ГОСТ Р 51427-99
Группа Н59
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
СОКИ ЦИТРУСОВЫЕ
Метод определения массовой концентрации гесперидина и нарингина
с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии
Citrus juices. Method for determination of hesperidin and naringin mass concentration
using high performance liquid chromatography
ОКС 67.160.20
ОКСТУ 9109
Дата введения 2001-01-01
Предисловие
1 РАЗРАБОТАН Всероссийским научно-исследовательским институтом консервной и овощесушильной промышленности (ВНИИКОП)
ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 93 "Продукты переработки плодов и овощей"
2 ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 22 декабря 1999 г. N 582-ст
3 Стандарт гармонизирован с европейским стандартом ЕН 12148:1996 "Соки фруктовые и овощные. Определение гесперидина и нарингина в цитрусовых соках. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии"
4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
5 ПЕРЕИЗДАНИЕ
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на цитрусовые соки и устанавливает метод определения массовой концентрации гесперидина и нарингина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Диапазон определения массовой концентрации гесперидина и нарингина - от 300 до 2000 мг/дм
.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 61-75 Кислота уксусная. Технические условия
ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 5712-78 Аммоний щавелевокислый 1-водный. Технические условия
ГОСТ 20289-74 Диметилформамид. Технические условия
ГОСТ 24104-88* Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия
_______________
* С 1 июля 2002 г. вводится в действие ГОСТ 24104-2001.
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 26313-84 Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб
ГОСТ 26671-85 Продукты переработки плодов и овощей, консервы мясные и мясорастительные. Подготовка проб для лабораторных анализов
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
ГОСТ Р 51431-99 Соки фруктовые и овощные. Метод определения относительной плотности
ИСО 3696-87* Вода для лабораторного анализа. Технические условия и методы испытаний
_______________
* Действует до введения в действие ГОСТ Р, разработанного на основе стандарта ИСО.
3 Сущность метода
Метол основан на экстракции гесперидина и нарингина из пробы сока раствором диметилформамида при нагревании и количественном определении их массовых концентраций в экстракте с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с применением обращенно-фазовой колонки и спектрофотометрического детектора в ультрафиолетовой области спектра.
4 Средства измерений, лабораторное оборудование, реактивы и материалы
Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 20 г, 2-го класса точности.
Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г, 2-го класса точности.
Жидкостный хроматограф, состоящий из:
- насоса высокого давления с верхним пределом давления не менее 25 МПа и диапазоном регулирования подачи растворителя от 0,1 до 5 см
/мин;
- петлевого устройства ввода пробы (инжектора) с рабочим объемом петли 0,020 см
;
- спектрофотометрического детектора с переменной длиной волны, позволяющего проводить измерение оптической плотности при длине волны 287 нм, или детектора с фиксированной длиной волны, позволяющего проводить измерения оптической плотности при длине волны 280 нм, снабженного проточной кварцевой кюветой вместимостью не более 0,01 см
, с относительной погрешностью измерения оптической плотности не более 2%;
- регистрирующего устройства (самописца или интегратора), позволяющего проводить измерения при чувствительности 0,2 мВ/см, с погрешностью записи в рабочих условиях не более 0,5%;
- колонки длиной 250 мм, внутренним диаметром 4 или 4,6 мм, заполненной обращенно-фазовым сорбентом с привитыми октадецильными группами размером частиц 5 мкм.
Микрошприц вместимостью, обеспечивающей полное заполнение петли инжектора.
Баня водяная, пригодная для поддержания температуры (90±2) °С.
Колбы мерные по ГОСТ 1770 вместимостью 50, 100 и 1000 см.
Цилиндры по ГОСТ 1770 вместимостью 250 и 1000 см
.
Фильтры мембранные размером пор не более 0,5 мкм.
Пипетка по ГОСТ 29227 типа 2 исполнения 1, 1-го класса точности вместимостью 2 и 10 см.
Аммоний щавелевокислый 1-водный (оксалат аммония) по ГОСТ 5712, х.ч.
Ацетонитрил для жидкостной хроматографии [1], х.ч.
Диметилформамид по ГОСТ 20289, х.ч.
Кислота уксусная по ГОСТ 61, х.ч.
Вода для лабораторного анализа по ИСО 3696 категории 1.
Нарингин (нарингенин-7-неогесперидозид).
Гесперидин (гесперидин-7-рутинозид).
Допускается использование других средств измерений, лабораторного оборудования и реактивов, по метрологическим и техническим характеристикам не уступающих перечисленным выше.
5 Отбор и подготовка проб
5.1 Отбор проб - по ГОСТ 26313.
5.2 Подготовка проб к испытаниям - по ГОСТ 26671.
Концентрированные продукты разводят водой до заданного значения относительной плотности в соответствии с нормативным или техническим документом на конкретный вид продукта. Относительную плотность разбавленной пробы определяют по ГОСТ Р 51431 и найденное значение указывают в протоколе испытаний.
6 Подготовка к проведению испытаний
Для приготовления растворов, используемых при проведении испытания, и подвижной фазы для ВЭЖХ используют только воду для лабораторного анализа категории 1 по ИСО 3696.
6.1 Приготовление стандартных растворов гесперидина и нарингина
Навески гесперидина и нарингина массой 120 мг каждая переносят в мерные колбы вместимостью 100 см. В колбы вносят по 20 см диметилформамида. Содержимое колб перемешивают до полного растворения кристаллов гесперидина и нарингина, затем объем содержимого в колбах доводят до отметки раствором уксусной кислоты концентрации 
(СНСООН)=0,01 моль/дм
, содержимое колб тщательно перемешивают. Из полученных основных растворов гесперидина и нарингина массовой концентрации 1200 мг/дм готовят рабочие растворы гесперидина и нарингина массовой концентрации 120, 60, 30 и 15 мг/дм
точным разведением основных растворов в соответствующее количество раз смесью раствора уксусной кислоты концентрации 
(СН
СООН)=0,01 моль/дм
и диметилформамида (8:2 по объему). Срок годности основных и рабочих растворов гесперидина и нарингина - 30 сут при хранении при температуре около 4 °С.
6.2 Приготовление раствора оксалата аммония концентрации 
[(NH
)
C
O·Н
О] = 0,025 моль/дм
Навеску оксалата аммония массой 3,55 г переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см
, растворяют в 100 - 200 см
воды, объем содержимого в колбе доводят водой до отметки.
6.3 Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ
Подвижную фазу для ВЭЖХ готовят смешиванием 200 см
ацетонитрила, 800 см
воды и 0,5 см
уксусной кислоты.
7 Проведение испытаний
7.1 Экстракция гесперидина и нарингина из пробы сока
Проводят два параллельных определения.
В мерную колбу вместимостью 50 см
пипеткой вносят 10 см
исследуемой пробы, 10 см
раствора оксалата аммония концентрации 0,025 моль/дм
и 10 см
диметилформамида. Объем содержимого в колбе доводят водой до отметки, содержимое колбы тщательно перемешивают. После этого колбу с раствором выдерживают на водяной бане при температуре 90 °С в течение 10 мин, затем колбу с раствором охлаждают до комнатной температуры и содержимое колбы фильтруют через мембранный фильтр. Фильтрат используют для хроматографического анализа.
7.2 Хроматографический анализ
Хроматографический анализ рабочих стандартных растворов гесперидина и нарингина и экстрактов из пробы, приготовленных по 7.1, проводят при следующих условиях:
Состав подвижной фазы - по 6.4;
Скорость потока подвижной фазы - 1,0 см/мин;
Длина волны детектора - 287 нм для детектора с переменной длиной волны;
280 нм для детектора с фиксированной длиной волны; |
Чувствительность детектора - 0,05-0,2 единиц оптической плотности на полную шкалу;
Объем анализируемого раствора - полное заполнение петли инжектора.
Анализ рабочих стандартных растворов проводят непосредственно перед анализом каждой серии экстрактов.
Регистрируют площади пиков и время удерживания гесперидина и нарингина.
Если площадь пика анализируемого вещества в экстракте из пробы превышает площадь пика этого вещества в рабочем стандартном растворе наибольшей концентрации, экстракт из пробы разводят водой, используя пипетку и мерную колбу подходящей вместимости, и проводят его повторный хроматографический анализ.
Из-за ограниченной стабильности экстрактов продолжительность проведения испытания не должна превышать 24 ч.
8 Обработка и оформление результатов
Обработку результатов испытания проводят по методу внешнего стандарта, исходя из линейной зависимости площади пика от концентрации гесперидина и нарингина.
Массовую концентрацию гесперидина или нарингина , мг/дм
, вычисляют по формуле
, (1)
где 
- площадь пика гесперидина или нарингина при анализе экстракта из пробы, ед. площ.;
- объем, до которого доведена проба при приготовлении экстракта, см
;
- объем пробы, взятый для приготовления экстракта, см
;
- грацуировочный коэффициент соответственно для нарингина или геспервдина, ед. площ. х дм
/мг, рассчитываемый по формуле
, (2)
где 
- площадь пика гесперидина или нарингина при анализе рабочего стандартного раствора, ед. площ.;
- концентрация гесперидина или нарингина в рабочем стандартном растворе, мг/дм
.
Примечание - При необходимости определения нарингина и гесперидина в навеске массовую долю этих веществ в продукте 
, мг/кг, вычисляют по формуле
, (3)
где 
- масса навески, г.
Вычисления проводят до первого десятичного знака.
Относительное расхождение между результатами двух определений, выполненных одним оператором при анализе одной и той же пробы, с использованием одних и тех же средств измерений и реактивов, в течение возможно минимального интервала времени, не должно превышать норматива оперативного контроля сходимости 6% (=0,95). При соблюдении этого условия за окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое результатов двух параллельных определений, округленное до целого значения.
Относительное расхождение между результатами двух определений, выполненных в двух лабораториях при анализе одной и той же пробы, не должно превышать норматива оперативного контроля воспроизводимости, 16% (=0,95).
Пределы относительной погрешности определения массовой концентрации гесперидина и нарингина при соблюдении условий, регламентируемых настоящим стандартом, не превышают ±11% (
=0,95).
В протоколе испытаний указывают:
- информацию, необходимую для идентификации исследуемого продукта (вид продукта, происхождение, шифр);
- ссылку на настоящий стандарт;
- дату и способ отбора проб (по возможности);
- дату получения пробы для испытаний;
- дату проведения испытаний;
- результат испытаний с указанием погрешности и единицы измерений;
- соблюдение норматива контроля сходимости результатов;
- особенности проведения испытаний (разведение концентрированной пробы, относительную плотность разведенной пробы и пр.);
- отклонения условий проведения испытаний от описанных в стандарте, которые могли повлиять на результат.
ПРИЛОЖЕНИЕ А
(справочное)
Библиография
[1] ТУ 6-09-06-1092-83 Ацетонитрил для жидкостной хроматографии
Текст документа сверен по:
официальное издание
Соки. Технические условия. Методы анализа:
Сб. ГОСТов - М.: ИПК Издательство стандартов, 2002