МУК 4.1.769-99

    
    
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Количественное определение формальдегида
в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

    
Дата введения 1999-09-06

    
    УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 6 июля 1999 г.
    
    
    Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТа 8.563-96 "Методики выполнения измерений", ГОСТа Р 1.5-92 "Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов". Методика анализа аттестована и обеспечивает определение формальдегида в диапазоне концентраций 0,001-2,0 мкг/см.
    

    Формальдегид (муравьиный альдегид, метаналь) - газ с резким запахом. 35-40%-ный водный раствор формальдегида называется формалином или формолем. Растворы выделяют газообразный формальдегид при комнатной температуре. Т - минус 19,3 °С, Т - минус 118,3 °С. Формальдегид растворим в воде и органических растворителях (бензол, толуол, ацетон, этанол, этилацетат и др.). Формальдегид - раздражающий газ, вызывает дегенеративные процессы в паренхиматозных органах, сенсибилизирует кожу, действует на ЦНС. Относится ко 2 классу опасности.
    
    Методика обеспечивает выполнение измерений с суммарной погрешностью результата измерений 20,0% при доверительной вероятности 0,95.
    
    

Сущность метода

    
    Методика основана на предварительном переводе формальдегида в 2,4-динитрофенилгидразон формальдегида, концентрировании продукта дериватизации из биологического материала экстракцией гексаном, упаривании гексанового экстракта, растворении упаренного остатка в ацетонитриле и анализе на жидкостном хроматографе.
    
    Измерение концентрации формальдегида выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием УФ-детектора.
    
    Нижний предел измерения в объеме пробы - 0,05 мкг.
    
    Определению не мешают метанол, этанол, уксусный альдегид, ацетон, муравьиная кислота и другие карбонильные соединения.
    
    Длительность анализа, включая подготовку пробы, - 40 мин.
    
    

Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы

    
    При выполнении анализа применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы.
    

Требования к безопасности

    
    Помещение для проведения измерений должно соответствовать требованиям "Пожарных норм проектирования зданий и сооружений" (СНиП ПА-5-700) и "Санитарных норм проектирования промышленных предприятий" (СН-245-71) и СНиП-74.
    
    При выполнении работ должны быть соблюдены меры противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТа 12.1.004-85 и правила техники безопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.007-76.
    
    При работе необходимо соблюдать "Правила по технике безопасности и производственной санитарии при работе в химических лабораториях", утверждены МЗ СССР 20.12.82 (М.,1981), и "Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением", утверждены Госгортехнадзором СССР 27.11.87 (М.: Недра, 1989).
    
    При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТу 12.1.005-88.
    
    При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.
    

Требования к квалификации оператора

    
    К выполнению хроматографических измерений биологических проб допускаются лица, прошедшие обучение работе на жидкостном хроматографе.
    
    

Условия измерений

    
    При подготовке проб к анализу и приготовлении растворов соблюдают следующие условия:
    
     температура воздуха (20±10) °С;
    
     атмосферное давление 630-800 мм рт.ст.;
    
     влажность воздуха - не более 80% при температуре 25 °С.
    
    Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией по прибору.
    

Подготовка к выполнению измерений

    
    Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды и растворителей, приготовление растворов, подготовка хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики.
    

Подготовка посуды

    
    Используемую посуду необходимо тщательно вымыть хромовой смесью, тщательно ополоснуть водопроводной и дистиллированной водой и просушить при температуре 120 °С.
    

Подготовка растворителей

    
    Очистка ацетонитрила от примесей. В колбу вместимостью 2 дм помещают 1 дм ацетонитрила и 20 г КМnО, кипятят с обратным холодильником в течение 1 ч, затем перегоняют с дефлегматором, отбирая фракции по 200 см. Когда в колбе останется около 200 см продукта, перегонку прекращают. Остаток можно смешивать с новой порцией растворителя. Первую фракцию отбрасывают, а остальные проверяют на поглощение в УФ-области.
    

Приготовление растворов

    
    Хромовая смесь. В термостойкий стакан вместимостью 2 дм насыпают 50 г хромовокислого калия, осторожно приливают по палочке частями, тщательно перемешивая, 1 дмконцентрированной серной кислоты.
    
    Элюент для хроматографии. 50 см очищенного ацетонитрила смешивают с 50 см дистиллированной воды. Подвижную фазу фильтруют через воронку Шотта (пор 16) и дегазируют барботированием гелия или азота в течение 5-10 мин со скоростью 50-60 об/мин.
    
    Соляная кислота, 2 моль/дм. 163,0 см концентрированной HCl (плотность 1,19 г/см) вносят в мерную колбу вместимостью 1 дм доводят объем до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.
    
    2,4-динитрофенилгидразин, 0,2%-ный раствор в 2М соляной кислоте. 0,2 г 2,4-динитрофенилгидразина вносят в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят до метки 2М раствором соляной кислоты.
    
    Исходный раствор формальдегида для калибровки (раствор А). 1 см ГСО формальдегида с концентрацией 1,0 мг/см переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят дистиллированной водой до метки. Срок хранения раствора - 36 ч.
    
    Рабочий раствор для градуировки УФ-детектора. В мерную колбу вместимостью 100 см вносят 10 см раствора А и доводят дистиллированной водой до метки (раствор Б). Срок хранения раствора - 36 ч.
    
    Идентификация хроматографического пика 2,4-динитрофенилгидразона формальдегида. Готовят раствор 2,4-динитрофенилгидразона формальдегида в ацетонитриле с концентрацией 0,01-0,02 мг/см, вводят в колонку хроматографа 1-2 мм раствора. Снимают хроматограмму в условиях хроматографического анализа и определяют время удерживания 2,4-динитрофенилгидразона формальдегида.
    

Подготовка хроматографической колонки

    
    Колонку устанавливают на хроматограф и подают элюирующую жидкость (ацетонитрил : вода = 1:1) со скоростью 1 см/мин до установления равновесия колонки, которое определяют по стабильности нулевой линии детектора.
    

Установление градуировочной характеристики

    
    Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика на хроматограмме от концентрации формальдегида в моче, устанавливают по пяти сериям растворов для градуировки. Каждую серию, состоящую из шести растворов, готовят из растворов А и Б.
    
    Растворы для установления градуировочной характеристики готовят в мерных колбах вместимостью 50 см. Для этого в каждую колбу вносят раствор А (или раствор Б) в соответствии с таблицей, доводят объем до метки мочой, не содержащей формальдегид, и тщательно перемешивают. Растворы готовят непосредственно перед определением.
    
    

Таблица

    
Растворы для установления градуировочной характеристики при определении концентрации
формальдегида в моче (фрагмент шкалы)

    
    
    50 см каждого рабочего раствора помещают в делительную воронку, добавляют 2,5 см 0,2%-ного раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2М соляной кислоте, 2 капли концентрированной соляной кислоты, 5 см гексана и экстрагируют 15 мин. После расслоения гексана и мочи верхний слой (гексановый) переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 1-2 мин со скоростью 2750 об/мин, затем 2 см гексана переносят в бюкс и выпаривают досуха под ИК-лампой. Высушенный остаток растворяют в 0,5 см ацетонитрила и вводят в хроматограф аликвотную часть (10 мм). Проводят по пять параллельных вводов обработанных экстрактов каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях:
    

    По средним для каждой точки значениям аналитического сигнала (площади пика) строят градуировочную характеристику , где - площадь пика, мм (или усл. ед); - концентрация градуировочного раствора, мкг/см. По установленной градуировочной характеристике и по значению аналитического сигнала пробы определяют концентрацию формальдегида в исследуемом образце.
    

Отбор проб

    
    Для отбора проб мочи используют чистую стеклянную посуду объемом 100 см с плотно закрывающейся крышкой. Срок хранения пробы мочи в холодильнике - не более суток.
    
    

Выполнение измерений

    
    50 см анализируемой пробы помещают в делительную воронку, добавляют 2,5 см 0,2%-ного раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2М соляной кислоте, 2 капли концентрированной соляной кислоты, 5 см гексана и экстрагируют 15 мин. После расслоения гексана и мочи верхний слой (гексановый) переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 1-2 мин со скоростью 2750 об/мин, затем 2 см гексана переносят в бюкс и выпаривают досуха под ИК-лампой. Высушенный остаток растворяют в 0,5 см ацетонитрила и вводят в хроматограф аликвотную часть (10 мм). Анализ проводят при вышеуказанных условиях работы хроматографа. По установленной градуировочной характеристике и по значению аналитического сигнала пробы определяют концентрацию формальдегида в исследуемом образце.
    
    

Вычисление результатов измерения

    
    Вычисляют значение площади хроматографического пика 2,4-динитрофенилгидразона формальдегида по формуле:
    

, мм,

    
где - высота пика, мм;
    
     - ширина пика на половине высоты, мм.
    
    По значению площади хроматографического пика 2,4-динитрофенилгидразона формальдегида из градуировочных характеристик находят массовую концентрацию формальдегида в моче, мкг/см.
    
    

Внутренний оперативный контроль

    
    Внутренний оперативный контроль качества результатов контрольного химического анализа (сходимость, воспроизводимость, точность) осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве анализов и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению (МИ 2335-95).
    

Оперативный контроль сходимости

    
    Периодичность контроля сходимости измерений зависит от количества рабочих измерений (2 параллельные пробы). Отбирают 2 пробы мочи и каждую из них анализируют в точном соответствии с прописью методики.
    
    Результаты признаются удовлетворительными, если выполняется условие:
    

,

    
где и - результаты анализа 1 и 2 проб;
    
     - допустимое расхождение между двумя результатами одной и той же пробы (=55%);
    
     - среднее значение между двумя определениями.
    

Оперативный контроль точности

    
    Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.
    
    Образцами для контроля являются представительные пробы биосред, к которым делаются добавки в виде раствора. Отбирают 2 пробы и к одной из них делают добавку в виде раствора таким образом, чтобы их содержание увеличилось по сравнению с исходным на 50-150%. Каждую пробу анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результат анализа исходной рабочей пробы и рабочей пробы с добавкой . Результаты анализа исходной рабочей пробы и рабочей пробы с добавкой получают не по возможности, а в одинаковых условиях, т.е. их получает один аналитик с использованием одного набора мерной посуды, одной партии реактивов и т.д.
    
    Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется условие:
    

,

где - добавка к пробе в виде раствора с концентрацией мкг/см;
    
     - норматив оперативного контроля погрешности, мкг/см.
    
    При внешнем контроле (=0,95) принимают
    

,

    
где и - характеристики погрешностей для исходной пробы и пробы с добавкой, мкг/см.
    

и .

    
    При внутрилабораторном контроле (=0,90) принимают, что
    

.

         
    При превышении оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и их устраняют.
    
    
    
Текст документа сверен по:
официальное издание
Определение химических соединений
в биологических средах: Сборник методических
указаний МУК 4.1.763-4.1.779-99. -
М.: Федеральный центр
госсанэпиднадзора Минздрава России, 2000