МУК 4.1.1244-03

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ


4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств карбоксина в воде, почве, зерне
и соломе зерновых колосовых культур методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии

Дата введения 2003-07-01

     
     
     УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 16 марта 2003 г.
     
     

1. Вводная часть

     
     Фирма-производитель: Август.
     
     Торговое наименование: Витарос.
     
     Действующее вещество: карбоксин.
     
     Структурная формула:  
     

     5,6-Дигидро-2-метил-1,4-оксатиин-3-карбоксанилид (IUРАС).
     
     5,6-Дигидро-2-метил-N-фенил-1,4-оксатиин-3-карбоксамид (С.А.).
     
     Брутто формула: CHNOS.
     
     Мол. масса: 235,3.
     
     Белые кристаллы (технический - белый порошок).
     
     Температура плавления: 91,5-92,5 °С и 98-100 °С (в зависимости от типа кристаллов).
     
     Давление паров при 25 °С: 2,5х10  мПа.
     
     Коэффициент распределения н-октанол/вода: 2,2 (25 °С).
     
     Растворимость (мг/л) при 25 °С: ацетон - 177, дихлорметан - 353, метанол - 88, этилацетат - 93, вода - 199 мг/л (при рН 7 и 25 °С).
     
     Вещество устойчиво к гидролизу (25 °С, рН 5-9), быстро разлагается в водных растворах при выдерживании на свету (рН 9, DT3 ч).
     
     Гигиенические нормативы для карбоксина в России:
     
     ОДК в почве - 0,05 мг/кг, ПДК в воде водоемов - 0,02 мг/л; МДУ для зерна хлебных злаков, проса, кукурузы - не допускается.
     
     Область применения препарата. Карбоксин - фунгицид системного действия. Используется для обработки семян против заболеваний проростков ячменя, пшеницы, овса, риса, хлопка, сои, маиса, сорго, овощных и других культур. Не применяется совместно с пестицидами, имеющими в молекуле длинные углеводородные цепи или обладающими кислой реакцией.
     
     

2. Методика определения карбоксина в воде, почве, зерне
и соломе зерновых колосовых методом ВЭЖХ

2.1. Основные положения

     
2.1.1. Принцип метода

     
     Методика основана на определении карбоксина методом ВЭЖХ с использованием УФ детектора после его извлечения из образцов водно-ацетоновой смесью и очистке путем перераспределения между двумя жидкими фазами, а также на колонке с флорисилом.
     

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

     
     Метрологическая характеристика метода представлена в табл.1.
     
     

Таблица 1

     
Метрологическая характеристика метода

     
     
2.1.3. Избирательность метода

     
     Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.
     
     

2.2. Реактивы и материалы

     
     
2.3. Приборы и посуда

     
     
2.4. Отбор проб

     
     Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Пробы растительных материалов хранятся до анализа в морозильной камере при температуре -18 °С. Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, пробы зерна измельчают на лабораторной, а соломы - на ножевой мельнице. Пробы воды хранят в холодильнике при температуре не выше 4 °С в течение 3 суток, при температуре -18 °С - в течение месяца.
     
     

2.5. Подготовка к определению

     
2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

     
     Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.
     
     Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташем (на 1 л ацетона 10 г KМnО и 2 г KСО).
     
     Ацетонитрил сушат над пентаксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием.
     

2.5.2. Кондиционирование колонки

     
     Перед началом анализа колонку Symmetry-C18 кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 мл/мин) до стабилизации нулевой линии в течение 1-2 ч.
     

2.5.3. Приготовление растворов

     
     Для получения 50%-го водного ацетона в колбе емкостью 1 л смешивают 500 мл ацетона с 500 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры. Для приготовления подвижной фазы смешивают 450 мл ацетонитрила с 550 мл бидистиллированной воды в колбе на 1000 мл, смесь фильтруют, при необходимости дегазируют. Для приготовления элюента N 2 в колбе на 1000 мл смешивают 700 мл н-гексана и 300 мл ацетона. Для приготовления 20% раствора хлористого натрия 200 г кристаллического NaCl помещают в мерную колбу на 1 л, растворяют при перемешивании в 800 мл дистиллированной воды и доводят объем раствора до метки.
     

2.5.4. Приготовление стандартного и градуировочных растворов

     
     Берут точную навеску карбоксина (50 мг), переносят в мерную колбу на 50 мл, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки (стандартный раствор с концентрацией 1,0 мг/мл). Градуировочные растворы с концентрациями 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 и 2,0 мкг/мл готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы, смесь ацетонитрил-бидистиллированная вода (45:55, по объему). Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0-4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.
     
     Внимание! Карбоксин быстро разлагается в водных растворах на свету (см. п.1), поэтому следует избегать попадания прямого света на пробы и стандартные растворы.
     

2.5.5. Построение градуировочного графика

     
     Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация карбоксина в растворе) в хроматограф вводят по 50 мкл градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации карбоксина в градуировочном растворе (мкг/мл).
     

2.5.6. Подготовка колонки с флорисилом для очистки экстракта

     
     В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 30 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из ваты и вносят суспензию 5 г флорисила в 20 мл гексана. Колонку промывают 40 мл смеси гексан-ацетон (70:30, по объему), затем 40 мл гексана со скоростью 1-2 капли в секунду, после чего она готова к работе.
     

2.5.7. Проверка хроматографического поведения карбоксина на колонке с флорисилом

     
     В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора карбоксина с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 5 мл гексана и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 мл гексана и также наносят на колонку. Промывают колонку 25 мл гексана, затем 50 мл элюента N 2 со скоростью 1-2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п.2.5.3) и анализируют на содержание карбоксина по п.2.6.5.
     
     Фракции, содержащие карбоксин, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п.2.6.5. Расчитывают содержание карбоксина в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для очистки экстракта объем элюента.
     
     Примечание: профиль вымывания карбоксина может меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.
     
     

2.5.8. Подготовка приборов и средств измерения

     
     Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями стандартов и технической документации.
     
     

2.6. Проведение определения

     
2.6.1. Определение карбоксина в воде

     
     Образец предварительно отфильтрованной воды объемом 100 мл переносят в делительную воронку емкостью 250 мл и промывают дважды гексаном порциями по 50 мл, встряхивая каждый раз в течение 2-3 мин и отбрасывая после расслаивания верхний органический слой. Затем добавляют к воде 100 мл 20%-ного раствора NaCl и экстрагируют карбоксин гексаном трижды порциями по 50 мл, встряхивая каждый раз в течение 2-3 мин. Объединенный экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10-15 мл гексана. После этого экстракт упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. При необходимости проводят дополнительную очистку экстракта на колонке с силикагелем по п.2.6.4.
     
     Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 50 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.
     

2.6.2. Экстракция карбоксина из проб почвы, зерна и соломы пшеницы

     
     Образец воздушно-сухой почвы, измельченной на ножевой мельнице соломы, массой 10 г или предварительно размолотого на зерновой мельнице зерна, массой 20 г, помещают в коническую колбу емкостью 250 мл с притертой пробкой, добавляют 50 мл 50%-ного водного ацетона и экстрагируют в течение 15 мин на ультразвуковой бане. Суспензию фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют дважды с 50 мл 50%-ного водного ацетона. Объединенные экстракты упаривают до водного остатка (70-75 мл) на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С.
     

2.6.3. Очистка экстрактов

     
     Объем водного остатка доводят до 100 мл, переносят в делительную воронку объемом 250 мл и промывают дважды гексаном порциями по 50 мл, встряхивая каждый раз в течение 2-3 мин и отбрасывая после расслаивания верхний гексановый слой. Затем добавляют 100 мл 20%-ного раствора NaCl и карбоксин экстрагируют гексаном трижды по 50 мл, встряхивая делительную воронку каждый раз по 2-3 мин. Объединенный экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10-15 мл гексана. Полученный раствор упаривают на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С до объема 5 мл. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п.2.6.4.
     
     * В случае образования сравнительно стойких эмульсий на стадии промывки экстрактов гексаном для сокращения времени расслоения можно добавить в делительную воронку небольшое количество (до 10 мл) этилового спирта.
     
     ** В случаях, когда очистка экстрактов контрольных проб (п.2.6.3) дает удовлетворительные результаты дополнительную очистку на колонке с флорисилом можно исключить.
     

2.6.4. Очистка на колонке с флорисилом

     
     Концентрированный раствор в колбе, полученный при упаривании очищенных по п.п.2.6.2 и 2.6.3 экстрактов растительного материала или почвы, количественно переносят в кондиционированную хроматографическую колонку (п.2.5.6). Колбу обмывают еще 5 мл гексана. Промывают колонку 25 мл гексана, которые отбрасывают. Карбоксин элюируют 50 мл элюента N 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 50 мл. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 50 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.
     

2.6.5. Условия хроматографирования

     
     Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки.
     
     Колонка Symmetry - С18 (250х4,6) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA).
     
     Температура колонки 25±1 °С.
     
     Предколонка Waters Symmetry С-18 (20х3,9) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA) для защиты аналитической колонки.
     
     Подвижная фаза: ацетонитрил-вода в соотношении 45:55 (по объему).
     
     Скорость потока элюента: 1 мл/мин
     
     Рабочая длина волны 250 нм
     
     Объем вводимой пробы 50 мкл.
     
     Время удерживания карбоксина 9,8±0,1 мин
     
     Линейный диапазон детектирования 0,1-2,00 мкг/мл
     
     Альтернативные условия хроматографирования:
     
     Жидкостный хроматограф "Gold System" (Beckman, USA), снабженный двойным насосом и спектрофотометрическим детектором с диодной матрицей.
     
     Колонка Spherisorb Phenyl (250х4,6) мм, зернение 5 мкм (Sigma-Aldrich, USA).
     
     Предколонка Spherisorb Phenyl (250x3,9) мм, зернение 5 мкм (Sigma-Aldrich, USA) для защиты аналитической колонки.
     
     Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,05М раствор NaHPO (доведенный до рН 2,7-2,8 добавлением ортофосфорной кислоты) в соотношении 12:88 (по объему).
     
     Скорость потока элюента: 1 мл/мин
     
     Рабочая длина волны 250 нм
     
     Объем вводимой пробы 50 мкл.
     
     Время удерживания карбоксина 15,1±0,2 мин
     
     Линейный диапазон детектирования 0,1-2,00 мкг/мл
     

2.6.6. Обработка результатов анализа

     
     Количественное определение проводят методом абсолютной градуировки, содержание карбоксина в образцах воды, почвы или растительных материалов (, мг/кг) вычисляют по формуле:
     

, где

     
      - площадь пика карбоксина в стандартном растворе, ед.адс.с;
     
      - площадь пика карбоксина в анализируемой пробе, ед.адс. с;
     
      - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, мл;
     
      - навеска анализируемого образца, г (для воды - объем, мл);
     
      - концентрация стандартного раствора карбоксина, мкг/мл.
     
     Содержание остаточных количеств карбоксина в анализируемом образце вычисляют как среднее из 3 параллельных определений.
     
     Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор карбоксина 2 мкг/мл, разбавляют.
     
     

3. Требования техники безопасности

     
     При проведении работы необходимо соблюдать требования инструкции "Основные правила безопасной работы в химической лаборатории", общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, а также инструкции по эксплуатации жидкостного хроматографа и электрооборудования до 400 В.
     
     

4. Контроль погрешности измерений

     
     Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа.
     
     

5. Разработчики

     
     Юзихин О.С., Черменская Т.Д., Цибульская И.А., Долженко В.И.
     
     Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений. (186608, Санкт-Петербург, г.Пушкин).
     
     
     
Текст документа сверен по:
официальное издание
Определение остаточных количеств пестицидов
в пищевых продуктах, сельскохозяйственном сырье
и объектах окружающей среды: Сб. методических указаний.
Выпуск 2. Часть 9. МУК 4.1.1244-03, МУК 4.1.1246-03,
МУК 4.1.1247-03. -
М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии
Роспотребнадзора, 2005