МУК 4.1.1213-03

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ


4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

    
Определение остаточных количеств Азоксистробина (ICI А 5504)
и его геометрического изомера (R-230310) в воде, почве, в плодах огурцов,
томатов, ягодах винограда, в зерне и соломе зерновых колосовых культур
методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Дата введения 2003-07-01

    1. Подготовлены: Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф.Эрисмана (чл.-кор. РАМН, проф. В.Н.Ракитский, проф. Т.В.Юдина); Московской сельскохозяйственной академией им. К.А.Тимирязева (проф. В.А.Калинин, к.хим.н. Довгилевич А.В.); при участии Департамента госсанэпиднадзора Минздрава России (А.П.Веселов). Разработчики методик указаны в конце каждой из них.
    
    2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по госсанэпиднормированию при Минздраве России.
    
    3. УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г.Онищенко 16 марта 2003 г.
    
    4. ВВЕДЕНЫ с 1 июля 2003 г.
    
    5. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.
    

1. Вводная часть

    
    Фирма-производитель: Сингента АГ, Швейцария.
    
    Торговое название: Амистар Ф, СК (250 г/л), ICIA 5504, AZ5504.
    
    Название действующего вещества по ИСО: Азоксистробин.
              

    Название действующего вещества по ИЮПАК:
    
    метил (Е)-2-{2-[6-(2-циано-фенокси)пиримидин-4-илокси]фенил}-3-метоксиакрилат.

    
    Структурная формула:
    
    

    
    
    Эмпирическая формула: СНNО.
    
    Молекулярная масса: 403,4.
    
    Химически чистый Азоксистробин представляет собой бесцветное кристаллическое вещество без запаха.
    
    Давление паров 1,1х10.
    
    Температура плавления 166 °С.
    
    Коэффициент распределения н-октанол-вода: Ko/w = 440, lg P o/w = 2,64.
    
    Растворимость в воде зависит от кислотности среды и составляет при 25 °С 6,2 (рН 5,2), 6,7 (рН 7,0), 5,9 (рН 9,2) мг/л.
    
    Растворимость в органических растворителях (г/л при 20 °С): ацетон - 86, ацетонитрил - 340, гексан - 0,057, дихлорметан - 400, метанол - 20, толуол - 55, этилацетат - 130, н-октанол - 1,40 г/л.
    
    Азоксистробин стабилен в водных растворах при рН 3-10 при комнатной температуре, в т.ч. при концентрациях менее 1 мкг/кг.
    
    Период полураспада в почве в полевых условиях от 3 до 39 дней. Основным путем разложения вещества в почве является фотолиз с образованием геометрического Z-изомера.
    
    Краткая гигиеническая характеристика: Азоксистробин относится к мало опасным веществам по острой оральной (ЛД /крысы/ свыше 5000 мг/кг) и дермальной (ЛД /крысы/ свыше 2000 мг/кг) токсичности, но умеренно опасным по ингаляционной (ЛД /крысы/ 0,698-0,962 мг/кг) токсичности. Не обладает побочными токсикологическими эффектами, может вызвать слабое раздражение при попадании на кожу и слизистую оболочку глаз.
    
    В России для Азоксистробина установлены следующие гигиенические нормативы:
    
    ДСД - 0,003 мг/кг массы тела человека;
    
    ПДК в воде - 0,01 мг/л;
    
    ОДК в почве - 0,4 мг/кг;
    
    МДУ в винограде, огурцах и томатах - 0,2 мг/кг;
    
    ВМДУ в зерне хлебных злаков - 0,2 мг/кг.
    
    Область применения: Азоксистробин - фунгицид из группы стробилуринов системного и контактного действия с длительным защитным эффектом. Высокоэффективен против возбудителей ложной и мучнистой настоящей росы, в т.ч. против рас возбудителя, устойчивых к Металаксилу и производным триазола. Зарегистрирован в России и странах СНГ в качестве фунгицида на томатах и огурцах открытого и защищенного грунта с нормой расхода 25% суспензионного концентрата 0,4-0,6 л/га, а также на виноградниках с нормой расхода 0,6-0,8 л/га при 1-2 кратной обработке. Проходит регистрационные испытания на зерновых колосовых культурах с нормой расхода при двукратной обработке посевов с нормой расхода до 1,0 л препарата на гектар.
    
    R-230310 - Z-геометрический изомер Азоксистробина.
    
    Название действующего вещества по ИСО: метил (Z)-2-{2-[6-(2-цианофенокси)-пиримидин-4-илокси]фенил}-3-метоксиакрилат.
    
    Структурная формула:
    
    

    
    
    R-230310 представляет собой кристаллический порошок желтого цвета.
    
    Физико-химические свойства близки к таковым Азоксистробина.
    
    Основной метаболит в процессе фотолиза основного вещества.
    
    Данные по токсикологии вещества фирмой не представлены.
    

2. Методика определения Азоксистробина и его геометрического изомера в воде, почве, плодах огурцов и томатов, ягодах винограда, в зерне и соломе зерновых колосовых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

    
2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

    
    Методика основана на определении Азоксистробина и его геометрического изомера методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием ультрафиолетового детектора после их экстракции из образцов органическим растворителем, концентрирования экстракта упариванием в вакууме, переэкстракции и очистки на колонках с Флорисилом или концентрирующих патронах Диапак С, Диапак С8 и Диапак-Амин. Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.
    

2.1.2. Метрологическая характеристика метода.

    
    Метрологическая характеристика метода представлена в табл.1-4.
    
    

Таблица 1

Азоксистробин

    
    
Таблица 2

Метаболит Азоксистробина R-230310

    
    
Таблица 3

Полнота определения Азоксистробина в воде, почве, плодах огурцов и томатов,
ягодах винограда, зерне и соломе зерновых колосовых культур
(5 повторностей для каждой концентрации)

    
    
Таблица 4

Полнота определения R-230310 в воде, почве, плодах огурцов и томатов,
ягодах винограда, зерне и соломе зерновых колосовых культур
(5 повторностей для каждой концентрации)

    
    
    2.1.3. Избирательность метода
    
    В прилагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых при выращивании огурцов и томатов, зерновых колосовых культур, а также при возделывании винограда.
    

2.2. Реактивы, растворы, материалы и оборудование

    
    2.2.1. Реактивы, материалы и растворы
    

    
    2.2.2. Приборы и оборудование
    

2.3. Подготовка к определению

    
    2.3.1. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии
    
    Колонку Kromasil 100-5C8 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 30 °С и скорости потока соответствующей подвижной фазы 0,5-1 мл/мин в течение 3-4 ч.
    
    Колонку Zorbax SB С-18 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 25 °С и скорости потока соответствующей подвижной фазы 1 мл/мин в течение 3-4 ч.
    
    2.3.2. Приготовление стандартных растворов
    
    Взвешивают 50 мг Азоксистробина в мерной колбе объемом 50 мл. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом (стандартный раствор N 1, концентрация Азоксистробина -1 мг/мл).
    
    Взвешивают 50 мг геометрического изомера Азоксистробина R-230310 в мерной колбе объемом 50 мл, растворяют в ацетонитриле, доводят до метки ацетонитрилом (стандартный раствор N 2, концентрация геометрического изомера Азоксистробина R-230310 - 1 мг/мл). Стандартные растворы N 1 и 2 можно хранить в холодильнике в течение 6 месяцев.
    
    В мерную колбу объемом 100 мл помещают по 1 мл стандартных растворов N 1 и 2, доводят до метки ацетонитрилом, в результате чего получают объединенный стандартный раствор N 3 с концентрацией Азоксистробина и геометрического изомера R-230310 - 10 мкг/мл (каждого). Из объединенного стандартного раствора N 3 методом последовательного разведения готовят объединенные стандартные растворы Азоксистробина и геометрического изомера R-230310 в ацетонитриле (или в подвижной фазе ацетонитрил-вода в соотношении 25:75 для проведения анализов на колонке Kromasil 100-5C8) с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2; 0,1 мкг/мл соответственно и используют эти растворы для хроматографического исследования, построения калибровочной кривой и внесения в контрольные образцы.
    
    2.3.3. Приготовление растворов для жидкостной хроматографии
    
    Для приготовления подвижной фазы при анализе образцов воды, почвы, плодов огурцов и томатов используют свежеперегнанные ацетонитрил и дистиллированную воду.
    
    В плоскодонную колбу объемом 1 л помещают 400 мл ацетонитрила и 600 мл очищенной воды. Смесь тщательно перемешивают, затем пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 мл/мин в течение 5 мин, после чего помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин для удаления растворенных газов. Полученный раствор используют в качестве подвижной фазы.
    
    Для растворения сухого остатка после экстракции и очистки образцов воды, почвы, плодов огурцов и томатов применяют смесь ацетонитрила с водой в соотношении 25:75 по объему (для проведения анализов на колонке Kromasil 100-5C8). Для этого в плоскодонную колбу объемом 200 мл помещают 50 мл ацетонитрила и 150 мл воды, смесь тщательно перемешивают.
    
    Для приготовления подвижной фазы при анализе образцов зерна и соломы также используют свежеперегнанные ацетонитрил и воду, очищенную перегонкой над перманганатом калия.
    
    В плоскодонную колбу объемом 1 л помещают 500 мл ацетонитрила и 500 мл очищенной воды. Смесь тщательно перемешивают, затем пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 мл/мин в течение 5 мин, после чего помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин для удаления растворенных газов. Полученный раствор используют в качестве подвижной фазы.
    
    2.3.4. Построение калибровочного графика
    
    Для построения калибровочного графика последовательно вводят в хроматограф 5 раз по 20 мкл каждого из полученных четырех растворов с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2; 0,1 мкг/мл. Измеряют высоту или площадь пиков, рассчитывают среднее значение высоты пика или его площади для каждой концентрации и строят график зависимости высоты пика или площади от концентрации Азоксистробина и его геометрического изомера (мкг/мл).
    
    2.3.5. Подготовка колонки с Флорисилом для очистки экстракта
    
    В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 4 г дезактивированного Флорисила. Сверху на Флорисил насыпают 1 г безводного сульфата натрия. Колонку готовят непосредственно перед очисткой образца, предварительно промыв ее 20 мл гексана. Образец вносят на влажную колонку!
    
    Примечание. Для дезактивации Флорисил выдерживают 4 ч в сушильном шкафу при температуре 120 °С. Затем к 95 г прокаленного Флорисила при постоянном перемешивании в стеклянной колбе с притертой пробкой добавляют постепенно 5 г очищенной воды.
    
    
    2.3.6. Проверка хроматографического поведения Азоксистробина и его геометрического изомера на колонке с Флорисилом
    
    В концентратор объемом 100 мл помещают 1 мл стандартного раствора с концентрацией Азоксистробина и геометрического изомера R-230310 - 1 мкг/мл (каждого) и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 2 мл смеси этилацетат-гексан в соотношении 2:8 и вносят на колонку с Флорисилом. Колонку промывают 20 мл смеси этилацетат-гексан в соотношении 2:8 и элюат отбрасывают. Азоксистробин и R-230310 элюируют с колонки последовательно шестью порциями по 5 мл смеси этилацетата с гексаном в соотношении 7:3, каждую порцию собирают отдельно в концентраторы и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С.
    
    Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 мл смеси ацетонитрил-вода (25:75) в ультразвуковой ванне и 20 мкл раствора вводят в хроматограф.
    
    Затем фракции, содержащие Азоксистробин и R-230310, объединяют, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток вновь растворяют в 1 мл ацетонитрила или смеси ацетонитрил-вода в соотношении 25:75 и вводят в хроматограф 20 мкл пробы. Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюата.
    
    Примечание. Хроматографическое поведение Азоксистробина или его метаболита на колонке обязательно проверяют при отработке методики, и каждый раз при использовании новой партии Флорисила.
    
    
    2.3.7. Подготовка концентрирующего патрона Диапак-С8 (0,6 г) для очистки экстракта
    
    Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 2 мл/мин. Для проведения очистки используют очищенную воду, перегнанную над перманганатом калия.
    
    Патрон Диапак-С8 устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 мл (используют как емкость для элюентов).
    
    Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают последовательно 5 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:1 и 10 мл воды. Элюат отбрасывают. Нельзя допускать высыхания поверхности картриджа!
    
    2.3.7.1. Проверка хроматографического поведения Азоксистробина и его геометрического изомера на концентрирующем патроне Диапак С8.
    
    Из стандартного раствора, содержащего по 1 мкг/мл Азоксистробина и его геометрического изомера в ацетонитриле, отбирают 1 мл, помещают в круглодонную колбу объемом 100 мл и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетонитрила, помещают на 30 с в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 мл воды, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на картридж. Пропускают раствор через картридж под вакуумом. Элюат упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетонитрила и хроматографируют для проверки возможного смыва анализируемого вещества.
    
    Концентратор тщательно обмывают 10 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:5 и смесь также вносят на картридж. Элюат собирают в концентратор, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетонитрила и хроматографируют. Описанную выше процедуру необходимо проводить, чтобы убедиться в отсутствии "проскока" анализируемых веществ при нанесении пробы на картридж.
    
    Азоксистробин и его геометрический изомер элюируют с картриджа 15 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:1 порциями по 5 мл, обмывая каждый раз колбу. Элюат после внесения каждой порции упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетонитрила и хроматографируют. Определяют фракции, содержащие Азоксистробин и его геометрический изомер, и объединяют их. Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюата.
    
    2.3.8. Подготовка концентрирующего патрона Диапак-Амин (0,6 г) для очистки экстракта
    
    Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 2 мл/мин.
    
    Патрон Диапак-Амин устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 мл (используют как емкость для элюентов).
    
    Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 10 мл смеси гексан-этилацетат в соотношении 9:1. Элюат отбрасывают. Нельзя допускать высыхания поверхности картриджа!
    
    2.3.8.1. Проверка хроматографического поведения Азоксистробина и его геометрического изомера на концентрирующем патроне Диапак-Амин.
    
    Из стандартного раствора, содержащего по 1 мкг/мл Азоксистробина и его геометрического изомера в ацетонитриле, отбирают 1 мл, помещают в круглодонную колбу объемом 100 мл и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 мл этилацетата, помещают на 30 с в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 мл гексана, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на картридж. Пропускают раствор через картридж под вакуумом. Элюат упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетонитрила и хроматографируют для проверки возможного смыва анализируемого вещества.
    
    Азоксистробин и его геометрический изомер элюируют с картриджа 15 мл смеси гексан-этилацетат в соотношении 1:3 порциями по 5 мл, элюат после внесения каждой порции упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетонитрила, помещают на 30 с в ультразвуковую ванну, тщательно обмывают стенки концентратора и хроматографируют. Определяют фракции, содержащие Азоксистробин и его геометрический изомер, и объединяют их. Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюата.
    
    2.3.9. Подготовка концентрирующего патрона Диапак-С (0,6 г) для очистки экстракта
    
    Патрон Диапак С устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 мл (используют как емкость для элюентов).
    
    Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 10 мл смеси гексан-этилацетат в соотношении 9:1. Элюат отбрасывают. Нельзя допускать высыхания поверхности картриджа!
    
    Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 2 мл/мин.
    
    2.3.9.1. Проверка хроматографического поведения Азоксистробина и его геометрического изомера на концентрирующем патроне Диапак-С.
    
    Из стандартного раствора, содержащего по 1 мкг/мл Азоксистробина и его геометрического изомера в ацетонитриле, отбирают 1 мл, помещают в круглодонную колбу объемом 100 мл и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 мл этилацетата, помещают на 30 с в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 мл гексана, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на картридж. Пропускают раствор через картридж под вакуумом. Элюат упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетонитрила и хроматографируют для проверки возможного смыва анализируемого вещества.
    
    Азоксистробин и его геометрический изомер элюируют с картриджа 15 мл смеси гексан-этилацетат в соотношении 1:3 порциями по 5 мл, элюат после внесения каждой порции упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетонитрила, помещают на 30 с в ультразвуковую ванну, тщательно обмывают стенки концентратора и хроматографируют. Определяют фракции, содержащие Азоксистробин и его геометрический изомер, и объединяют их. Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюата.
    

2.4. Отбор проб

    
    Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Пробы плодов огурца и томатов, а также ягод винограда анализируют в день отбора или замораживают и хранят в морозильной камере при -18 °С до дня анализа. Для длительного хранения пробы почвы подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Отобранные пробы зерна и соломы подсушивают до стандартной влажности и хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре при комнатной температуре. Перед анализом зерно и солому измельчают на лабораторной мельнице.
    

2.5. Описание определения

2.5.1. Вода

    
    Пробу воды объемом 100 мл помещают в делительную воронку емкостью 250 мл, добавляют 5 г хлорида натрия, интенсивно перемешивают до полного растворения соли. Азоксистробин и R-230310 трижды экстрагируют хлористым метиленом порциями по 30 мл, встряхивая каждый раз воронку в течение 1-2 мин. После разделения фаз в воронке нижний слой сливают в концентратор, пропуская его через безводный сульфат натрия. Объединенный экстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 5 мл смеси ацетонитрил-вода (25:75) в ультразвуковой ванне, после чего 20 мкл раствора вводят в хроматограф.
    

2.5.2. Почва

    
    2.5.2.1. Экстракция. Образец почвы массой 20 г помещают в коническую колбу объемом 250 мл, добавляют 10 мл дистиллированной воды и дают выстояться 10 мин. Затем в колбу прибавляют 50 мл смеси ацетонитрила с водой в соотношении 9:1 и встряхивают колбу на механическом встряхивателе в течение 30 мин. Экстракт переносят в центрифужный стакан и центрифугируют при 2500 об./мин 5 мин. Супернатант фильтруют в делительную воронку объемом 250 мл через фильтр "красная лента". Азоксистробин и метаболит Азоксистробина R-230310 экстрагируют еще раз, используя 50 мл смеси ацетонитрил-вода (9:1), встряхивая в течение 0,5 ч. Экстракты объединяют.
    
    2.5.2.2. Предварительная очистка. К полученному экстракту в делительной воронке добавляют 5 г хлорида натрия, интенсивно встряхивают и оставляют на 10 мин. По истечению этого времени и после разделения слоев в делительной воронке, нижний водный слой с остатком нерастворившегося хлорида натрия отбрасывают. Верхний ацетонитрильный слой собирают в концентратор, пропуская его через 10 г безводного сульфата натрия, увлажненного 5 мл этилового эфира уксусной кислоты. Затем осушитель обмывают 10 мл ацетонитрила, полученный экстракт упаривают при температуре не выше 30 °С досуха.
    
    2.5.2.3. Очистка экстракта на колонке. Сухой остаток растворяют в 2 мл смеси этилацетат-гексан в соотношении 2:8 и вносят на колонку с Флорисилом. Затем ополаскивают концентратор 5 мл смеси этилацетат-гексан (2:8) и также вносят на колонку. После этого колонку промывают 15 мл смеси этилацетат-гексан (2:8) и элюат отбрасывают. Азоксистробин и R-230310 элюируют с колонки 20 мл смеси этилацетата с гексаном в соотношении 7:3. Элюат собирают в концентратор и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
    
    Сухой остаток растворяют в 2 мл смеси ацетонитрил-вода (25:75), помещают на 30 с в ультразвуковую ванну и 20 мкл раствора вводят в хроматограф.
    

2.5.3. Плоды огурцов и томатов

    
    Навеску 20 г измельченных плодов огурцов и томатов помещают в плоскодонную стеклянную колбу на 250 мл, добавляют 50 мл ацетонитрила и встряхивают смесь в течение 0,5 ч. Затем пробу центрифугируют и экстракт (супернатант) фильтруют в делительную воронку. Экстракцию повторяют еще 2 раза, используя по 50 мл ацетонитрила. Экстракты объединяют в делительной воронке. Далее поступают, как описано в п.п.2.5.2.2 и 2.5.2.3 "Очистка экстракта на колонке".
    

2.5.4. Ягоды винограда

    Навеску 20 г измельченных ягод винограда помещают в плоскодонную стеклянную колбу на 250 мл, добавляют 50 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 7:3 и встряхивают смесь в течение 0,5 ч. Экстракт фильтруют в делительную воронку 250 мл. Экстракцию повторяют еще дважды, используя по 50 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 7:3 и встряхивая смесь каждый раз по 30 мин. Экстракты объединяют. К объединенному экстракту в делительной воронке добавляют 5 г хлорида натрия, интенсивно встряхивают и оставляют до полного разделения слоев. Нижний водный слой отбрасывают. К оставшемуся в делительной воронке экстракту прибавляют 20 мл гексана, интенсивно встряхивают и оставляют смесь до полного разделения слоев. Затем нижний ацетонитрильный слой собирают в концентратор через слой безводного сульфата натрия, осушитель обмывают 10 мл ацетонитрила. Полученный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
    
    Сухой остаток растворяют в 5 мл этилацетата, прибавляют в концентратор 50 мл гексана и помещают смесь с сухую делительную воронку. Азоксистробин и изомер R-230310 извлекают ацетонитрилом, используя 20, 20 и 10 мл растворителя и встряхивая делительную воронку по 2 мин. Нижний ацетонитрильный слой объединяют в концентраторе и упаривают досуха при температуре не выше 30 °С. Затем сухой остаток растворяют в 2 мл смеси этилацетат-гексан в соотношении 2:8 и проводят очистку на колонке с Флорисилом, как указано в пункте 2.5.2.3 "Очистка экстракта на колонке". После очистки на колонке, упаривания и растворения сухого остатка, 20 мкл экстракта вводят в хроматограф.
    

2.5.5. Зерно колосовых культур

    
    2.5.5.1. Экстракция и предварительная очистка. Образец размолотого зерна массой 20 г помещают в коническую колбу объемом 250 мл и прибавляют 10-20 мл ацетонитрила и выдерживают 15 мин. После выдерживания прибавляют 75 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 9:1 и экстрагируют 5 мин на ультразвуковой ванне и дополнительно 10 мин на механическом встряхивателе. Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 50 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 9:1 и экстрагируя 5 мин на ультразвуковой ванне и дополнительно 10 мин на механическом встряхивателе. Экстракты центрифугируют при 4000 об./мин, фильтруют в плоскодонную колбу объемом 250 мл с 5 г поваренной соли через фильтр "красная лента". Объединенный экстракт тщательно перемешивают и оставляют на 10 мин при комнатной температуре. Затем переносят содержимое колбы в делительную воронку объемом 250 мл (не растворившуюся соль оставляют в колбе) и отбрасывают выделившийся водный слой (нижний).
    
    К объединенному экстракту в делительной воронке добавляют 50 мл гексана и интенсивно встряхивают 2 мин. После полного разделения фаз отбрасывают верхний гексановый слой. Нижний ацетонитрильный слой собирают в химический стакан объемом 200 мл и возвращают в делительную воронку. Ацетонитрильный экстракт промывают еще раз 50 мл гексана. Гексан (верхний слой) отбрасывают, а ацетонитрильную фракцию фильтруют в концентратор объемом 250 мл через слой безводного сульфата натрия. Осушитель дополнительно обмывают 10 мл ацетонитрила, который переносят в концентратор. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
    
    К сухому остатку в концентраторе добавляют 50 мл хлористого метилена последовательно порциями по 20, 20 и 10 мл, тщательно обмывают стенки концентратора и переносят экстракт в делительную воронку объемом 250 мл. Туда же добавляют 100 мл 5%-ного раствора гидрокарбоната натрия и интенсивно встряхивают делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз нижний органический слой (хлористый метилен) собирают в химический стакан объемом 100 мл. К верхнему водному слою с образовавшейся эмульсией добавляют 30 мл хлористого метилена, перемешивают и выдерживают 5 мин при комнатной температуре. Нижний выделившийся слой хлористого метилена объединяют с основным экстрактом в химическом стакане и помещают объединенный экстракт в чистую делительную воронку. Верхний водный слой отбрасывают.
    
    К объединенному экстракту в делительной воронке добавляют 50 мл 0,1 М раствора соляной кислоты и осторожно встряхивают делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз верхний водный слой отбрасывают. Нижний органический слой (хлористый метилен) фильтруют в концентратор объемом 250 мл через слой безводного сульфата натрия. В случае образования эмульсии к верхнему водному слою добавляют 30 мл хлористого метилена и встряхивают делительную воронку 1 мин, после полного разделения фаз нижний органический слой объединяют с экстрактом в концентраторе. Осушитель обмывают 10 мл хлористого метилена и объединяют с экстрактом. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
    
    2.5.5.2. Очистка экстракта на концентрирующем патроне Диапак С8. Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетонитрила, помещают на 30 с в ультразвуковую ванну, и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 мл воды, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на картридж. Элюат отбрасывают. Концентратор тщательно обмывают 10 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:5 и смесь также вносят на картридж. Элюат отбрасывают.
    
    В концентратор добавляют 10 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:1, тщательно обмывают стенки концентратора и вносят раствор на картридж. Элюат, содержащий Азоксистробин и его геометрический изомер, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
    
    2.5.5.3. Очистка экстракта на концентрирующем патроне Диапак-Амин. Сухой остаток растворяют в 1 мл этилацетата, помещают на 30 с в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 мл гексана, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на картридж. Элюат отбрасывают. Азоксистробин и его геометрический изомер элюируют с картриджа 10 мл смеси гексан-этилацетат в соотношении 1:3. Элюат упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила и аликвоту 20 мкл вводят в хроматограф.
    
    Примечание. Хроматографическое поведение Азоксистробина и его геометрического изомера на концентрирующих патронах обязательно проверяют при отработке методики и каждый раз при использовании новой партии патронов.
    
    

2.5.6. Солома зерновых колосовых культур

    
    2.5.6.1. Экстракция и предварительная очистка. Образец соломы массой 5 г помещают в коническую колбу объемом 250 мл, прибавляют 20 мл ацетонитрила и выдерживают в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем прибавляют 75 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 9:1 и экстрагируют 5 мин на ультразвуковой ванне и дополнительно 10 мин на механическом встряхивателе. Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 75 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 9:1 и экстрагируют 5 мин на ультразвуковой ванне и дополнительно 10 мин на механическом встряхивателе. Экстракт фильтруют в плоскодонную колбу объемом 250 мл с 5 г поваренной соли через фильтр "красная лента". Объединенный экстракт тщательно перемешивают и оставляют на 10 мин при комнатной температуре. Затем переносят содержимое колбы в делительную воронку объемом 250 мл (не растворившуюся соль оставляют в колбе) и отбрасывают выделившийся нижний водный слой.
    
    К объединенному экстракту в делительной воронке добавляют 50 мл гексана и интенсивно встряхивают 2 мин. После полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой собирают в химический стакан объемом 500 мл и возвращают в делительную воронку, гексан отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт промывают еще раз 50 мл гексана, гексан отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт фильтруют в концентратор через слой безводного сульфата натрия, осушитель обмывают 10 мл ацетонитрила и объединяют с экстрактом. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
    
    К сухому остатку в концентраторе добавляют 50 мл хлористого метилена порциями по 20, 20 и 10 мл, тщательно обмывают стенки концентратора и переносят экстракт в делительную воронку объемом 250 мл. Туда же добавляют 100 мл 5%-ного раствора гидрокарбоната натрия и интенсивно встряхивают делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз нижний органический слой (хлористый метилен) собирают в химический стакан объемом 100 мл. К верхнему водному слою с образовавшейся эмульсией добавляют 30 мл хлористого метилена, перемешивают и выдерживают 5 мин при комнатной температуре. Нижний выделившийся слой хлористого метилена объединяют с основным экстрактом в химическом стакане и помещают объединенный экстракт в чистую делительную воронку. Верхний водный слой отбрасывают.
    
    К объединенному экстракту в делительной воронке добавляют 50 мл 0,1 М раствора соляной кислоты и осторожно встряхивают делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз верхний водный слой отбрасывают. Нижний органический слой (хлористый метилен) фильтруют в концентратор объемом 250 мл через слой безводного сульфата натрия. В случае образования эмульсии к верхнему водному слою добавляют 30 мл хлористого метилена и встряхивают делительную воронку 1 мин, после полного разделения фаз нижний органический слой объединяют с экстрактом в концентраторе. Осушитель обмывают 10 мл хлористого метилена и объединяют с экстрактом. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С и далее очищают на концентрирующем патроне Диапак С.
    

    2.5.6.2. Очистка экстракта на концентрирующем патроне Диапак С. Сухой остаток растворяют в 1 мл этилацетата, помещают на 30 с в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 мл гексана, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на картридж. Элюат отбрасывают. Азоксистробин и его геометрический изомер элюируют с картриджа 10 мл смеси гексан-этилацетат в соотношении 1:3, элюат упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
    
    2.5.6.3. Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак С8 и Диапак-Амин. Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетонитрила, (помещают на 20 с в ультразвуковую ванну), тщательно обмывая стенки концентратора, добавляют 9 мл очищенной воды и очищают на концентрирующем патроне Диапак С8, как указано в п.2.5.5.2. После очистки элюат упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 1 мл этилацетата, тщательно обмывая стенки концентратора (помещают на 20 с в ультразвуковую ванну), добавляют 9 мл гексана и очищают на концентрирующем патроне Диапак-Амин, как указано в п.2.5.5.3.
    
    Элюат после очистки упаривают досуха, растворяют в 2,5 мл ацетонитрила и аликвоту 20 мкл вводят в хроматограф.
    
    Примечание. При хроматографическом исследовании образцов соломы в случае обнаружения в образцах балластного пика, близкого по времени удерживания к пикам анализируемых веществ, можно проводить анализ при длине волны 220 нм. В этих условиях величины поглощения Азоксистробина и его геометрического изомера увеличиваются по сравнению с поглощением на длине волны 255 нм, а поглощение балластных пиков уменьшается.
    

2.6. Условия хроматографирования и обработка результатов анализа

2.6.1. Условия хроматографирования

    
    Хроматограф "Waters" или другой с аналогичными характеристиками с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны.
    
    Колонка стальная Kromasil 100-5C8 25х2,1.
    
    Температура колонки 35 °С.
    
    Подвижная фаза ацетонитрил-вода (40:60) по объему.
    
    Подвижная фаза для растворения образцов ацетонитрил-вода (25:75) по объему.
    
    Скорость потока элюента: 1 мл/мин.
    
    Рабочая длина волны 255 нм.
    
    Чувствительность 0,0025 ед. оптической плотности на шкалу.
    
    Объем вводимой пробы 20 мкл.
    
    Время удерживания Азоксистробина - 8,65-9,17 мин; геометрического изомера R-230310 - 6,25-6,53 мин.
    
    Линейный диапазон детектирования 2-20 нг.
    
    Альтернативные условия
    
    Колонка хроматографическая стальная, длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм.
    
    Zorbax SB C-18, зернение 5 мкм.
    
    Температура колонки 25 °С.
    
    Подвижная фаза ацетонитрил-вода (50:50) по объему.
    
    Скорость потока элюента: 1 мл/мин.
    
    Рабочая длина волны 255 нм (220 нм).
    
    Чувствительность 0,0025 ед. оптической плотности на шкалу.
    
    Объем вводимой пробы 20 мкл.
    
    Время удерживания Азоксистробина - 11,82-12,55 мин; геометрического изомера R-230310 - 8,97-9,52 мин.
    
    Линейный диапазон детектирования 2-20 нг.
    

2.6.2. Обработка результатов анализа

    
    Содержание Азоксистробина или R-230310 в пробе рассчитывают по формуле:
    

, где

    
    - содержание Азоксистробина или R-230310 в пробе, мг/кг или мг/л;
    
     - высота (площадь) пика стандарта, мм;
    
     - высота (площадь) пика образца, мм;
    
     - концентрация стандартного раствора, мкг/мл;
    
    - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;
    
     - масса анализируемого образца, г (мл);
    
     - содержание Азоксистробина или R-230310 в аналитическом стандарте, %.
    

3. Требования техники безопасности

    
    Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.
    

4. Контроль погрешности измерений

    
    Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95 ГСИ "Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа".
    

5. Разработчики

    
    Калинин В.А., профессор, к.с-х.н., Довгилевич Е.В., к.б.н., Устименко Н.В., к.б.н., Довгилевич А.В., к.х.н.
    
    Московская сельскохозяйственная академия им. К.А.Тимирязева. 127550, Москва, Тимирязевская ул., д. 53/1, УНКЦ "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов". Телефон/факс: 976-43-26.
    
    
    
Текст документа сверен по:
официальное издание
Определение остаточных количеств пестицидов
в пищевых продуктах, сельскохозяйственном сырье
и объектах окружающей среды:
Сборник методических указаний.
Выпуск 2. Часть 1. -
М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора
Минздрава России, 2004