МУК 4.1.1149-02

     
     
Методические указания


4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств Цимоксанила в воде, почве, зеленой массе
растений, клубнях картофеля, ягодах винограда, плодах огурца
хроматографическими методами

     
     
Дата введения 2003-01-01

     
     
     УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко
     
     

1. Вводная часть

     
     Фирма-производитель: Дюпон, США.
     
     Торговое название: Курзат.
     
     Название действующего вещества по ИСО: Цимоксанил.
     
     Название действующего вещества по IUPAC: 1-(2-циано-2-мето-ксииминоацетил)-3-этилмочевина.
          

          
     Химически чистый Цимоксанил представляет собой бесцветное кристаллическое вещество.
     
     Давление паров: 0,15 мПа при 20 °С
     
     Температура плавления: 160-161 °С.
     
     Коэффициент распределения н-октанол-вода : 0,59 (рН 5); 0,67 (рН 7).
     
     Растворимость в воде составляет 890 мг/л. Растворимость в органических растворителях (г/л): ацетон - 62,4; ацетонитрил - 57, бензол - 2, гексан - 1,85, диметилформамид - 185, метанол - 22,9, метилен хлорид - 133, н-октанол - 1,43, толуол - 5,29, хлороформ - 103, этилацетат - 28.
     
     Цимоксанил стабилен в интервале рН 2-5, в щелочных растворах быстро гидролизуется (ДТ - 149 дн. при рН 5, 34 ч при рН 7 и 31 мин при рН 9). В воде водоемов период полураспада составляет 1,8 дн.
     
     В почве Цимоксанил быстро разрушается под действием микроорганизмов. В тепличных условиях период полураспада составляет около трех дней, в полевых условиях от 7 до 14 дней. Миграция по почвенному профилю слабая.
     
     В растениях соединение быстро разрушается до нетоксичных метаболитов. Остатки Цимоксанила в клубнях картофеля не обнаруживаются. В ягодах винограда, по данным фирмы Дюпон, остатки составляли ниже 0,2 мг/кг при обработке за несколько дней до уборки.
     
     Краткая гигиеническая характеристика
     
     Цимоксанил относится к умеренно опасным соединениям по острой (ЛД для крыс - 960 мг/кг), малоопасным по дермальной токсичности (ЛД для крыс более - 2000 мг/кг) и умеренно опасным по ингаляционной (ЛК (4 часа) - 5060 мг/м) токсичности, не вызывает раздражения глаз и слабо раздражает кожу.
     
     В РФ установлены следующие гигиенические нормативы:
     
     ДСД - 0,02 мг/кг массы человека;
     
     ОДК в почве - 0,04 мг/кг;
     
     ПДК в воде водоемов - 0,3 мг/дм;
     
     МДУ в картофеле и огурцах - 0,05 мг/кг;
     
     ВМДУ в винограде - 0,1 мг/кг.
     
     Цимоксанил - контактный фунгицид с местным системным эффектом, обладающий защитным и лечащим действием. Высокоактивен против грибов, вызывающих фитофтороз и пероноспороз, не действует на возбудителей настоящей мучнистой росы. Длительность защитного действия составляет 4-6 дней, поэтому рекомендуется его использование в смеси с другими фунгицидами системного и защитного контактного действия.
     
     Зарегистрирован в России под названием Танос, диспергируемые в воде гранулы, 50% (25% Фамоксадона+25% Цимоксанила) на картофеле с нормой расхода 0,6 кг/га, трехкратная обработка за сезон.
     
     

2. Методика определения Цимоксанила в воде, почве, зеленой массе растений,
клубнях картофеля, ягодах винограда, плодах огурца
хроматографическими методами

     
2.1. Основные положения

     
2.1.1. Принцип метода

     
     Методика основана на определении Цимоксанила с помощью газожидкостной хроматографии при использовании термоионного детектора на неподвижной фазе ХЕ-60 после экстракции органическим растворителем, очистки экстракта путем перевода действующего вещества в водную фазу и повторной экстракции органическим растворителем.
     
     Метод ТСХ основан на извлечении Цимоксанила из анализируемого объекта этилацетатом, очистке экстракта на колонке с оксидом алюминия или сублимацией в вакууме и определении тонкослойной хроматографией.
     
     Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки (ГЖХ) или визуального сравнения величин пятен стандарта и пробы.
     

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

     
     
Таблица 1

Метрологическая характеристика метода

     
     
Таблица 2

Доверительный интервал и полнота определения Цимоксанила в почве, зеленой массе растений,
клубнях картофеля, огурцах и винограде

     
     
2.1.2. Избирательность метода

     
     В предлагаемых условиях методы специфичны в присутствии пестицидов, применяемых при выращивании винограда, огурцов и картофеля (дитиокарбаматы, хлор- и фосфорорганические соединения, синтетические пиретроиды).
     

2.2. Реактивы, растворы, материалы и оборудование

     
2.2.1. Реактивы, материалы и растворы

2.3. Подготовка к определению

     
2.3.1. Подготовка и кондиционирование колонки для газожидкостной хроматографии

     
     Готовую насадку (5% ХЕ-60 на Хроматоне N-AW) засыпают в стеклянную колонку, уплотняют под вакуумом, колонку устанавливают в термостате хроматографа, не подсоединяя к детектору, и стабилизируют в токе азота при температуре 230 °С в течение 8-10 часов. Для достижения предела обнаружения проводят тренировку колонки в течение 48-72 часов, вводя каждый час по 3 мкл стандартного раствора Цимоксанила с концентрацией 10 мкг/мл.
     

2.3.2. Приготовление колонки с оксидом алюминия

     
     В стеклянную хроматографическую колонку помещают ватный тампон, затем суспензию 4 г оксида алюминия в 15 мл хлороформа (при открытом кране колонки). Когда сорбент заполнит всю колонку, дают возможность стечь избытку растворителя, оставляя маленький слой его (0,2-0,3 см) на поверхности оксида алюминия. Кран закрывают. Колонка готова к работе.
     

2.3.3. Подготовка хлорирующей камеры

     
     Камеру для хлорирования готовят следующим образом: на дно эксикатора помещают чашку Петри с 5 г КМnO, а затем к ее содержимому осторожно приливают 15 мл концентрированной соляной кислоты. Эксикатор закрывают пришлифованной крышкой. Камера может быть использована через 5-10 мин.
     

2.3.4. Подготовка хроматографических камер

     
     В хроматографические камеры за один час до начала хроматографирования наливают хлороформ или смесь растворителей: гексан-ацетон (3:2) для насыщения камеры парами подвижных растворителей. Объем подвижного растворителя в камере должен находиться по высоте не выше, чем 0,7-1 см от уровня дна камеры.
     

2.3.5. Приготовление проявляющего реагента

     
     Растворяют в мерной колбе на 500 мл 0,16 г о-толидина в 30 мл ледяной уксусной кислоты, добавляют дистиллированной воды примерно до 300 мл и прибавляют 1 г иодида калия. При помешивании растворяют иодид калия и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор хранят в темной склянке. Годен к употреблению в течение длительного времени.
     

2.3.6. Приготовление стандартных растворов

     
     Взвешивают 50 мг Цимоксанила в мерной колбе на 50 мл, растворяют навеску в этилацетате и доводят объем до метки этилацетатом (стандартный раствор N 1, концентрация 1 мг/мл).
     
     Стандартный раствор N 1 можно хранить в холодильнике в течение 1 месяца. Методом последовательного разбавления готовят стандартные растворы Цимоксанила в этилацетате с концентрацией 10,0; 5,0; 2,5; 2,0 и 1,0 мкг/мл для построения калибровочного графика.
     
     Для ТСХ приготавливают стандартные растворы Цимоксанила в ацетоне с концентрацией 100 и 10 мкг/мл.
     

2.3.7. Построение калибровочного графика

     
     Для построения калибровочного графика вводят в хроматограф последовательно по 3 раза по 2,5 мкл каждого из полученных пяти растворов, измеряют высоту или площадь пиков, рассчитывают среднее значение высоты пика или его площади для каждой концентрации и строят график зависимости высоты пика или площади от концентрации Цимоксанила мкг/мл.
     

2.4. Отбор проб

     
     Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Отобранные пробы хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре не выше 4 °С. Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Растительные образцы замораживаются (лучше жидким азотом) и хранятся в холодильнике при -10 °С в течение 1 месяца, предварительно определяется содержание влаги.
     
     Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 0,1 мм, растительный материал режут ножом на кусочки длиной не более 0,5 см, остальные объекты измельчают на гомогенизаторе или на терке.
     

2.5. Проведение определения

     
2.5.1. Вода. ТСХ

     
     500 мл воды помещают в делительную воронку вместимостью 1000 мл, добавляют около 5 г хлорида натрия и 50 мл хлороформа. Смесь в течение нескольких минут энергично встряхивают. После разделения слоев нижний хлороформный слой сливают в плоскодонную колбу вместимостью 250 мл. Экстракцию Цимоксанила повторяют еще дважды тем же количеством растворителя. Объединенный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия (10-12 г). Раствор сливают через бумажный фильтр порциями в грушевидную колбочку вместимостью 50 мл. Концентрируют каждую порцию с помощью ротационного вакуумного испарителя до объема 2 мл. Последнюю порцию растворителя отгоняют полностью. К сухому остатку пипеткой добавляют 1 мл гексана, колбочку закрывают пробкой на шлифе и ее стенки тщательно обмывают растворителем.
     

2.5.2. Почва

     
     2.5.2.1. ГЖХ. Навеску 50 г воздушно-сухой почвы помещают в коническую колбу объемом 250 мл, равномерно смачивают 10 мл воды и перемешивают. Добавляют в колбу 100 мл ацетона, встряхивают на приборе для встряхивания 1 час. После выдерживания в течение 10 минут экстракт фильтруют методом декантации через фильтр "красная лента" в концентратор. Повторяют экстракцию дважды: 50 мл ацетона в течение 0,5 часа и 50 мл ацетона - 15 минут. Экстракты объединяют, добавляют в концентратор 20 мл дистиллированной воды и упаривают ацетон на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 50 °С. Далее экстракт очищают по следующей схеме.
     
     2.5.2.1.1. Очистка экстракта. Водный экстракт помещают в делительную воронку, ополаскивая концентратор 30 мл воды. Добавляют в воронку 20 мл хлороформа и интенсивно встряхивают 2 минуты. После разделения фаз нижний хлороформный слой собирают в стакан объемом 100 мл. Экстракцию повторяют дважды, используя по 20 мл хлороформа, объединенный хлороформный экстракт помещают в чистую делительную воронку, добавляют туда 10 мл 0,1 н соляной кислоты и интенсивно встряхивают 2 минуты. После разделения фаз нижний хлороформовый слой собирают в конический концентратор, пропуская его через слой безводного сернокислого натрия. Осушитель ополаскивают 10 мл хлороформа. Экстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 50 °С. Последние капли растворителя удаляют током воздуха. Сухой остаток растворяют в 1 мл этилацетата и вводят в хроматограф 2,5 мкл пробы.
     
     2.5.2.2. Почва ТСХ. К 10 г почвы, растертой в фарфоровой ступке, добавляют 2 мл дистиллированной воды. Почву тщательно увлажняют. Экстракцию Цимоксанила проводят этилацетатом три раза порциями по 50 мл при механическом встряхивании колбы в течение 30 мин. Дальнейшее определение проводят по схеме, описанной ниже с любой очисткой.
     
     2.5.2.2.1. Очистка экстракта хроматографией на колонке с АlО.
     
     Сухой остаток с помощью 2-3 мл хлороформа количественно переносится на колонку с оксидом алюминия. Каждый раз дают возможность раствору впитаться в сорбент, открывая кран колонки, но не допуская ее осушения. Во всех случаях над сорбентом должен оставаться небольшой слой растворителя (2-3 мм) Цимоксанил элюируют с колонки 10 мл хлороформа, собирая элюат в круглодонную колбу. Элюирование проводят со скоростью 1 кап./с. Равномерность потока растворителя обеспечивается вакуумом, регулируемым водоструйным насосом. Из приемной колбы вместимостью 20-25 мл с помощью ротационного вакуумного испарителя полностью отгоняют растворитель. К сухому остатку пипеткой добавляют 1 мл гексана. Колбочку закрывают пришлифованной пробкой и ее стенки тщательно обмывают растворителем.
     
     2.5.2.2.2. Очистка экстракта микросублимацией в вакууме.
     
     Сухой остаток с помощью 2-3 мл хлороформа количественно переносится в патрон сублиматора. Патрон помещают на горячую баню и полностью удаляют растворитель, регулируя равномерное распределение остатка по дну сублиматора. В патрон помещают "палец" сублиматора и проводят микросублимацию Цимоксанила на кипящей бане при 0,1-0,3 мм рт.ст. в течение 40 мин. После окончания сублимации Цимоксанил смывают с "пальца" сублиматора в грушевидную колбочку вместимостью 25 мл с помощью 10 мл ацетона. Из колбочки с помощью ротационного вакуумного испарителя полностью отгоняют растворитель. К сухому остатку пипеткой добавляют 1 мл гексана. Колбочку закрывают пробкой на шлифе и ее стенки тщательно обмывают растворителем.
     

2.5.3. Виноград, огурцы, клубни картофеля, зеленая масса. ГЖХ

     
     Навеску 50 г измельченных плодов огурцов, клубней картофеля, ягод винограда или зеленой массы помещают в коническую колбу объемом 250 мл, добавляют 50 мл этилацетата и встряхивают на приборе для встряхивания 1 час. Затем раствор методом декантации переносят в делительную воронку через фильтр "красная лента". После разделения слоев нижнюю водную фракцию помещают в колбу для повторной экстракции, верхний слой этилацетата собирают в концентратор.
     
     Повторно проводят экстракцию 50 мл этилацетата в течение 0,5 часа. Органический экстракт объединяют, добавляют в концентратор 20 мл дистиллированной воды и отгоняют этилацетат на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 50 °С.
     
     2.5.3.1. Очистка экстракта. Водный экстракт помещают в делительную воронку, ополаскивая концентратор 30 мл воды. Добавляют в воронку 20 мл хлороформа и интенсивно встряхивают 2 минуты. После разделения фаз нижний хлороформный слой собирают в стакан объемом 100 мл. Экстракцию повторяют дважды, используя по 20 мл хлороформа, объединенный хлороформный экстракт помещают в чистую делительную воронку, добавляют туда 10 мл 0,1 н соляной кислоты и интенсивно встряхивают 2 минуты. После разделения фаз нижний хлороформовый слой собирают в конический концентратор, пропуская его через слой безводного серно-кислого натрия. Осушитель ополаскивают 10 мл хлороформа. Экстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 50 °С. Последние капли растворителя удаляют током воздуха. Сухой остаток растворяют в 1 мл этилацетата и вводят в хроматограф 2,5 мкл пробы.
     

2.5.4. Клубни картофеля. ТСХ

     
     Навеску анализируемой пробы (50 г) помещают в плоскодонную колбу вместимостью 500 мл, заливают 100 мл этилацетата и проводят экстракцию Цимоксанила при помощи механического встряхивания колбы в течение 30 мин. Экстракт фильтруют в круглодонную колбу вместимостью 500 мл. Экстракцию Цимоксанила повторяют еще дважды тем же количеством растворителя. Этилацетат удаляют с помощью ротационного вакуумного испарителя полностью. Далее очистку экстракта можно проводить двумя способами: хроматографией на колонке с оксидом алюминия или микро сублимацией в вакууме (п.п.2.5.2.2.1 и 2.5.2.2.2).
     

2.6. Условия хроматографирования и обработка результатов

     
2.6.1. Условия хроматографирования.

     
     2.6.1.1. ГЖХ.

     
     Хроматограф "Цвет-600" с термоионным азотным детектором с пределом детектирования не выше 5х10 г/см по азоту в азобензоле
     

     Носитель Хроматон N-AW, размер частиц 0,200-0,250 мм, неподвижная фаза 5% ХЕ-60.
     

     Линейность детектирования сохраняется в пределах 2,5-37,5 нг. Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю высоту пика. Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 15 мкг/мл, разбавляют.
     
     2.6.2.2. ТСХ.
     
     На хроматографические пластинки Сорбифил с помощью микрошприца на 100 мкл или микропипетки на 0,1 мл наносят аликвотную часть полученного по пунктам (2.5.1, 2.5.2.2.1, 2.5.2.2.2) раствора (100 мкл). Справа и слева таким же способом наносят серию стандартных растворов Цимоксанила с содержанием 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; ...1,0 мкг. Градуировочные растворы готовят в градуированных пробирках вместимостью 10 мл с пробками на шлифе согласно табл.3.
     
     

Таблица 3

Шкала стандартов

     
     Хроматограмму развивают в системе хлороформ или гексан-ацетон (3:2). При очистке экстракта на колонке с АlО сначала в хлороформе, а затем, после высушивания пластинки, в гексан-ацетон (3:2). После развития, высушенную хроматограмму помещают под лампу УФ света на 10 мин, а затем на 10 мин в свежеприготовленную хлорирующую камеру. После удаления избытка хлора пластинку обрабатывают из пульверизатора проявляющим реактивом. Цимоксанил проявляется на хроматограмме в виде темных пятен на белом фоне с R 0,21±0,05 в хлороформе, R 0,45±0,05 в системе гексан-ацетон и R 0,66±0,02 при сочетании двух систем подвижных растворителей. Линейный диапазон определения 0,2-1,0 мкг. Пятна стабильны в течение длительного времени.

     
2.6.2. Обработка результатов анализов

     
     2.6.2.1. ГЖХ.
     
     Содержание Цимоксанила в пробе рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:
     

, гдe

     
      - содержание гербицида в пробе, мг/кг;
     
      - высота пика стандарта, мм;
     
      - высота пика образца, мм;
     
      - концентрация стандартного раствора, мкг/мл;
     
      - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования (мл);
     
      - фактор разбавления, учитывающий взятие аликвоты в ходе определения;
     
      - масса анализируемого образца, г или мл.
     
      - содержание Цимоксанила в аналитическом стандарте, %.
     
     2.6.2.2. ТСХ.
     
     Количественное определение Цимоксанила проводят путем сравнения площади и интенсивности окраски пятен рабочей пробы и серии стандартов.
     
     Содержание Цимоксанила в анализируемой пробе вычисляют по формуле:
     

, где

     
      - содержание Цимоксанила в анализируемой пробе, мг/кг (мг/л);
     
      - содержание Цимоксанила, найденное в хроматографируемой пробе, мкг;
     
      - общий объем раствора, мл;
     
      - объем аликвоты, нанесенной на пластинку, мл;
     
      - навеска или объем анализируемой пробы, г (мл).
     
     

3. Требования техники безопасности

     
     Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.
     
     

4. Разработчики

     
     ГЖХ. Калинин В.А., профессор, к.с-х.н.; Калинина Т.С., к.с-х.н.; Довгилевич А.В., к.хим.н.; Довгилевич Е.В., к.биол.н.
     
     Московская сельскохозяйственная академия им. К.А.Тимирязева. 127550, Москва, Тимирязевский пр., 2, кафедра химических средств защиты растений. Телефон: (095) 976-02-20.
     
     ТСХ. ВНИИХСЗР, г.Москва. Новикова К.Ф., к.хим.н. и др.
     
     
     

Текст документа сверен по:
официальное издание
Определение остаточных количеств пестицидов
в пищевых продуктах, сельскохозяйственном сырье
и объектах окружающей среды: Сборник методических
указаний. Выпуск 1. - М.: Федеральный центр
госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004