МУК 4.1.1434-03
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Определение остаточных количеств Спинозина А и Спинозина Д в воде, почве, плодах огурца, яблок, перца, клубнях картофеля и капусте методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии
Дата введения 2003-06-30
1. ПОДГОТОВЛЕНЫ: Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф.Эрисмана (чл.-корр. РАМН, проф. В.Н.Ракитский, проф. Т.В.Юдина); Московской сельскохозяйственной академией им. К.А.Тимирязева (проф. В.А.Калинин, к.хим.н. А.В.Довгилевич); при участии Департамента госсанэпиднадзора Минздрава России (А.П.Веселов). Разработчики методик указаны в конце каждой из них.
2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по госсанэпиднормированию при Минздраве России.
3. УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г.Онищенко 24 июня 2003 г.
4. Введены с 30 июня 2003 г.
5. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.
1. Вводная часть
Фирма-производитель: Дау АгроСайенсес.
Торговое название: Спинтор.
Название действующего вещества по ИСО: Спиносад.
Синонимы: XDE-105; DE-105.
Название действующего вещества по ИЮПАК:
|
Смесь (2R,3аR,5аR,5bS,9S,13S,14R,16аS,16bR)-2-(6-дезокси-2,3,4-три-O-метил- |
-L-манно-пиранозил- окси)-13-(4-диметиламино-2,3,4,6-тетрадезокси-
-D-эритропиранозилокси)-9-этил-2,3,3а,5а,5b,6,7,9,10, 11,12,13,14,15,16а,16b-гексадекогидро-14-метил-1H-8-оксациклододека-[b]as-индацен-7,15-диона и (2S,3aR, 5aS,5bS,9S,13S,14R,16aS,16bS)-2-(6-дезокси-2,3,4-три-O-метил
-L-маннопиранозилокси)- 13-(4-диметиламино-2,3,4,6-тетрадезокси-
-D-эритропира-нозилокси)-9-этил-2,3,3а,5а,5b,6,7,9,10,11,12, 13,14,15,16а,16b-гексадеко-гидро-4,14-диметил-1H-8-оксациклодо-дека[b]as-индацен-7,15-диона в соотношении от 50-95% до 50-5%.
Структурная формула:
Спинозин A, R=Н-
Спинозин D, R=СН
-
Эмпирическая формула: Спинозин А - C
H
NO
; Спинозин Д - С
Н
NO
.
Молекулярная масса: Спинозин А - 732,0; Спинозин Д - 746,0.
Спиносад представляет собой светло-серый или белый кристаллический порошок.
Температура плавления: Спинозин А - 84,0-99,5 °С; Спинозин Д - 161,5-170,0 °С.
Давление паров 3,0х10
мПа (при 25 °С) - Спинозин А; 2,0х10
мПа (при 25 °С) - Спинозин Д.
Коэффициент распределения в системе октанол-вода:
Спинозин А - 
2,8 (рН 5), 4,0 (рН 7), 5,2 (рН 9);
Спинозин Д - 
3,2 (рН 5), 4,5 (рН 7), 5,2 (рН 9).
Растворимость в воде:
Спинозин А - 89 мг/л (дистиллированная вода), 235 мг/л (рН 7) (при 20 °С);
Спинозин Д - 0,5 мг/л (дистиллированная вода), 0,33 мг/л (рН 7) (при 20 °С).
Растворимость в органических растворителях (г/л при 20 °С):
Спинозин А: ацетон - 16,8, ацетонитрил - 13,4, хлористый метилен - 52,5, метанол - 19,0, гексан - 0,448, толуол - 45,7, н-октанол - 0,926;
Спинозин Д: ацетон - 1,01, ацетонитрил - 0,255, хлористый метилен - 44,8, метанол - 0,252, гексан - 0,743, толуол - 15,2, н-октанол - 0,127.
Оба вещества устойчивы к гидролизу при рН 5 и рН 7; ДТ
при рН 9 составляет 200 дней для Спинозина А и 259 дней для Спинозина Д.
Фотодеградация в воде: ДТ
при рН 7 составляет 0,93 дня для Спинозина А и 0,82 дня для Спинозина Д.
Спиносад быстро разлагается под действием ультрафиолета, в почве метаболизируется бактериями с образованием "природных" соединений. Время полуразложения в почве ДТ
при аэробном метаболизме составляет 9,4-17,3 дня; ДТ
при фотодеградации в почве составляет 8,7 дня для Спинозина А и 9,4 дня для Спинозина Д. При анаэробном водном метаболизме ДТ
составляет 161 день для Спинозина А и 250 дней для Спинозина Д.
Краткая токсикологическая характеристика. Спиносад относится к малоопасным соединениям по оральной (ЛД
для самок крыс 3783 мг/кг, для самцов крыс - более 5000 мг/кг) и дермальной (ЛД
для кроликов более 2000 мг/кг) токсичности и умеренно опасным по ингаляционной (ЛК
для крыс - 4 ч - более 5,18 мг/л) токсичности. Он не вызывает раздражения кожи, отмечается лишь слабое покраснение глаз у кроликов. Не обладает мутагенным и нейротоксичным свойствами или репродуктивной токсичностью.
В России гигиенические нормативы не установлены.
Область применения препарата. Спиносад - инсектицид контактного и кишечного действия из группы спинозинов, обладающий парализующим эффектом. Он эффективно подавляет развитие вредителей из отрядов жесткокрылых, бахромчатокрылых, прямокрылых, двукрылых и чешуекрылых (имаго и личинки) в посевах зерновых, плодовых, овощных и декоративных культур при норме расхода 5-40 г д.в./га. Препараты на основе Спиносада используются также для борьбы с синантропными насекомыми и в ветеринарии.
В России и странах СНГ проходят регистрационные испытания препарата Спинтор в качестве инсектицида на огурцах и перцах закрытого грунта, в яблоневых садах и на посадках картофеля и капусты с нормой расхода 1,0-1,5 л/га по препарату при однократной обработке (яблони и картофель), при двукратной обработке на огурцах закрытого грунта.
2. Методика определения остаточных количеств Спинозинов А и Д в воде, почве,
плодах огурца, яблок, перца, клубнях картофеля и капусте методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии
2.1. Основные положения
2.1.1. Принцип метода
Методика основана на раздельном определении Спинозинов А и Д (составных компонентов Спиносада) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем и очистки экстракта на концентрирующих патронах на основе силикагеля (Диапак-Амин, Диапак С). Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение методом абсолютной калибровки.
2.1.2. Метрологическая характеристика метода
Метрологическая характеристика метода представлена в табл.1 и 2.
Таблица 1
Метрологическая характеристика метода
|
Анализируемый объект |
Метрологические параметры, | ||||
|
предел обнаружения, мг/кг (мг/л) |
диапазон определяемых концентраций, мг/кг (мг/л) |
среднее значение определения, % |
стандартное отклонение, S |
доверительный интервал среднего результата, | |
|
Спинозин А | |||||
|
Вода |
0,0025 |
0,0025-0,025 |
96,2 |
2,49 |
0,58 |
|
Почва |
0,05 |
0,05-0,5 |
76,6 |
1,92 |
0,56 |
|
Плоды огурца |
0,025 |
0,025-0,250 |
75,9 |
1,32 |
0,29 |
|
Плоды яблок |
0,025 |
0,025-0,250 |
76,7 |
1,62 |
0,48 |
|
Плоды перца |
0,025 |
0,025-0,250 |
78,5 |
2,88 |
1,35 |
|
Капуста |
0,025 |
0,025-0,250 |
76,3 |
1,6 |
0,70 |
|
Клубни картофеля |
0,025 |
0,025-0,250 |
75,1 |
1,16 |
0,39 |
|
Спинозин Д | |||||
|
Вода |
0,0025 |
0,0025-0,025 |
94,4 |
2,96 |
0,70 |
|
Почва |
0,05-0,5 |
0,05-0,5 |
76,0 |
1,49 |
0,44 |
|
Плоды огурца |
0,025 |
0,025-0,250 |
75,8 |
1,87 |
0,42 |
|
Плоды яблок |
0,025 |
0,025-0,250 |
76,7 |
1,72 |
0,38 |
|
Плоды перца |
0.025 |
0,025-0,250 |
75,2 |
1,46 |
0,68 |
|
Капуста |
0,025 |
0,025-0,250 |
76,6 |
1,6 |
0,75 |
|
Клубни картофеля |
0,025 |
0,025-0,250 |
73,6 |
1,16 |
0,26 |
=0,95, 
=20
Таблица 2
Полнота определения Спинозинов А и Д в воде, почве, плодах огурца, яблок, перца,
клубнях картофеля и капусте (5 повторностей для каждой концентрации)
|
Среда |
Внесено, мг/кг (мг/л) |
Обнаружено, |
Доверительный интервал, ± |
Полнота определения, % | ||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 | ||
|
Спинозин А | ||||||
|
Вода |
0,0025 |
0,0023 |
0,0001 |
92 | ||
|
|
0,005 |
0,0048 |
0,0001 |
96 | ||
|
|
0,010 |
0,0098 |
0,0001 |
98 | ||
|
|
0,025 |
0,0247 |
0,0003 |
98,8 | ||
|
среднее |
|
|
|
96,2 | ||
|
Почва |
0,05 |
0,038 |
0,0011 |
76 | ||
|
|
0,10 |
0,075 |
0,0014 |
75 | ||
|
|
0,25 |
0,191 |
0,0071 |
76,4 | ||
|
|
0,50 |
0,393 |
0,0070 |
79 | ||
|
среднее |
|
|
|
76,6 | ||
|
Плоды огурца |
0,025 |
0,019 |
0,0005 |
76 | ||
|
|
0,05 |
0,038 |
0,0007 |
76 | ||
|
|
0,125 |
0,095 |
0,0019 |
76 | ||
|
|
0,250 |
0,189 |
0,0047 |
75,6 | ||
|
среднее |
|
|
|
75,9 | ||
|
Плоды яблок |
0,025 |
0,019 |
0,0003 |
76 | ||
|
|
0,050 |
0,038 |
0,0007 |
76 | ||
|
|
0,125 |
0,097 |
0,0008 |
77,6 | ||
|
|
0,250 |
0,193 |
0,0010 |
77,2 | ||
|
среднее |
|
|
|
76,7 | ||
|
Плоды перца |
0,025 |
0,019 |
0,0004 |
76 | ||
|
|
0,05 |
0,039 |
0,0010 |
78 | ||
|
|
0,125 |
0,104 |
0,0033 |
83,2 | ||
|
|
0,250 |
0,192 |
0,0028 |
76,8 | ||
|
среднее |
|
|
|
78,5 | ||
|
Капуста |
0,025 |
0,019 |
0,0006 |
76 | ||
|
|
0,05 |
0,038 |
0,0005 |
76 | ||
|
|
0,125 |
0,095 |
0,0023 |
76 | ||
|
|
0,250 |
0,193 |
0,0046 |
77,2 | ||
|
среднее |
|
|
|
76,3 | ||
|
Клубни картофеля |
0,025 |
0,0185 |
0,0005 |
74 | ||
|
|
0,050 |
0,037 |
0,0011 |
74 | ||
|
|
0,125 |
0,096 |
0,0009 |
76,8 | ||
|
|
0,250 |
0,189 |
0,0015 |
75,6 | ||
|
среднее |
|
|
|
75,1 | ||
|
Спинозин Д | ||||||
|
Вода |
0,0025 |
0,0023 |
0,0001 |
92 | ||
|
|
0,005 |
0,0046 |
0,0001 |
92 | ||
|
|
0,010 |
0,0096 |
0,0001 |
96 | ||
|
|
0,025 |
0,0244 |
0,0003 |
97,6 | ||
|
среднее |
|
|
|
94,4 | ||
|
Почва |
0,05 |
0,039 |
0,0011 |
78 | ||
|
|
0,10 |
0,075 |
0,0013 |
75 | ||
|
|
0,25 |
0,189 |
0,0030 |
75,6 | ||
|
|
0,50 |
0,377 |
0,0083 |
75,4 | ||
|
среднее |
|
|
|
76,0 | ||
|
Плоды огурца |
0,025 |
0,019 |
0,0006 |
76 | ||
|
|
0,05 |
0,038 |
0,0004 |
76 | ||
|
|
0,125 |
0,093 |
0,0040 |
74,4 | ||
|
|
0,250 |
0,192 |
0,0051 |
76,8 | ||
|
среднее |
|
|
|
75,8 | ||
|
Плоды яблок |
0,025 |
0,019 |
0,0003 |
76 | ||
|
|
0,050 |
0,038 |
0,0007 |
76 | ||
|
|
0,125 |
0,098 |
0,0008 |
78,4 | ||
|
|
0,250 |
0,191 |
0,0010 |
76,4 | ||
|
среднее |
|
|
|
76,7 | ||
|
Плоды перца |
0,025 |
0,019 |
0,0004 |
76 | ||
|
|
0,05 |
0,037 |
0,0006 |
74 | ||
|
|
0,125 |
0,094 |
0,0034 |
75,2 | ||
|
|
0,250 |
0,189 |
0,0019 |
75,6 | ||
|
среднее |
|
|
|
75,2 | ||
|
Капуста |
0,025 |
0,019 |
0,0005 |
76 | ||
|
|
0,05 |
0,038 |
0,0004 |
76 | ||
|
|
0,125 |
0,096 |
0,0033 |
76,8 | ||
|
|
0,250 |
0,194 |
0,0050 |
77,6 | ||
|
среднее |
|
|
|
76,6 | ||
|
Клубни картофеля |
0,025 |
0,0185 |
0,0003 |
74 | ||
|
|
0,050 |
0,037 |
0,0006 |
74 | ||
|
|
0,125 |
0,091 |
0,0012 |
72,8 | ||
|
|
0,250 |
0,184 |
0,0036 |
73,6 | ||
|
среднее |
|
|
|
73,6 | ||
2.1.3. Избирательность метода
В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых при выращивании огурцов, яблок, перца, капусты и картофеля.
2.2. Реактивы, растворы, материалы и оборудование
2.2.1. Реактивы, материалы и растворы
2.3. Подготовка к определению
2.3.1. Подготовка растворителей
Бидистиллят кипятят в течение 6 ч с марганцово-кислым калием, добавленным из расчета 1 г/л, и затем перегоняют.
Перед началом эксперимента проверяют чистоту ацетонитрила, ацетона, гексана и хлористого метилена. Для этого досуха выпаривают на ротационном вакуумном испарителе 100 мл растворителя, добавляют в концентратор 2 мл ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора и хроматографируют при 245 нм. При недостаточной чистоте растворителей проводят их очистку.
Ацетонитрил перегоняют.
Ацетон перегоняют над небольшим количеством марганцово-кислого калия (Гордон А., Форд Р. Спутник химика. М., 1976. С.438-439).
Гексан встряхивают с концентрированной серной кислотой, промывают бледно-розовым раствором марганцово-кислого калия до тех пор, пока раствор не перестанет обесцвечиваться, затем промывают водой, сушат над безводным хлористым кальцием и перегоняют (Гордон А., Форд Р. Спутник химика. М., 1976. С.441).
Хлористый метилен встряхивают с концентрированной серной кислотой, промывают водным раствором карбоната натрия, водой, сушат над безводным хлористым кальцием и перегоняют над оксидом (V) фосфора (Гордон А., Форд Р. Спутник химика. М., 1976. С.440).
2.3.2. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии
Колонку XTerra MS С18 с предколонкой Symmetry Shield RP 18 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 25 °С и скорости потока подвижной фазы 1 мл/мин в течение 3-4 ч.
2.3.3. Приготовление растворов для проведения анализа
2.3.3.1. Приготовление 2 %-ного раствора уксусно-кислого аммония.
В мерную колбу объемом 1000 мл наливают 300 мл очищенной воды, добавляют 20 г уксусно-кислого аммония, перемешивают, доводят до метки очищенной водой и тщательно перемешивают.
2.3.3.2. Приготовление смеси для растворения образцов и последовательного разведения стандартных растворов.
В колбу объемом 100 мл помещают 50 мл ацетонитрила, добавляют 50 мл метанола и тщательно перемешивают. Фазу используют для растворения стандартов, образцов и последовательного разведения стандартных растворов.
2.3.3.3. Приготовление стандартных растворов.
Спинозин А и Спинозин Д разлагаются под воздействием света. При работе как со стандартными растворами, так и с аналитическими пробами следует соблюдать меры предосторожности: защищать от света (например, обертывать черной бумагой) колбы с экстрактами, патроны Диапак-Амин и Диапак С, концентраторы с сухим остатком экстракта. Процедуру очистки экстрактов в делительных воронках и упаривания экстрактов на ротационном вакуумном испарителе необходимо проводить в затемненной комнате (без включения электрического света и с зашторенным окном).
Взвешивают 10 мг Спинозина А (Спинозина Д) в мерной колбе объемом 100 мл. Навеску растворяют в 100 мл смеси растворителей (ацетонитрил-метанол в соотношении 1:1) для растворения стандартов (стандартный раствор с концентрацией Спинозина А (Спинозина Д) 100 мкг/мл). Затем по 10,0 мл стандартных растворов Спинозина А и Спинозина Д с концентрацией 100,0 мкг/мл отбирают пипеткой в мерную колбу объемом 100 мл и доводят объем до метки смесью растворителей для растворения стандартов при перемешивании (стандартный раствор, содержащий по 10,0 мкг/мл Спинозина А и Спинозина Д). Методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 5,0; 2,5; 1,0; 0,5 и 0,25 мкг/мл Спинозина А и Спинозина Д, и используют эти растворы для хроматографического исследования и внесения в контрольные образцы. Стандартные растворы можно хранить в холодильнике в темной посуде в течение трех месяцев.
2.3.4. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ
Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанные ацетонитрил и очищенную воду.
В плоскодонную колбу объемом 1 л помещают 350 мл ацетонитрила, 350 мл метанола и 200 мл 2%-ного уксусно-кислого аммония. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 мл/мин в течение 5 мин, после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 мин. Полученный раствор используют в качестве подвижной фазы.
2.3.5. Построение калибровочного графика
Для построения калибровочного графика вводят в хроматограф последовательно 3 раза по 20 мкл каждого из стандартных растворов, содержащих по 2,5; 1,0; 0,5 и 0,25 мкг/мл Спинозина А и Спинозина Д, измеряют площадь пиков, рассчитывают среднее значение площади пика для каждой концентрации и строят графики зависимости площади пика от концентрации Спинозина А и Спинозина Д.
2.3.6. Подготовка концентрирующего патрона Диапак-Амин (0,6 г) для очистки экстракта
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 2 мл/мин.
Патрон Диапак-Амин устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 мл (используют как емкость для элюентов).
2.3.6.1. Кондиционирование патрона.
Концентрирующий патрон промывают последовательно 10 мл смеси гексан-ацетон в соотношении 1:1 и 10 мл гексана. Элюат отбрасывают. Нельзя допускать высыхания поверхности картриджа!
2.3.6.2. Проверка хроматографического поведения Спиносада на концентрирующем патроне Диапак-Амин.
Из стандартного раствора, содержащего по 10 мкг/мл Спинозина А и Спинозина Д, отбирают 1 мл, помещают в концентратор объемом 100 мл и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетона, помещают на 30 с в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 мл гексана, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на картридж. Элюат собирают в концентратор и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 2 мл смеси для растворения образцов, тщательно обмывают стенки концентратора и хроматографируют.
Концентратор тщательно обмывают 1 мл ацетона, добавляют туда же 9 мл гексана и смесь также вносят на картридж. Элюат собирают в концентратор и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 2 мл смеси для растворения образцов, тщательно обмывают стенки концентратора и хроматографируют.
Повторяют вышеописанную процедуру еще раз. Определяют фракции, содержащие Спинозин А и Спинозин Д, и объединяют их.
2.3.7. Подготовка концентрирующего патрона Диапак-С (0,6 г) для очистки экстракта
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 2 мл/мин.
Патрон Диапак-С устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 мл (используют как емкость для элюентов).
2.3.7.1. Кондиционирование патрона.
Концентрирующий патрон промывают последовательно 10 мл смеси хлористый метилен-метанол в соотношении 75:25, 10 мл ацетонитрила, 10 мл хлористого метилена и 20 мл смеси гексана. Элюаты отбрасывают. Нельзя допускать высыхания поверхности картриджа!
2.3.7.2. Проверка хроматографического поведения Спиносада на концентрирующем патроне Диапак-С.
Из стандартного раствора Спиносада, содержащего по 10 мкг/мл Спинозина А и Спинозина Д, отбирают 1 мл, помещают в круглодонную колбу объемом 100 мл и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 10 мл гексана, тщательно обмывают стенки концентратора и полученный раствор вносят на картридж. Элюат собирают в концентратор объемом 100 мл и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 2 мл смеси и хроматографируют.
Далее в концентратор добавляют 20 мл гексана, тщательно обмывают стенки концентратора и полученный раствор вносят на картридж. Элюат собирают в концентратор объемом 100 мл и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 2 мл смеси и хроматографируют.
Затем в концентратор добавляют 10 мл хлористого метилена, тщательно обмывают стенки концентратора и полученный раствор вносят на картридж. Элюат собирают в концентратор объемом 100 мл и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 2 мл смеси и хроматографируют.
Далее в концентратор добавляют 5 мл ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора и полученный раствор вносят на картридж. Элюат собирают в концентратор объемом 100 мл и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 2 мл смеси и хроматографируют.
Продолжают элюирование Спинозина А и Спинозина Д двумя порциями по 10 мл смеси ацетонитрил-метанол в соотношении 75:25, обмывая каждый раз концентратор. Элюат после внесения каждой порции растворителей собирают в концентратор и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 2 мл смеси для растворения образцов и хроматографируют. Элюаты, содержащие Спинозин А и Спинозин Д, объединяют и определяют полноту элюирования веществ с патрона, а также необходимый объем растворителей.
Проверку проводят каждый раз перед началом использования новой партии патронов.
2.4. Отбор проб
Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Для длительного хранения пробы почвы подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.
Пробы плодов огурцов и яблок, а также клубни картофеля замораживают и хранят при температуре -18 °С. Непосредственно перед определением пробы измельчают на терке.
2.5. Описание определения
2.5.1. Вода
Пробу воды объемом 200 мл фильтруют через фильтр "красная лента" в делительную воронку емкостью 500 мл, добавляют 50 мл хлористого метилена и интенсивно встряхивают делительную воронку в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний слой хлористого метилена собирают в концентратор, пропуская экстракт через безводный сульфат натрия. Экстракцию Спинозина А и Спинозина Д хлористым метиленом повторяют еще 2 раза порциями по 50 мл, интенсивно встряхивая воронку в течение 2 мин. Каждый раз после разделения фаз в воронке нижний слой (хлористый метилен) собирают в концентратор, пропуская экстракт через безводный сульфат натрия. Осушитель обмывают 10 мл хлористого метилена и смыв объединяют с основным экстрактом. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток после упаривания растворяют в 2 мл смеси ацетонитрил-метанол в соотношении 1:1 и аликвоту 20 мкл вводят в хроматограф.
2.5.2. Почва
2.5.2.1. Экстракция и предварительная очистка экстракта.
Образец почвы массой 20 г помещают в коническую колбу объемом 250 мл, затем добавляют 70 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 8:2 и экстрагируют в течение 5 мин на ультразвуковой ванне и дополнительно встряхивают в течение 10 мин на механическом встряхивателе. Экстракт переносят в центрифужный стакан и центрифугируют при 2500 об./мин 5 мин. Супернатант фильтруют в плоскодонную колбу объемом 250 мл с 5 г поваренной соли через фильтр "красная лента".
Экстракцию повторяют еще два раза, добавляя каждый раз по 70 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 8:2 и экстрагируя по 5 мин на ультразвуковой ванне и дополнительно встряхивают в течении 10 мин на механическом встряхивателе. Экстракт фильтруют в защищенную от света колбу с 5 г поваренной соли, перемешивают и оставляют выстаиваться на 5 мин. Затем объединенный экстракт переносят в делительную воронку (нерастворившуюся соль оставляют в колбе) и после разделения фаз нижний водный слой отбрасывают.
К ацетонитрильному экстракту в делительной воронке добавляют 50 мл гексана и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения фаз отбрасывают выделившийся нижний водный слой (объемом приблизительно 1,0-2,0 мл). Ацетонитрильный слой переносят в коническую колбу с 5 г безводного сульфата натрия, плотно закрывают колбу стеклянной или тефлоновой пробкой и колбу встряхивают на механическом встряхивателе 10 мин. Затем ацетонитрильный экстракт переносят в концентратор объемом 250 мл через слой безводного сульфата натрия, осушитель в колбе промывают 10 мл ацетонитрила, объединяют с основным экстрактом и упаривают досуха при температуре не выше 30 °С.
Сухой остаток в концентраторе растворяют в 5 мл ацетона, добавляют туда же 50 мл дистиллированной воды, 2 мл насыщенного раствора хлористого натрия и переносят в делительную воронку объемом 250 мл. Концентратор обмывают 20 мл хлористого метилена, переносят его в ту же делительную воронку и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний слой хлористого метилена собирают в концентратор через слой безводного сульфата натрия. Экстракцию повторяют еще 2 раза, используя по 20 мл хлористого метилена и интенсивно встряхивая делительную воронку в течение 2 мин. Экстракты (нижний слой) объединяют в концентраторе, пропуская через слой безводного сульфата натрия. Осушитель обмывают 10 мл хлористого метилена, который объединяют с основным экстрактом. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
2.5.2.2. Очистка экстракта на концентрирующих патронах.
Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 мл гексана, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на подготовленный патрон Диапак-Амин. В концентратор помещают 1 мл ацетона, добавляют 9 мл гексана, смесью тщательно обмывают стенки концентратора, перемешивают и полученный раствор также вносят на картридж. Элюаты объединяют и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток подвергают дальнейшей очистке на патроне Диапак С.
Сухой остаток растворяют в 10 мл гексана, тщательно обмывают стенки концентратора и полученный раствор вносят на картридж. Далее в концентратор последовательно добавляют растворители, тщательно обмывая стенки концентратора. Растворы вносят на картридж в следующем порядке, пропуская их через патрон, не допуская его усушения: 20 мл гексана, 10 мл хлористого метилена, 5 мл ацетонитрила. Все элюаты отбрасывают. Спинозин А и Спинозин Д элюируют с патрона 10 мл смеси ацетонитрил-метанол в соотношении 75:25, обмыв предварительно концентратор. Элюат собирают в концентратор и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
Сухой остаток растворяют в 4 мл смеси ацетонитрил-метанол в соотношении 1:1 и аликвоту 20 мкл вводят в хроматограф.
2.5.3. Плоды огурца и яблок
Образец измельченных плодов огурца (яблок) массой 20 г помещают в коническую колбу объемом 250 мл, защищенную от света, прибавляют последовательно 50 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 9:1 и экстрагируют в течение 5 мин на ультразвуковой ванне, дополнительно встряхивая воронку в течение 5 мин на механическом встряхивателе.
Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 50 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 9:1 и экстрагируя по 5 мин на ультразвуковой ванне и дополнительно 5 мин на механическом встряхивателе. Экстракт фильтруют в защищенную от света колбу с 5 г поваренной соли, перемешивают и оставляют выстаиваться на 5 мин. Затем объединенный экстракт переносят в делительную воронку (нерастворившуюся соль оставляют в колбе) и после разделения фаз нижний водный слой отбрасывают.
К ацетонитрильному экстракту в делительной воронке добавляют 50 мл гексана и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения фаз отбрасывают выделившийся нижний водный слой (объемом приблизительно 1,0-2,0 мл). Ацетонитрильный слой переносят в коническую колбу с 5 г безводного сульфата натрия, плотно закрывают колбу стеклянной или тефлоновой пробкой и колбу встряхивают на механическом встряхивателе 10 мин. Затем ацетонитрильный экстракт переносят в концентратор объемом 250 мл через слой безводного сульфата натрия, осушитель в колбе промывают 10 мл ацетонитрила, объединяют с основным экстрактом и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С.
Сухой остаток в концентраторе растворяют в 5 мл ацетона, добавляют туда же 50 мл дистиллированной воды, 2 мл насыщенного раствора хлористого натрия и переносят в делительную воронку объемом 250 мл. Концентратор обмывают 20 мл хлористого метилена, переносят его в ту же делительную воронку и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний слой хлористого метилена собирают в концентратор через слой безводного сульфата натрия. Экстракцию повторяют еще 2 раза, используя по 20 мл хлористого метилена и интенсивно встряхивая делительную воронку в течение 2 мин. Экстракты (нижний слой) объединяют в концентраторе, пропуская через слой безводного сульфата натрия. Осушитель обмывают 10 мл хлористого метилена, который объединяют с основным экстрактом. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
Далее проводят очистку экстракта на концентрирующих патронах, как описано в разделе 2.5.2.2.
Сухой остаток после очистки растворяют в 2 мл смеси ацетонитрил-метанол в соотношении 1:1, и аликвоту 20 мкл вводят в хроматограф.
2.5.4. Клубни картофеля и плоды перца
Образец измельченных клубней картофеля или перца массой 20 г помещают в коническую колбу объемом 250 мл, защищенную от света, прибавляют последовательно 50 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 8:2 и экстрагируют в течение 5 мин на ультразвуковой ванне и дополнительно в течение 5 мин на механическом встряхивателе. Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 50 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 8:2 и экстрагируя по 5 мин на ультразвуковой ванне и дополнительно 5 мин на механическом встряхивателе. Экстракт фильтруют в защищенную от света колбу с 5 г поваренной соли, перемешивают и оставляют выстаиваться на 5 минут. Затем объединенный экстракт переносят в делительную воронку (нерастворившуюся соль оставляют в колбе) и после разделения фаз нижний водный слой отбрасывают. К ацетонитрильному экстракту в делительной воронке добавляют 50 мл гексана и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения фаз отбрасывают выделившийся нижний водный слой (объемом приблизительно 1,0-2,0 мл). Ацетонитрильный слой переносят в коническую колбу с 5 г безводного сульфата натрия, плотно закрывают колбу стеклянной или тефлоновой пробкой и колбу встряхивают на механическом встряхивателе 10 мин. Затем ацетонитрильный экстракт переносят в концентратор объемом 250 мл через слой безводного сульфата натрия, осушитель в колбе промывают 10 мл ацетонитрила, объединяют с основным экстрактом и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С.
Сухой остаток в концентраторе растворяют в 5 мл ацетона, добавляют туда же 50 мл дистиллированной воды, 2 мл насыщенного раствора хлористого натрия и переносят в делительную воронку объемом 250 мл. Концентратор обмывают 20 мл хлористого метилена, переносят его в ту же делительную воронку и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний слой хлористого метилена собирают в концентратор через слой безводного сульфата натрия. Экстракцию повторяют еще 2 раза, используя по 20 мл хлористого метилена и интенсивно встряхивая делительную воронку в течение 2 мин. Экстракты (нижний слой) объединяют в концентраторе, пропуская через слой безводного сульфата натрия. Осушитель обмывают 10 мл хлористого метилена, который объединяют с основным экстрактом. Объединенный экстракт выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
Далее проводят очистку экстракта на патронах, как описано в разделе 2.5.2.2.
Сухой остаток после очистки растворяют в 2 мл смеси ацетонитрил-метанол в соотношении 1:1 и аликвоту 20 мкл вводят в хроматограф.
2.5.5. Капуста
Образец измельченной капусты массой 20 г помещают в коническую колбу объемом 250 мл, защищенную от света, прибавляют 50 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 8:2 и экстрагируют в течение 5 мин на ультразвуковой ванне и дополнительно в течение 5 мин на механическом встряхивателе. Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 50 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 8:2, экстрагируя по 5 мин на ультразвуковой ванне и дополнительно 5 мин на механическом встряхивателе. Экстракт фильтруют в защищенную от света колбу с 5 г поваренной соли, перемешивают и оставляют выстаиваться на 5 мин. Затем объединенный экстракт переносят в делительную воронку (нерастворившуюся соль оставляют в колбе) и после разделения фаз нижний водный слой отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт переносят через химическую воронку с 10 г безводного сульфата натрия в плоскодонную колбу объемом 250 мл с притертой пробкой, осушитель обмывают 15 мл ацетонитрила, объединяют с основным экстрактом и объединенный экстракт помещают в морозильную камеру (температура -18 °С) на 0,5 ч. Затем экстракт фильтруют через фильтр "красная лента" в концентратор объемом 250 мл и осторожно (пенится в начале упаривания) упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
Сухой остаток в концентраторе растворяют в 5 мл ацетона, добавляют туда же 50 мл дистиллированной воды, 2 мл насыщенного раствора хлористого натрия и переносят в делительную воронку объемом 250 мл. Концентратор обмывают 20 мл хлористого метилена, переносят его в ту же делительную воронку и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний слой хлористого метилена собирают в концентратор через слой безводного сульфата натрия. Экстракцию повторяют еще 2 раза, используя по 20 мл хлористого метилена и интенсивно встряхивая делительную воронку в течение 2 мин. Экстракты (нижний слой) объединяют в концентраторе, пропуская через слой безводного сульфата натрия. Осушитель обмывают 10 мл хлористого метилена, который объединяют с основным экстрактом. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
Далее проводят очистку экстракта на патронах, как описано в разделе 2.5.2.2.
Сухой остаток после очистки растворяют в 2 мл смеси ацетонитрил-метанол в соотношении 1:1 и аликвоту 20 мкл вводят в хроматограф.
2.6. Условия хроматографирования и обработка результатов
2.6.1. Условия хроматографирования
Хроматограф "Waters" или другой с аналогичными характеристиками с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны.
Колонка хроматографическая стальная, длиной 150 мм, внутренним диаметром 3,9 мм, зернением 5 мкм ХТегга MS C18 (Waters).
Предколонка стальная, длиной 20 мм, внутренним диаметром 3,9 мм, зернением 5 мкм Symmetry Shield RP 18.
|
Время выхода Спинозина А |
11,0-11,8 мин. |
|||
|
Время выхода Спинозина Д |
14,3-15,4 мин. |
|||
|
Температура колонки |
25 °С. |
|||
|
Подвижная фаза |
ацетонитрил-метанол-2%-ный ацетат аммония в соотношении 35:35:20. |
|||
|
Чувствительность |
0,005 ед. оптической плотности на шкалу. |
|||
|
Объем вводимой пробы |
20 мкл. |
|||
Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 5-50 нг.
2.6.2. Обработка результатов анализа
Содержание Спинозина А и Спинозина Д рассчитывают по формуле:
, где
- содержание Спинозина А (Спинозина Д) в пробе, мг/кг или мг/л;
- высота (площадь) пика стандарта, мм;
- высота (площадь) пика образца, мм;
- концентрация стандартного раствора, мкг/мл;
- объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;
- масса анализируемого образца, г (мл);
- содержание Спинозина А (Спинозина Д) в аналитическом стандарте, %.
3. Требования техники безопасности
Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.
4. Разработчики
Калинин В.А., проф., к.с-х.н.; Довгилевич Е.В., к.биол.н.; Довгилевич А.В., к.хим.н.; Устименко Н.В., к.биол.н.
Московская сельскохозяйственная академия им. К.А.Тимирязева.
Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов". 127550, Москва, Тимирязевская ул., д.53/1. Телефон: (095) 976-37-68, факс: (095) 976-43-26.
Текст документа сверен по:
официальное издание
Определение остаточных количеств пестицидов
в пищевых продуктах, сельскохозяйственном
сырье и объектах окружающей среды:
Сборник методических указаний.
МУК 4.1.1434-4.1.1436а-03
Выпуск 4. Часть 3. -
М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора
Минздрава России, 2004