МУК 4.2.1775-03

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма
Trichoderma viride 44-11-62/3 - продуцента комплекса целлюлолитических
ферментов в атмосферном воздухе населенных мест

Дата введения 2003-12-01

    УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 24 октября 2003 г.
    
    

1. Общие положения и область применения

    
    Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма - Trichoderma viride 44-11-62/3 - продуцента комплекса целлюлолитических ферментов (целлюлаза, ксиланаза) в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 м воздуха.
    
    Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 "Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ" и Р 8.563-96 "Методики выполнения измерений".
    
    Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.
    
    Методические указания одобрены и рекомендованы секцией "Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды" Проблемной комиссии "Научные основы гигиены окружающей среды".
    
    

2. Характеристика штамма-продуцента Trichoderma viride 44-11-62/3

    
    На агаризованной среде сусло-агар (содержание солодового сусла 5-6° по Баллингу) на 5 день развития микроорганизм образует характерные колонии до 5,0-5,5 см в диаметре с гладкой подошвой, слегка приподнятые над поверхностью среды, не врастающие в агар, с волнистым краем, пушистым воздушным мицелием, который покрыт спорами лимонно-желтого цвета. На 3 день развития в среду выделяется ярко-желтый пигмент лимонного оттенка. Гифы мицелия бесцветные, септированные, многократно ветвистые.
    
    Систематическое положение микроорганизма
    

    
    Штамм Trichoderma viride 44-11-62/3 получен во ВНИИбиотехнология в лаборатории Биосинтеза ферментов методом индуцированной селекции с применением этиленимина и нитрозометилмочевины из исходной культуры Trichoderma viride 44 - продуцента целлюлазы и депонирован в ЦМПМ ВНИИгенетика.
    
    Штамм-продуцент синтезирует высокоактивный комплекс целлюлолитических ферментов для производства ферментного препарата целловиридин Г3х. Максимальная активность целлюлазы составляет 35 ед/мл, ксиланазы - 42 ед/мл.
    
    Штамм-продуцент растет на жидких и агаризованных средах. Культивирование гриба происходит 5 суток при температуре 36-38 °С, затем 5 суток при комнатной температуре. Для размножения и хранения используется сусло-агар 5-6 °Б, рН среды - 5,0-6,0.
    
    Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе населенных мест - 200 кл/м, пометка А.
    
    

3. Пределы измерений

    
    Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток штамма-продуцента в атмосферном воздухе в диапазоне концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 м воздуха при доверительной вероятности 0,95.
    
    

4. Метод измерений

    
    Прямой метод измерения концентрации штамма-продуцента основан на аспирации из воздуха микробных клеток (спор, фрагментов мицелия) на поверхность плотной питательной среды сусло-агар и подсчета выросших колоний по культурально-морфологическим признакам на день развития.
    
    Косвенный метод измерения концентрации штамма-продуцента основан на аспирации из воздуха микробных клеток на поверхность плотной питательной селективной среды и подсчета выросших колоний по зонам просветления, образующихся вокруг каждой колонии штамма, как результат продукции целлюлазы на среде с окрашенной целлюлозой.
    
    

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

    
    При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.
    

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

    
5.2. Реактивы, растворы

    
6. Требования безопасности

    
    При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в атмосферном воздухе соблюдают следующие требования:
    
    6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.
    
    6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.
    
    6.3. "Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977).
    
    6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
    
    

7. Требования к квалификации операторов

    
    К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
    
    

8. Условия измерений

    
    Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20±5 °С), атмосферном давлении 630-800 мм рт.ст. и влажности воздуха не более 80%.
    
    

9. Проведение измерения

    
9.1. Условия отбора проб воздуха

    
    Для определения концентрации клеток штамма-продуцента воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (5-20 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента (прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента, косвенный - до 30-50 колоний на чашке).
    
    Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
    

9.2. Выполнение анализа

    
    При выполнении анализа воздуха прямым методом среду сусло-агар расплавляют, остужают до 50-60 °С, добавляют молочной кислоты из расчета 0,4 мл на 100 мл среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.
    
    При выполнении анализа воздуха косвенным методом селективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют 50 мг/л бенгальского розового, растворенного в 1 мл диметилсульфоксида, тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Бенгальский розовый предназначен для специфического окрашивания целлюлозы и для ограничения разрастания колоний на чашках.
    
    Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.
    
    После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 42 °С (для интенсификации развития гриба). Через 3 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам и характерной пигментации среды (прямой метод) или зон просветления вокруг выросших колоний продуцента (косвенный метод), как результат продукции целлюлолитических ферментов на среде с окрашенной целлюлозой.
    
    

10. Вычисление результатов измерения

    
    Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м воздуха производят по формуле:

кл/м,

где - концентрация клеток продуцента в воздухе;
    
     - количество колоний продуцента, выросших на чашке;
    
    1000 - коэффициент пересчета на 1 м воздуха;
    
     - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

11. Оформление результатов измерений

    Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

Протокол N
количественного микробиологического анализа штамма-продуцента
Trichoderma viride 44-11-62/3 в атмосферном воздухе населенных мест

Результаты микробиологического анализа

    Ответственный исполнитель
    
    Научный руководитель
    
    

Список литературы

    
    1. Руководство по контролю загрязнения атмосферы: РД 52.04.186-89. М., 1991. 693 с.
    
    2. ГОСТ Р 8.563-96. ГСИ "Методики выполнения измерений".
    
    3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности. М., 1980. 27 с.
    
    4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. М., 1977. 7 с.
    
    5. ГОСТ 17.2.4.02-81 "Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ". М.: Изд-во стандартов, 1981. 3 с.
    
    6. Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. М.: МГУ. 122 с.


              
Текст документа сверен по:
официальное издание
Методы контроля. Микробиологические факторы.

Методические указания: [Сборник]
(МУК 4.2.1767-03 - МУК 4.2.1775-03). -
М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора
Минздрава России, 2004