МУК 4.1.1921-04

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств Пираклостробина
в воде, почве, ягодах винограда, виноградном соке и яблоках
методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

     

Дата введения: с момента утверждения

     
     
     1. РАЗРАБОТАНЫ Московской сельскохозяйственной академией им. К.А.Тимирязева, Учебно-научным центром "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" (авторы В.А.Калинин, А.В.Довгилевич, Е.В.Довгилевич, Н.В.Устименко).
     
     2. УТВЕРЖДЕНЫ Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 11 августа 2004 г.
     
     3. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.
     
     

1. Вводная часть

     
     Фирма производитель: БАСФ, Германия.
     
     Торговое название: Кабрио, Кабрио Топ.
     
     Название действующего вещества по ИСО: Пираклостробин.
     
     Название действующего вещества по ИЮПАК: метил-N-{2-[1-(4-хлорфенил)-1Н-пиразол-3-илоксиметил]фенил} (N-метокси)карбамат.
     
     Структурная формула:     
     

     
      Эмпирическая формула: CHCINО
     
     Молекулярная масса: 387,8
     
     Химически чистый Пираклостробин представляет собой белый или светло-бежевый кристаллический порошок без запаха.
     
     Температура плавления: 63,7-65,2 °С.
     
     Давление паров 2,6х10 мПа (при 20 °С).
     
     Коэффициент распределения октанол-вода  - 3,99 (22 °C).
     
     Растворимость в воде - 1,9 мг/л (при 20 °С).
     
     Растворимость в органических растворителях (г/л при 20 °С): ацетон - более 200, ацетонитрил - более 980, изопропанол - 40, метанол - 140.
     
     Сохраняется в водной среде более 30 дней при рН 5,7 и температуре 25 °С; подвержен фотолизу в воде - ДТ составляет менее 2 ч. В почве период полураспада составляет 2-37 дней.
     
     Краткая токсикологическая характеристика. Пираклостробин относится к малоопасным по острой оральной (СД для крыс - более 5000 мг/кг), дермальной токсичности (СД для крыс - более 2000 мг/кг) и умеренно опасным веществам по ингаляционной токсичности (CK 4 ч для крыс 4000-7000 мг/м). Он не вызывает раздражения слизистых оболочек глаз и кожи и не обладает мутагенным, тератогенным, эмбриотоксическим, канцерогенным действием.
     
     В России гигиенические нормативы не установлены.
     
     Область применения препарата. Пираклостробин - фунгицид из группы стробилуринов контактного и глубинного действия с длительным защитным эффектом. Высокоэффективен против возбудителей ложной и мучнистой настоящей росы, в т.ч. против рас возбудителя, устойчивых к Металаксилу и производным триазола.
     
     Рекомендуется для борьбы с фитопатогенными грибами на зерновых, овощных и плодовых культурах с нормой расхода 50-250 г д.в./га.
     
     

2. Методика определения остаточных количеств Пираклостробина
в воде, почве, ягодах винограда, виноградном соке и яблоках
методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

     
     Методика основана на определении Пираклостробина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистке перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и на концентрирующих патронах на основе силикагеля (Диапак С, Диапак-Амин и Диапак С16). Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.
     

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

     
     Метрологическая характеристика метода представлена в табл.1 и 2.
     
     

Таблица 1

Метрологическая характеристика метода определения

     
     
Таблица 2

Полнота определения Пираклостробина в воде, почве, ягодах винограда, виноградном соке
и яблоках (5 повторностей для каждой концентрации)

     
     
2.1.3. Избирательность метода

     
     В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых при выращивании яблок и винограда.
     
     

2.2. Реактивы, растворы, материалы и оборудование

2.2.1. Реактивы, материалы и растворы

     Перед началом эксперимента проверяют чистоту ацетонитрила, ацетона, гексана и хлористого метилена. Для этого досуха выпаривают на ротационном вакуумном испарителе 200 мл растворителя, добавляют в концентратор 1 мл ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора и хроматографируют при 270 нм. При недостаточной чистоте растворителей проводят их очистку.
     
     Бидистиллят кипятят в течение 6 ч с марганцово-кислым калием, добавленным из расчета 1 г/л, и затем перегоняют.
     
     Ацетон перегоняют над небольшим количеством перманганата калия (Гордон А., Форд Р. Спутник химика. М., 1976. С.438-439).
     
     Ацетонитрил перегоняют.
     
     Гексан встряхивают с концентрированной серной кислотой, промывают бледно-розовым раствором перманганата калия до тех пор, пока раствор не перестанет обесцвечиваться, затем промывают водой, сушат над безводным хлористым кальцием и перегоняют (Гордон А., Форд Р. Спутник химика. М., 1976. С.441).
     
     Хлористый метилен встряхивают с концентрированной серной кислотой, промывают водным раствором карбоната натрия, водой, сушат над безводным хлористым кальцием и перегоняют над оксидом (V) фосфора (Гордон А., Форд Р. Спутник химика. М., 1976. С.440).
     

2.2.2. Приборы и оборудование

2.3. Подготовка к определению

2.3.1. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии

     
     Хроматографическую колонку Symmetry Shield RP18 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 25 °С и скорости потока подвижной фазы 1 мл/мин 3-4 ч.
     

2.3.2. Приготовление стандартных растворов

     
     Взвешивают 100 мг Пираклостробина в мерной колбе объемом 100 мл. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом (стандартный раствор с концентрацией Пираклостробина 1,0 м г/мл). Затем 1,0 мл стандартного раствора с концентрацией 1,0 мг/мл отбирают пипеткой в мерную колбу объемом 100 мл и доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании (стандартный раствор с концентрацией Пираклостробина 10,0 мкг/мл). Стандартные растворы можно хранить в холодильнике в течение трех месяцев. Методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 5,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/мл, и используют их для хроматографического поведения и внесения в контрольные образцы.
     

2.3.3. Приготовление растворов для жидкостной хроматографии

     
     Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанные ацетонитрил и очищенную воду.
     

Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ

     
     В плоскодонную колбу объемом 1 л помещают 600 мл ацетонитрила, 300 мл очищенной воды и 1 мл ледяной уксусной кислоты. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 мл/мин в течение 5 мин, после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 мин.
     

2.3.4. Построение калибровочного графика

     
     Для построения калибровочного графика вводят в хроматограф последовательно 3 раза по 20 мкл каждого из стандартных растворов, содержащих Пираклостробин с концентрациями 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/мл, измеряют площадь пиков, рассчитывают среднее значение площади пика для каждой концентрации и строят график зависимости площади пика от концентрации Пираклостробина.
     

2.3.5. Подготовка концентрирующего патрона Диапак-С для очистки экстракта

     
     Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 мл/мин.
     
     Патрон Диапак-С устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 мл (используют как емкость для элюентов).
     
     Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают последовательно 10 мл смеси гексан-ацетон в соотношении 1:1 и 10 мл гексана. Элюат отбрасывают.
     
     Нельзя допускать высыхания поверхности патрона!
     
     2.3.5.1. Проверка хроматографического поведения Пираклостробина на концентрирующем патроне Диапак-С.
     
     Из стандартного раствора Пираклостробина в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/мл, отбирают 1 мл, помещают в круглодонную колбу объемом 100 мл и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетона, помещают на 10 с в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 мл гексана, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила и хроматографируют. Концентратор тщательно обмывают двумя порциями по 10 мл смеси гексан-ацетон в соотношении 9:1 и также вносят на патрон. Элюат после прохождения каждой порции собирают в концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила и хроматографируют. Определяют фракции, содержащие Пираклостробин, объединяют их и рассчитывают полноту его смыва с колонки.
     
     2.3.6. Подготовка концентрирующего патрона Диапак-С16 для очистки экстракта
     
     Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 мл/мин. При работе на патронах Диапак-С16 используют очищенную воду.
     
     Патрон Диапак-С16 устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 мл (используют как емкость для элюентов).
     
     Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают последовательно 10 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:1 и 20 мл воды. Элюат отбрасывают.
     
     Нельзя допускать высыхания поверхности патрона!
     
     2.3.6.1. Проверка хроматографического поведения Пираклостробина на концентрирующем патроне Диапак-С16.
     
     Из стандартного раствора Пираклостробина в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/мл, отбирают 1 мл, помещают в круглодонную колбу объемом 100 мл и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетонитрила, помещают на 10 с в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 мл воды, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила и хроматографируют. Концентратор обмывают 10 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:4 и смесь вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила и хроматографируют. Концентратор обмывают 10 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:2 и вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила и хроматографируют. Концентратор обмывают тремя порциями по 10 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:1 и также вносят на патрон. Элюат после прохождения каждой порции собирают в концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила и хроматографируют. Определяют фракции, содержащие Пираклостробин, объединяют их и рассчитывают полноту его смыва с колонки.
     

2.3.7. Подготовка концентрирующего патрона Диапак-Амин для очистки экстракта

     
     Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 мл/мин. При работе на патронах Диапак-Амин используют очищенную воду.
     
     Патрон Диапак-Амин устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 мл (используют как емкость для элюентов).
     
     Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают последовательно 10 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:1 и 20 мл воды. Элюат отбрасывают.
     
     Нельзя допускать высыхания поверхности патрона!
     
     2.3.7.1. Проверка хроматографического поведения Пираклостробина на концентрирующем патроне Диапак-Амин.
     
     Из стандартного раствора Пираклостробина в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/мл, отбирают 1 мл, помещают в круглодонную колбу объемом 100 мл и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетонитрила, помещают на 10 с в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 мл воды, тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила и хроматографируют. В исходный концентратор добавляют 1 мл ацетонитрила, стенки колбы тщательно обмывают, добавляют 9 мл воды, тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила и хроматографируют. Процедуру повторяют еще раз. Определяют фракции, содержащие Пираклостробин, объединяют их и рассчитывают полноту его смыва с колонки.
     
     

2.4. Отбор проб

     
     Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79), утвержденными заместителем Главного государственного санитарного врача СССР.
     
     

2.5. Описание определения

2.5.1. Вода

     Пробу воды объемом 100 мл помещают в делительную воронку емкостью 250 мл. Затем в делительную воронку добавляют 30 мл хлористого метилена и интенсивно встряхивают ее 2 мин. После полного разделения фаз нижний слой (хлористый метилен), содержащий Пираклостробин, собирают в концентратор объемом 250 мл, пропуская его через слой безводного сульфата натрия. Водный экстракт возвращают в делительную воронку и экстрагируют Пираклостробин еще двумя порциями хлористого метилена по 30 мл, интенсивно встряхивая делительную воронку 2 мин. Каждый раз после полного разделения фаз нижний слой (хлористый метилен), содержащий Пираклостробин, собирают в концентратор, пропуская его через слой безводного сульфата натрия. Выпаривают объединенный экстракт досуха. Сухой остаток растворяют в 5 мл ацетонитрила и аликвоту объемом 20 мкл вводят в хроматограф.
     

2.5.2. Почва

     
     2.5.2.1. Экстракция и предварительная очистка. Образец почвы массой 20 г помещают в коническую колбу объемом 250 мл, прибавляют 10 мл 0,1%-ной соляной кислоты и выдерживают при комнатной температуре 10 мин. Затем к содержимому колбы прибавляют 30 мл ацетонитрила и экстрагируют Пираклостробин 5 мин на ультразвуковой ванне и дополнительно 5 мин на механическом встряхивателе. После экстракции пробу центрифугируют 5 мин при скорости 3000 об./мин и супернатант переносят через бумажный фильтр "красная лента" в коническую колбу объемом 250 мл с 10 г поваренной соли. Экстракцию повторяют еще 3 раза, используя по 30 мл ацетонитрила и экстрагируя по 5 мин на ультразвуковой ванне и дополнительно 5 мин на механическом встряхивателе. После центрифугирования и фильтрования экстракты объединяют в конической колбе с 10 г поваренной соли, перемешивают и оставляют на 10 мин при комнатной температуре. Затем экстракт переносят в делительную воронку объемом 250 мл и выделившийся нижний водный слой отбрасывают. Верхний ацетонитрильный слой пропускают в концентратор объемом 250 мл через слой безводного сульфата натрия и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
     
     К сухому остатку в концентраторе добавляют 5 мл ацетона и тщательно обмывают его стенки, затем туда же добавляют 100 мл дистиллированной воды и 5 г поваренной соли и перемешивают до полного растворения соли. Полученную смесь переносят в делительную воронку объемом 250 мл, концентратор обмывают 30 мл гексана, помещают в ту же делительную воронку и интенсивно встряхивают ее 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний водный слой сливают в коническую колбу объемом 250 мл, а верхний гексановый слой - в химический стакан объемом 100 мл. Затем водную фазу возвращают в делительную воронку и экстрагируют Пираклостробин еще двумя порциями гексана объемом по 30 мл. Гексановые экстракты объединяют, переносят в делительную воронку, добавляют туда же 50 мл 5%-ного водного раствора гидрокарбоната натрия и интенсивно встряхивают 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний водный слой отбрасывают, а гексановый экстракт промывают еще раз 50 мл 5%-ного водного раствора гидрокарбоната натрия, интенсивно встряхивая делительную воронку 2 мин. Гексановый экстракт переносят в концентратор объемом 250 мл, пропуская через слой безводного сульфата натрия. Осушитель обмывают 10 мл гексана, объединяют смыв с основным экстрактом и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
     
     2.5.2.2. Очистка на концентрирующем патроне Диапак-Амин. Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетонитрила, помещают на 10 с в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 мл воды, тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в чистый концентратор. В исходный концентратор добавляют еще раз 1 мл ацетонитрила, стенки колбы тщательно обмывают, добавляют 9 мл воды, тщательно перемешивают и полученный раствор вновь вносят на патрон. Элюаты объединяют и подвергают дальнейшей очистке.
     
     2.5.2.3. Повторная очистка и очистка на патроне Диапак-С16. К объединенному элюату добавляют 100 мл дистиллированной воды, 5 г поваренной соли и перемешивают до полного растворения соли. Затем полученную смесь переносят в делительную воронку объемом 250 мл, концентратор обмывают 30 мл гексана, помещают смыв в ту же делительную воронку и интенсивно встряхивают 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний водный слой помещают в коническую колбу объемом 250 мл, а верхний гексановый слой собирают в концентратор объемом 250 мл, пропуская через слой безводного сульфата натрия. Экстракцию Пираклостробина повторяют еще двумя порциями гексана по 30 мл, экстракты объединяют, осушитель обмывают 10 мл гексана, объединяют смыв с основным экстрактом и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
     
     Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетонитрила, помещают на 10 с в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 мл воды, тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат отбрасывают.
     
     Концентратор обмывают 10 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:4 и вносят на патрон. Элюат отбрасывают.
     
     Концентратор обмывают 10 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:2 и вносят на патрон. Элюат отбрасывают.
     
     Пираклостробин элюируют 20 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:1. Элюат собирают в концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила и аликвоту 20 мкл вводят в хроматограф.
     

2.5.3. Яблоки

     
     2.5.3.1. Экстракция и предварительная очистка. Образец измельченных на терке яблок массой 10 г помещают в коническую колбу объемом 250 мл, прибавляют 30 мл ацетонитрила и экстрагируют 5 мин на ультразвуковой ванне и дополнительно 5 мин на механическом встряхивателе. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр "красная лента" в коническую колбу объемом 250 мл с 5 г поваренной соли. Экстракцию повторяют еще 3 раза, используя по 30 мл ацетонитрила и экстрагируя по 5 мин на ультразвуковой ванне и дополнительно 5 мин на механическом встряхивателе. После фильтрования экстракты объединяют, перемешивают и оставляют на 10 мин при комнатной температуре.
     
     Затем экстракт переносят в делительную воронку объемом 250 мл и выделившийся нижний водный слой отбрасывают. Верхний ацетонитрильный слой пропускают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 мл и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
     
     К сухому остатку в концентраторе добавляют 5 мл ацетона и тщательно обмывают его стенки, затем туда же добавляют 100 мл дистиллированной воды, 5 г поваренной соли и перемешивают до полного растворения соли. Полученную смесь переносят в делительную воронку объемом 250 мл, концентратор обмывают 30 мл гексана, который помещают в ту же делительную воронку и интенсивно встряхивают ее 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний водный слой помещают в коническую колбу объемом 250 мл, а верхний гексановый слой собирают в концентратор объемом 250 мл, пропуская через слой безводного сульфата натрия. Водный слой возвращают в делительную воронку и экстрагируют Пираклостробин еще дважды порциями гексана объемом по 30 мл. Водный слой отбрасывают, а гексановый экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия и объединяют в концентраторе объемом 250 мл. Осушитель обмывают 10 мл гексана, объединяют смыв с основным экстрактом и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
     
     К сухому остатку в концентраторе прибавляют 2 мл ацетона и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор прибавляют 50 мл гексана, тщательно перемешивают и переносят в сухую делительную воронку объемом 250 мл. Пираклостробин экстрагируют из ацетоново-гексановой смеси тремя порциями ацетонитрила объемом по 20 мл, интенсивно встряхивая делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой пропускают в концентратор объемом 100 мл через слой безводного сульфата натрия и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
     
     2.5.3.2. Очистка на патроне Диапак-С. Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетона, помещают на 10 с в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 мл гексана, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Концентратор тщательно обмывают 10 мл смеси гексан-ацетон в соотношении 9:1 и также вносят на патрон. Элюаты объединяют и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила и аликвоту 20 мкл вводят в хроматограф.
     

2.5.4. Виноград (ягоды)

     
     2.5.4.1. Экстракция и предварительная очистка. Образец измельченных ягод винограда массой 10 г помещают в коническую колбу объемом 250 мл, прибавляют 30 мл ацетонитрила и экстрагируют 5 мин на ультразвуковой ванне и дополнительно 5 мин на механическом встряхивателе. Экстракт переносят через бумажный фильтр "красная лента" в коническую колбу объемом 250 мл с 5 г поваренной соли. Экстракцию повторяют еще 3 раза, используя по 30 мл ацетонитрила и экстрагируя по 5 мин на ультразвуковой ванне и дополнительно 5 мин на механическом встряхивателе. После фильтрования экстракты объединяют в конической колбе с 5 г поваренной соли, перемешивают и оставляют на 10 мин при комнатной температуре. Затем экстракт переносят в делительную воронку объемом 250 мл и выделившийся нижний водный слой отбрасывают. Верхний ацетонитрильный слой возвращают в делительную воронку, добавляют туда же 50 мл насыщенного раствора поваренной соли и интенсивно встряхивают 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний водный слой с выпавшими в осадок кристаллами соли отбрасывают. Верхний ацетонитрильный слой пропускают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 мл и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. К сухому остатку в концентраторе добавляют 5 мл ацетона и тщательно обмывают его стенки. Затем добавляют 100 мл дистиллированной воды, 5 г поваренной соли и перемешивают до полного растворения соли. Полученную смесь переносят в делительную воронку объемом 250 мл, концентратор обмывают 30 мл гексана, который помещают в ту же делительную воронку и интенсивно встряхивают 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний водный слой помещают в коническую колбу объемом 250 мл, а верхний гексановый слой собирают в сухую делительную воронку объемом 250 мл, пропуская через слой безводного сульфата натрия. Водный слой возвращают в делительную воронку и экстрагируют Пираклостробин еще двумя порциями гексана объемом по 30 мл. Водный слой отбрасывают, а гексановый экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия и объединяют в делительной воронке, осушитель обмывают 10 мл гексана и объединяют смыв с основным экстрактом. Пираклостробин извлекают из гексана тремя порциями ацетонитрила объемом по 20 мл, интенсивно встряхивая делительную воронку 2 мин. После разделения слоев нижний ацетонитрильный слой с эмульсией собирают в стакан объемом 100 мл, выдерживают 5 мин при комнатной температуре, затем возвращают в делительную воронку и после полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой собирают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 100 мл и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
     
     2.5.4.2. Очистка на патроне Диапак-С. Сухой остаток в концентраторе растворяют в 1 мл ацетона, тщательно обмывая стенки колбы, добавляют 9 мл гексана и очищают на патроне Диапак-С, как указано в п.2.5.3.2. После очистки элюат выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
     
     2.5.4.3. Очистка на патроне Диапак-С16. Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетонитрила, помещают на 10 с в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 мл воды, тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат отбрасывают.
     
     Концентратор обмывают 10 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:4 и вносят на патрон. Элюат отбрасывают.
     
     Концентратор обмывают 10 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:2 и вносят на патрон. Элюат отбрасывают.
     
     Пираклостробин элюируют 20 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:1. Элюат собирают в концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила и аликвоту 20 мкл вводят в хроматограф.
     

2.5.5. Виноградный сок

     
     Помещают 10 мл виноградного сока в делительную воронку объемом 250 мл, туда же добавляют 100 мл дистиллированной воды, 5 г поваренной соли и перемешивают до полного растворения соли. Затем в делительную воронку добавляют 30 мл гексана и интенсивно встряхивают ее 2 мин. После разделения фаз в делительной воронке нижний водный слой помещают в коническую колбу объемом 250 мл, верхний гексановый слой с эмульсией собирают в химический стакан объемом 250 мл. Водный слой возвращают в делительную воронку и экстрагируют Пираклостробин еще двумя порциями гексана объемом по 30 мл. Водный слой отбрасывают, а гексановый экстракт с эмульсией объединяют в химическом стакане и переносят в делительную воронку. Затем туда же добавляют 50 мл насыщенного раствора поваренной соли и интенсивно встряхивают 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний водный слой отбрасывают, а гексановый экстракт собирают в сухую делительную воронку объемом 250 мл, пропуская через слой безводного сульфата натрия. Осушитель обмывают 10 мл гексана и объединяют смыв с основным экстрактом. Пираклостробин экстрагируют из гексана тремя порциями ацетонитрила объемом по 20 мл, интенсивно встряхивая делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 100 мл и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
     
     Далее проводят очистку, как указано в разделах 2.5.4.2 и 2.5.4.3.
     
     

2.6. Условия хроматографирования и обработка результатов

2.6.1. Условия хроматографирования

     
     Хроматограф "Waters" или другой с аналогичными характеристиками с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны.
     
     Колонка стальная Symmetry Shield RP18, 4,6 мм х 25 см, зернением 5 мкм.
     
     Предколонка стальная Symmetry RP18, 3,9 мм х 2 см, зернением 5 мкм.
     
     Температура колонки: 25 °С.
     
     Подвижная фаза: ацетонитрил-вода-ледяная уксусная кислота в соотношении 600:300:1.
     
     Длина волны 270 нм.
     
     Время удерживания Пираклостробина 9,9-10,6 мин.
     
     Чувствительность 0,005 ед. оптической плотности на шкалу.
     
     Объем вводимой пробы 20 мкл.
     
     Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2-20 нг.
     

2.6.2. Обработка результатов анализа

     
     Содержание Пираклостробина рассчитывают по формуле:
     

 где

     
      - содержание Пираклостробина в пробе, мг/кг или мг/л;
     
      - высота (площадь) пика стандарта, мм;
     
      - высота (площадь) пика образца, мм;
     
      - концентрация стандартного раствора, мкг/мл;
     
      - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;
     
      - масса анализируемого образца, г (мл);
     
      - содержание Пираклостробина в аналитическом стандарте, %.
     
     

3. Требования техники безопасности

     
     Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.
     
     
     
Текст документа сверен по:
официальное издание
М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора
Минздрава России, 2005