МУК 4.2.1783-03

     
     
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

     
     
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

     
Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма
Penicillium canescens F-832 - продуцента ксиланазы в воздухе рабочей зоны

     
     
Дата введения 2003-12-01

     
     
     1. РАЗРАБОТАНЫ: Российским государственным медицинским университетом (к.б.н. Н.И.Шеиной).
     
     2. УТВЕРЖДЕНЫ Первым заместителем министра здравоохранения Российской Федерации - Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 24 октября 2003 г.
     
     3. ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ с 1 декабря 2003 г.
     
     4. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.
     
     

1. Общие положения и область применения

     
     Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Penicillium canescens F-832 - продуцента ксиланазы в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 м воздуха.
     
     Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования" и ГОСТ Р 8.563-96 "Методики выполнения измерений".
     
     Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.
     
     

2. Характеристика штамма-продуцента ксиланазы

     
     Микроорганизм Penicillium canescens F-832 является продуцентом фермента ксиланазы. Штамм растет на различных агаризованных и жидких средах. Культура образует цепочки спор, обычно прямые или слегка извилистые, с гладкой оболочкой. На твердом сусло-агаре на 3 сутки роста при температуре 30 °С образует округлые радиально-складчатые морщинистые колонии с кремовым или сероватым налетом, диаметром 2-3 мм. На 4-5 сутки инкубации размеры колонии достигают 5-7 мм, конфигурация и складчатость колоний не изменяется, образуется воздушный мицелий со спорами бежевато-ceporo цвета, подошва колоний оранжево-коричневая.
     
     Штамм устойчив практически ко всем широко известным антибиотикам.
     
     ПДК штамма в воздухе рабочей зоны 2000 кл/м, А.
     
     

3. Пределы измерений

     
     Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток продуцента ксиланазы в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 м воздуха при доверительной вероятности 0,95.
     
     

4. Метод измерений

     
     Прямой метод основан на аспирации из воздуха клеток продуцента ксиланазы на поверхность плотной питательной среды (сусло-агар) и подсчета выросших колоний по типичным морфологическим признакам.
     
     Косвенный метод измерения концентрации штамма-продуцента основан на аспирации из воздуха микробных клеток на поверхность плотной питательной селективной среды и подсчета выросших колоний по зонам просветления, образующихся вокруг каждой колонии штамма как результат продукции ксиланазы на среде с окрашенной целлюлозой.
     
     

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

     
     При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.
     

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

     
5.2. Реактивы, растворы

6. Требования безопасности

     
     При выполнении измерений концентрации клеток продуцента ксиланазы в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.
     
     6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.
     
     6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.
     
     6.3. "Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977).
     
     6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
     
     

7. Требования к квалификации операторов

     
     К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
     
     

8. Условия измерений

     
     Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20±5 °С), атмосферном давлении 630-800 мм рт.ст. и влажности воздуха не более 80%.
     
     

9. Проведение измерения

     
9.1. Условия отбора проб воздуха

     
     Для определения продуцента ксиланазы воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (1-10 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента.
     
     Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска, прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
     

9.2. Выполнение анализа

     
     Прямой метод предполагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний выросших на 3-5 сутки после посева воздуха и позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.
     
     Сусло-агар расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор одного из антибиотиков из расчета 50 мкл на 1 мл среды (пенициллин, стрептомицин, цефалотин или другой), для подавления посторонней бактериальной микрофлоры) и нистатина или амфотерицина 15 мкг/мл для подавления грибковой флоры. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.
     
     При выполнении анализа воздуха рабочей зоны косвенным методом селективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют 50 мг/л бенгальского розового, растворенного в 1 мл диметилсульфоксида, тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Бенгальский розовый предназначен для специфического окрашивания целлюлозы и для ограничения разрастания колоний на чашках.
     
     После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 30 °С. На 3-5 сутки производят подсчет выросших типичных колоний продуцента по культурально-морфологическим признакам или по зонам просветления вокруг колоний как результат действия ксиланазы на окрашенную целлюлозу. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.
     
     

10. Вычисление результатов измерения

     
     Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м воздуха производят по формуле:
     

, кл./м,

     
где  -  концентрация клеток продуцента в воздухе;
     
      - количество колоний продуцента, выросших на чашке;
     
     1000 - коэффициент пересчета на 1 м воздуха;
     
      - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).
     
     В случае невозможности использования аппарата Кротова, рекомендуется применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 30 мин. При использовании этого метода пользуются следующим расчетом концентрации клеток продуцента:
     
     эмпирически установлено, что за 5 мин на площадь 100 см оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, за 1 мин - 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм равна 78,54 см.
     
     Составляем пропорцию:
     
     на 100 см за 1 мин оседает 2 л воздуха  
     
     на 78,54 см-                      л
     
     =1,57 л/мин

     
     Следовательно, на стеклянную чашку Петри за 1 мин оседает 1,57 л воздуха.
     
     Надо определить количество клеток в 1 м воздуха.
     
     На 1 чашку (диаметр 100 мм) за 1 мин оседает количество микробов, содержащихся в 1,57 л воздуха, за  мин - 1,57 л.
     
     В этом количестве содержится  колониеобразующих единиц (микробных клеток - спор, обрывков мицелия), а в 1 м воздуха содержится     

     
     Пример: за 30 мин седиментации выросло 12 колоний микроорганизма. В 1 м воздуха содержится
     

 клетки

11. Оформление результатов измерений

     
     Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

Протокол N
количественного микробиологического анализа штамма Рenicillium canescens F-832 -
продуцента ксиланазы в воздухе рабочей зоны

     
Результаты микробиологического анализа

     
     
     Ответственный исполнитель
     
     Научный руководитель
     
     

Список литературы

     
     1. ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования".
     
     2. ГОСТ 8.563-96*. ГСИ "Методики выполнения измерений".
 ______________
     * Вероятно ошибка оригинала. Следует читать ГОСТ Р 8.563-96. ГСИ "Методики выполнения измерений". - Примечание .
     
     3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности. - М., 1980. 27 с.
     
     4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. - М., 1977. 7 с.



Текст документа сверен по:
официальное издание

Методические указания. -
М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора

Минздрава России, 2004