным веществам по ингаляционной токсичности (CK 4 ч для крыс 4000-7000 мг/м). Он не вызывает раздражения слизистых оболочек глаз и кожи и не обладает мутагенным, тератогенным, эмбриотоксическим, канцерогенным действием.
В России гигиенические нормативы не установлены.
Область применения препарата. Пираклостробин - фунгицид из группы стробилуринов контактного и глубинного действия с длительным защитным эффектом. Высокоэффективен против возбудителей ложной и мучнистой настоящей росы, в т.ч. против рас возбудителя, устойчивых к Металаксилу и производным триазола.
Рекомендуется для борьбы с фитопатогенными грибами на зерновых, овощных и плодовых культурах с нормой расхода 50-250 г д.в./га.
2. Методика определения остаточных количеств Пираклостробина
в воде, почве, ягодах винограда, виноградном соке и яблоках
методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
2.1. Основные положения
2.1.1. Принцип метода
Методика основана на определении Пираклостробина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистке перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и на концентрирующих патронах на основе силикагеля (Диапак С, Диапак-Амин и Диапак С16). Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.
2.1.2. Метрологическая характеристика метода
Метрологическая характеристика метода представлена в табл.1 и 2.
Таблица 1
Метрологическая характеристика метода определения
Метрологические параметры, =0,95, =20 | |||||
Анализируемый объект |
Предел обнаружения, мг/кг (мг/л) |
Диапазон определяемых концентраций, мг/кг (мг/л) |
Среднее значение определения, % |
Стандартное отклонение, |
Доверительный интервал среднего результата, %, ± |
Вода |
0,005 |
0,005-0,05 |
98,1 |
2,86 |
1,34 |
Почва |
0,01 |
0,01-0,10 |
76,8 |
2,17 |
1,01 |
Ягоды винограда |
0,02 |
0,02-0,20 |
75,3 |
2,24 |
1,05 |
Виноградный сок |
0,02 |
0,02-0,20 |
84,6 |
2,69 |
1,26 |
Яблоки |
0,02 |
0,02-0,20 |
75,2 |
1,42 |
0,664 |
Таблица 2
Полнота определения Пираклостробина в воде, почве, ягодах винограда, виноградном соке
и яблоках (5 повторностей для каждой концентрации)
Среда |
Внесено, мг/кг (мг/л) |
Обнаружено, мг/кг (мг/л) |
Доверительный интервал, ± |
Полнота определения, % |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
Вода |
0,005 |
0,0048 |
0,00027 |
96,0 |
|
0,010 |
0,0098 |
0,00018 |
98,0 |
|
0,020 |
0,0197 |
0,00074 |
98,5 |
|
0,050 |
0,0499 |
0,00082 |
99,8 |
Среднее |
|
|
|
98,1 |
Почва |
0,01 |
0,0076 |
0,00026 |
76,0 |
|
0,02 |
0,0154 |
0,00052 |
77,0 |
|
0,05 |
0,0394 |
0,00112 |
78,8 |
|
0,10 |
0,0754 |
0,00112 |
75,4 |
Среднее |
|
|
|
76,8 |
Ягоды винограда |
0,02 |
0,0149 |
0,00038 |
74,5 |
|
0,04 |
0,0296 |
0,00116 |
74,0 |
|
1,0 |
0,0764 |
0,00227 |
76,4 |
|
2,0 |
0,1525 |
0,00650 |
76,3 |
Среднее |
|
|
|
75,3 |
Виноградный сок |
0,02 |
0,0166 |
0,00044 |
83,0 |
|
0,04 |
0,0333 |
0,00141 |
83,3 |
|
1,0 |
0,0840 |
0,00187 |
84,0 |
|
2,0 |
0,1758 |
0,00165 |
87,9 |
Среднее |
|
|
|
84,6 |
Яблоки |
0,02 |
0,0151 |
0,00041 |
75,5 |
|
0,04 |
0,0301 |
0,00097 |
75,3 |
|
1,0 |
0,0756 |
0,00156 |
75,6 |
|
2,0 |
0,1490 |
0,00187 |
74,5 |
Среднее |
|
|
|
75,2 |
2.1.3. Избирательность метода
В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых при выращивании яблок и винограда.
2.2. Реактивы, растворы, материалы и оборудование
2.2.1. Реактивы, материалы и растворы
Пираклостробин, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,9%, фирма БАСФ |
|
Ацетон, осч, 9-5 |
ТУ 2633-00-4-11291058-94 |
Ацетонитрил |
ТУ 6-09-3534-87 |
Вода бидистиллированная, деионизированная |
ГОСТ 7602-72 |
Гексан, ч |
ТУ 6-09-33-75 |
Калий марганцово-кислый, чда |
ГОСТ 20490-75 |
Кальций хлористый, хч |
ГОСТ 4161-76 |
Кислота серная концентрированная, ч |
ГОСТ 4204-77 |
Кислота соляная, концентрированная |
ГОСТ 857-88 |
Кислота уксусная, ледяная |
ГОСТ 61-75 |
Метилен хлористый, хч |
ТУ 6-09-2662-77 |
Натрия гидрокарбонат, хч |
ГОСТ 2156-76 |
Натрий серно-кислый, безводный, хч |
ГОСТ 4166-76 |
Натрий хлористый, хч |
ГОСТ 4233-77 |
Фосфора пентоксид, ч |
МРТУ 6-09-5759-69 |
Этиловый эфир уксусной кислоты, чда |
ГОСТ 223000-76 |
Концентрирующие патроны Диапак-Амин (0,6 г) |
ТУ 4215-002-05451931-94 |
Концентрирующие патроны Диапак-С (0,6 г) |
ТУ 4215-002-05451931-94 |
Концентрирующие патроны Диапак-С 16 (0,6 г) |
ТУ 4215-002-05451931-94 |
Фильтры бумажные, "красная лента" |
ТУ 6-09-1678-86 |
Фильтры для очистки растворителей, диаметром 20 мм, с отверстиями пор |
|
Перед началом эксперимента проверяют чистоту ацетонитрила, ацетона, гексана и хлористого метилена. Для этого досуха выпаривают на ротационном вакуумном испарителе 200 мл растворителя, добавляют в концентратор 1 мл ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора и хроматографируют при 270 нм. При недостаточной чистоте растворителей проводят их очистку.
Бидистиллят кипятят в течение 6 ч с марганцово-кислым калием, добавленным из расчета 1 г/л, и затем перегоняют.
Ацетон перегоняют над небольшим количеством перманганата калия (Гордон А., Форд Р. Спутник химика. М., 1976. С.438-439).
Ацетонитрил перегоняют.
Гексан встряхивают с концентрированной серной кислотой, промывают бледно-розовым раствором перманганата калия до тех пор, пока раствор не перестанет обесцвечиваться, затем промывают водой, сушат над безводным хлористым кальцием и перегоняют (Гордон А., Форд Р. Спутник химика. М., 1976. С.441).
Хлористый метилен встряхивают с концентрированной серной кислотой, промывают водным раствором карбоната натрия, водой, сушат над безводным хлористым кальцием и перегоняют над оксидом (V) фосфора (Гордон А., Форд Р. Спутник химика. М., 1976. С.440).
2.2.2. Приборы и оборудование
Хроматограф жидкостный Уотерс 510 с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны и чувствительностью не ниже 0,005 единиц адсорбции на шкалу или другой аналогичного типа |
|
|
Колонка хроматографическая стальная, длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, Symmetry Shield RP18, зернение 5 мкм, фирма Уотерс |
|
|
Предколонка хроматографическая стальная, Symmetry С 18, длиной 20 мм, внутренним диаметром 3,9 мм, зернение 5 мкм, фирма Уотерс |
|
|
Ванна ультразвуковая |
|
|
Весы аналитические ВЛА-200 или аналогичные |
|
ГОСТ 34104-80Е |
Весы лабораторные общего назначения, с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности ±0,038 г |
|
ГОСТ 19491-74 |
Воронки делительные на 250 и 500 мл |
|
|
Воронки конические стеклянные, диаметром 50-60 мм |
|
|
Колбы конические плоскодонные на 500 и 1000 мл |
|
ГОСТ 9737-70 |
Колбы мерные на 25, 50 и 100 мл |
|
|
Концентраторы грушевидные и круглодонные, объемом 50, 100 и 250 мл, КТУ-100-14/19 |
|
ГОСТ 10394-75 |
Микрошприц для жидкостного хроматографа на 50-100 мкл |
|
|
Насос водоструйный |
|
ГОСТ 10696-75 |
Пипетки мерные на 1,0; 2,0; и 5,0 мл |
|
ГОСТ 20292-74 |
Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М или аналогичный |
|
ТУ 25-11-917-74 |
Стаканы стеклянные на 100-500 мл |
|
ГОСТ 25366-80Е |
Аллонж прямой с отводом для вакуума для работы с концентрирующими патронами Диапак-Амин, Диапак-С, Диапак-С16. |
|
|
2.3. Подготовка к определению
2.3.1. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии
Хроматографическую колонку Symmetry Shield RP18 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 25 °С и скорости потока подвижной фазы 1 мл/мин 3-4 ч.
2.3.2. Приготовление стандартных растворов
Взвешивают 100 мг Пираклостробина в мерной колбе объемом 100 мл. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом (стандартный раствор с концентрацией Пираклостробина 1,0 м г/мл). Затем 1,0 мл стандартного раствора с концентрацией 1,0 мг/мл отбирают пипеткой в мерную колбу объемом 100 мл и доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании (стандартный раствор с концентрацией Пираклостробина 10,0 мкг/мл). Стандартные растворы можно хранить в холодильнике в течение трех месяцев. Методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 5,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/мл, и используют их для хроматографического поведения и внесения в контрольные образцы.
2.3.3. Приготовление растворов для жидкостной хроматографии
Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанные ацетонитрил и очищенную воду.
Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ
В плоскодонную колбу объемом 1 л помещают 600 мл ацетонитрила, 300 мл очищенной воды и 1 мл ледяной уксусной кислоты. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 мл/мин в течение 5 мин, после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 мин.
2.3.4. Построение калибровочного графика
Для построения калибровочного графика вводят в хроматограф последовательно 3 раза по 20 мкл каждого из стандартных растворов, содержащих Пираклостробин с концентрациями 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/мл, измеряют площадь пиков, рассчитывают среднее значение площади пика для каждой концентрации и строят график зависимости площади пика от концентрации Пираклостробина.
2.3.5. Подготовка концентрирующего патрона Диапак-С для очистки экстракта
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 мл/мин.
Патрон Диапак-С устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 мл (используют как емкость для элюентов).
Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают последовательно 10 мл смеси гексан-ацетон в соотношении 1:1 и 10 мл гексана. Элюат отбрасывают.
Нельзя допускать высыхания поверхности патрона!
2.3.5.1. Проверка хроматографического поведения Пираклостробина на концентрирующем патроне Диапак-С.
Из стандартного раствора Пираклостробина в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/мл, отбирают 1 мл, помещают в круглодонную колбу объемом 100 мл и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетона, помещают на 10 с в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 мл гексана, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила и хроматографируют. Концентратор тщательно обмывают двумя порциями по 10 мл смеси гексан-ацетон в соотношении 9:1 и также вносят на патрон. Элюат после прохождения каждой порции собирают в концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила и хроматографируют. Определяют фракции, содержащие Пираклостробин, объединяют их и рассчитывают полноту его смыва с колонки.
2.3.6. Подготовка концентрирующего патрона Диапак-С16 для очистки экстракта
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 мл/мин. При работе на патронах Диапак-С16 используют очищенную воду.
Патрон Диапак-С16 устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 мл (используют как емкость для элюентов).
Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают последовательно 10 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:1 и 20 мл воды. Элюат отбрасывают.
Нельзя допускать высыхания поверхности патрона!
2.3.6.1. Проверка хроматографического поведения Пираклостробина на концентрирующем патроне Диапак-С16.
Из стандартного раствора Пираклостробина в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/мл, отбирают 1 мл, помещают в круглодонную колбу объемом 100 мл и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетонитрила, помещают на 10 с в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 мл воды, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила и хроматографируют. Концентратор обмывают 10 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:4 и смесь вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила и хроматографируют. Концентратор обмывают 10 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:2 и вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила и хроматографируют. Концентратор обмывают тремя порциями по 10 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:1 и также вносят на патрон. Элюат после прохождения каждой порции собирают в концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила и хроматографируют. Определяют фракции, содержащие Пираклостробин, объединяют их и рассчитывают полноту его смыва с колонки.
2.3.7. Подготовка концентрирующего патрона Диапак-Амин для очистки экстракта
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 мл/мин. При работе на патронах Диапак-Амин используют очищенную воду.
Патрон Диапак-Амин устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 мл (используют как емкость для элюентов).
Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают последовательно 10 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:1 и 20 мл воды. Элюат отбрасывают.
Нельзя допускать высыхания поверхности патрона!
2.3.7.1. Проверка хроматографического поведения Пираклостробина на концентрирующем патроне Диапак-Амин.
Из стандартного раствора Пираклостробина в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/мл, отбирают 1 мл, помещают в круглодонную колбу объемом 100 мл и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетонитрила, помещают на 10 с в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 мл воды, тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила и хроматографируют. В исходный концентратор добавляют 1 мл ацетонитрила, стенки колбы тщательно обмывают, добавляют 9 мл воды, тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила и хроматографируют. Процедуру повторяют еще раз. Определяют фракции, содержащие Пираклостробин, объединяют их и рассчитывают полноту его смыва с колонки.
2.4. Отбор проб
Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79), утвержденными заместителем Главного государственного санитарного врача СССР.
2.5. Описание определения
2.5.1. Вода
Пробу воды объемом 100 мл помещают в делительную воронку емкостью 250 мл. Затем в делительную воронку добавляют 30 мл хлористого метилена и интенсивно встряхивают ее 2 мин. После полного разделения фаз нижний слой (хлористый метилен), содержащий Пираклостробин, собирают в концентратор объемом 250 мл, пропуская его через слой безводного сульфата натрия. Водный экстракт возвращают в делительную воронку и экстрагируют Пираклостробин еще двумя порциями хлористого метилена по 30 мл, интенсивно встряхивая делительную воронку 2 мин. Каждый раз после полного разделения фаз нижний слой (хлористый метилен), содержащий Пираклостробин, собирают в концентратор, пропуская его через слой безводного сульфата натрия. Выпаривают объединенный экстракт досуха. Сухой остаток растворяют в 5 мл ацетонитрила и аликвоту объемом 20 мкл вводят в хроматограф.
2.5.2. Почва
2.5.2.1. Экстракция и предварительная очистка. Образец почвы массой 20 г помещают в коническую колбу объемом 250 мл, прибавляют 10 мл 0,1%-ной соляной кислоты и выдерживают при комнатной температуре 10 мин. Затем к содержимому колбы прибавляют 30 мл ацетонитрила и экстрагируют Пираклостробин 5 мин на ультразвуковой ванне и дополнительно 5 мин на механическом встряхивателе. После экстракции пробу центрифугируют 5 мин при скорости 3000 об./мин и супернатант переносят через бумажный фильтр "красная лента" в коническую колбу объемом 250 мл с 10 г поваренной соли. Экстракцию повторяют еще 3 раза, используя по 30 мл ацетонитрила и экстрагируя по 5 мин на ультразвуковой ванне и дополнительно 5 мин на механическом встряхивателе. После центрифугирования и фильтрования экстракты объединяют в конической колбе с 10 г поваренной соли, перемешивают и оставляют на 10 мин при комнатной температуре. Затем экстракт переносят в делительную воронку объемом 250 мл и выделившийся нижний водный слой отбрасывают. Верхний ацетонитрильный слой пропускают в концентратор объемом 250 мл через слой безводного сульфата натрия и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
К сухому остатку в концентраторе добавляют 5 мл ацетона и тщательно обмывают его стенки, затем туда же добавляют 100 мл дистиллированной воды и 5 г поваренной соли и перемешивают до полного растворения соли. Полученную смесь переносят в делительную воронку объемом 250 мл, концентратор обмывают 30 мл гексана, помещают в ту же делительную воронку и интенсивно встряхивают ее 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний водный слой сливают в коническую колбу объемом 250 мл, а верхний гексановый слой - в химический стакан объемом 100 мл. Затем водную фазу возвращают в делительную воронку и экстрагируют Пираклостробин еще двумя порциями гексана объемом по 30 мл. Гексановые экстракты объединяют, переносят в делительную воронку, добавляют туда же 50 мл 5%-ного водного раствора гидрокарбоната натрия и интенсивно встряхивают 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний водный слой отбрасывают, а гексановый экстракт промывают еще раз 50 мл 5%-ного водного раствора гидрокарбоната натрия, интенсивно встряхивая делительную воронку 2 мин. Гексановый экстракт переносят в концентратор объемом 250 мл, пропуская через слой безводного сульфата натрия. Осушитель обмывают 10 мл гексана, объединяют смыв с основным экстрактом и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
2.5.2.2. Очистка на концентрирующем патроне Диапак-Амин. Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетонитрила, помещают на 10 с в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 мл воды, тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в чистый концентратор. В исходный концентратор добавляют еще раз 1 мл ацетонитрила, стенки колбы тщательно обмывают, добавляют 9 мл воды, тщательно перемешивают и полученный раствор вновь вносят на патрон. Элюаты объединяют и подвергают дальнейшей очистке.
2.5.2.3. Повторная очистка и очистка на патроне Диапак-С16. К объединенному элюату добавляют 100 мл дистиллированной воды, 5 г поваренной соли и перемешивают до полного растворения соли. Затем полученную смесь переносят в делительную воронку объемом 250 мл, концентратор обмывают 30 мл гексана, помещают смыв в ту же делительную воронку и интенсивно встряхивают 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний водный слой помещают в коническую колбу объемом 250 мл, а верхний гексановый слой собирают в концентратор объемом 250 мл, пропуская через слой безводного сульфата натрия. Экстракцию Пираклостробина повторяют еще двумя порциями гексана по 30 мл, экстракты объединяют, осушитель обмывают 10 мл гексана, объединяют смыв с основным экстрактом и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетонитрила, помещают на 10 с в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 мл воды, тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат отбрасывают.
Концентратор обмывают 10 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:4 и вносят на патрон. Элюат отбрасывают.
Концентратор обмывают 10 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:2 и вносят на патрон. Элюат отбрасывают.
Пираклостробин элюируют 20 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:1. Элюат собирают в концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила и аликвоту 20 мкл вводят в хроматограф.
2.5.3. Яблоки
2.5.3.1. Экстракция и предварительная очистка. Образец измельченных на терке яблок массой 10 г помещают в коническую колбу объемом 250 мл, прибавляют 30 мл ацетонитрила и экстрагируют 5 мин на ультразвуковой ванне и дополнительно 5 мин на механическом встряхивателе. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр "красная лента" в коническую колбу объемом 250 мл с 5 г поваренной соли. Экстракцию повторяют еще 3 раза, используя по 30 мл ацетонитрила и экстрагируя по 5 мин на ультразвуковой ванне и дополнительно 5 мин на механическом встряхивателе. После фильтрования экстракты объединяют, перемешивают и оставляют на 10 мин при комнатной температуре.
Затем экстракт переносят в делительную воронку объемом 250 мл и выделившийся нижний водный слой отбрасывают. Верхний ацетонитрильный слой пропускают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 мл и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
К сухому остатку в концентраторе добавляют 5 мл ацетона и тщательно обмывают его стенки, затем туда же добавляют 100 мл дистиллированной воды, 5 г поваренной соли и перемешивают до полного растворения соли. Полученную смесь переносят в делительную воронку объемом 250 мл, концентратор обмывают 30 мл гексана, который помещают в ту же делительную воронку и интенсивно встряхивают ее 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний водный слой помещают в коническую колбу объемом 250 мл, а верхний гексановый слой собирают в концентратор объемом 250 мл, пропуская через слой безводного сульфата натрия. Водный слой возвращают в делительную воронку и экстрагируют Пираклостробин еще дважды порциями гексана объемом по 30 мл. Водный слой отбрасывают, а гексановый экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия и объединяют в концентраторе объемом 250 мл. Осушитель обмывают 10 мл гексана, объединяют смыв с основным экстрактом и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
К сухому остатку в концентраторе прибавляют 2 мл ацетона и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор прибавляют 50 мл гексана, тщательно перемешивают и переносят в сухую делительную воронку объемом 250 мл. Пираклостробин экстрагируют из ацетоново-гексановой смеси тремя порциями ацетонитрила объемом по 20 мл, интенсивно встряхивая делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой пропускают в концентратор объемом 100 мл через слой безводного сульфата натрия и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
2.5.3.2. Очистка на патроне Диапак-С. Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетона, помещают на 10 с в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 мл гексана, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Концентратор тщательно обмывают 10 мл смеси гексан-ацетон в соотношении 9:1 и также вносят на патрон. Элюаты объединяют и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила и аликвоту 20 мкл вводят в хроматограф.
2.5.4. Виноград (ягоды)
2.5.4.1. Экстракция и предварительная очистка. Образец измельченных ягод винограда массой 10 г помещают в коническую колбу объемом 250 мл, прибавляют 30 мл ацетонитрила и экстрагируют 5 мин на ультразвуковой ванне и дополнительно 5 мин на механическом встряхивателе. Экстракт переносят через бумажный фильтр "красная лента" в коническую колбу объемом 250 мл с 5 г поваренной соли. Экстракцию повторяют еще 3 раза, используя по 30 мл ацетонитрила и экстрагируя по 5 мин на ультразвуковой ванне и дополнительно 5 мин на механическом встряхивателе. После фильтрования экстракты объединяют в конической колбе с 5 г поваренной соли, перемешивают и оставляют на 10 мин при комнатной температуре. Затем экстракт переносят в делительную воронку объемом 250 мл и выделившийся нижний водный слой отбрасывают. Верхний ацетонитрильный слой возвращают в делительную воронку, добавляют туда же 50 мл насыщенного раствора поваренной соли и интенсивно встряхивают 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний водный слой с выпавшими в осадок кристаллами соли отбрасывают. Верхний ацетонитрильный слой пропускают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 мл и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. К сухому остатку в концентраторе добавляют 5 мл ацетона и тщательно обмывают его стенки. Затем добавляют 100 мл дистиллированной воды, 5 г поваренной соли и перемешивают до полного растворения соли. Полученную смесь переносят в делительную воронку объемом 250 мл, концентратор обмывают 30 мл гексана, который помещают в ту же делительную воронку и интенсивно встряхивают 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний водный слой помещают в коническую колбу объемом 250 мл, а верхний гексановый слой собирают в сухую делительную воронку объемом 250 мл, пропуская через слой безводного сульфата натрия. Водный слой возвращают в делительную воронку и экстрагируют Пираклостробин еще двумя порциями гексана объемом по 30 мл. Водный слой отбрасывают, а гексановый экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия и объединяют в делительной воронке, осушитель обмывают 10 мл гексана и объединяют смыв с основным экстрактом. Пираклостробин извлекают из гексана тремя порциями ацетонитрила объемом по 20 мл, интенсивно встряхивая делительную воронку 2 мин. После разделения слоев нижний ацетонитрильный слой с эмульсией собирают в стакан объемом 100 мл, выдерживают 5 мин при комнатной температуре, затем возвращают в делительную воронку и после полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой собирают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 100 мл и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
2.5.4.2. Очистка на патроне Диапак-С. Сухой остаток в концентраторе растворяют в 1 мл ацетона, тщательно обмывая стенки колбы, добавляют 9 мл гексана и очищают на патроне Диапак-С, как указано в п.2.5.3.2. После очистки элюат выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
2.5.4.3. Очистка на патроне Диапак-С16. Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетонитрила, помещают на 10 с в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 мл воды, тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат отбрасывают.
Концентратор обмывают 10 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:4 и вносят на патрон. Элюат отбрасывают.
Концентратор обмывают 10 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:2 и вносят на патрон. Элюат отбрасывают.
Пираклостробин элюируют 20 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:1. Элюат собирают в концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила и аликвоту 20 мкл вводят в хроматограф.
2.5.5. Виноградный сок
Помещают 10 мл виноградного сока в делительную воронку объемом 250 мл, туда же добавляют 100 мл дистиллированной воды, 5 г поваренной соли и перемешивают до полного растворения соли. Затем в делительную воронку добавляют 30 мл гексана и интенсивно встряхивают ее 2 мин. После разделения фаз в делительной воронке нижний водный слой помещают в коническую колбу объемом 250 мл, верхний гексановый слой с эмульсией собирают в химический стакан объемом 250 мл. Водный слой возвращают в делительную воронку и экстрагируют Пираклостробин еще двумя порциями гексана объемом по 30 мл. Водный слой отбрасывают, а гексановый экстракт с эмульсией объединяют в химическом стакане и переносят в делительную воронку. Затем туда же добавляют 50 мл насыщенного раствора поваренной соли и интенсивно встряхивают 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний водный слой отбрасывают, а гексановый экстракт собирают в сухую делительную воронку объемом 250 мл, пропуская через слой безводного сульфата натрия. Осушитель обмывают 10 мл гексана и объединяют смыв с основным экстрактом. Пираклостробин экстрагируют из гексана тремя порциями ацетонитрила объемом по 20 мл, интенсивно встряхивая делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 100 мл и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
Далее проводят очистку, как указано в разделах 2.5.4.2 и 2.5.4.3.
2.6. Условия хроматографирования и обработка результатов
2.6.1. Условия хроматографирования
Хроматограф "Waters" или другой с аналогичными характеристиками с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны.
Колонка стальная Symmetry Shield RP18, 4,6 мм х 25 см, зернением 5 мкм.
Предколонка стальная Symmetry RP18, 3,9 мм х 2 см, зернением 5 мкм.
Температура колонки: 25 °С.
Подвижная фаза: ацетонитрил-вода-ледяная уксусная кислота в соотношении 600:300:1.
Длина волны 270 нм.
Время удерживания Пираклостробина 9,9-10,6 мин.
Чувствительность 0,005 ед. оптической плотности на шкалу.
Объем вводимой пробы 20 мкл.
Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2-20 нг.
2.6.2. Обработка результатов анализа
Содержание Пираклостробина рассчитывают по формуле:
где
- содержание Пираклостробина в пробе, мг/кг или мг/л;
- высота (площадь) пика стандарта, мм;
- высота (площадь) пика образца, мм;
- концентрация стандартного раствора, мкг/мл;
- объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;
- масса анализируемого образца, г (мл);
- содержание Пираклостробина в аналитическом стандарте, %.
3. Требования техники безопасности
Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.
Текст документа сверен по:
официальное издание
М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора
Минздрава России, 2005