МУК 4.1.1245-03, 4.1.1477-03

  

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
    

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

    
Определение остаточных количеств тиабендазола в воде, почве, зерне
и соломе зерновых культур (колосовые, рис, кукуруза, просо), в горохе,
зеленой массе, семенах и масле подсолнечника методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии

    

Дата введения 2003-07-01

    
    
   1. УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко МУК 4.1.1245-03 16 марта 2003 г., МУК 4.1.1447-03 29 июня 2003 г.
  
  2. ВВЕДЕНЫ с 1 июля 2003 г.
         
   3. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.
    
    

1. Вводная часть

    
    Фирма производитель: Август, Кеминова, Агро Эксперт групп, Северо-Кавказский Агрохим.
    
    Торговое наименование: ВИАЛ, Винцит, Винер, Витацит.
    
    Действующее вещество: тиабендазол.
    
    Структурная формула:     
    

          
    2-(1,3-тиазол-4-ил) бензимидазол (IUPAC).
    
    2-(4-тиазолил)-1Н-бензимидазол (С.А.).
    
    Брутто формула: СНNS.
    
    Мол. масса: 201,3.
    
    Белое кристаллическое вещество. Температура плавления: 297-298 °С. Давление паров при 25 °С: 4,6х10 мПа. Коэффициент распределения н-октанол/вода: =2,39 (рН 7).
    
    Растворимость (г/л) при 20 °С: н-гептан - <0,01, ксилол - 0,13, ацетон - 2,43, 1,2-дихлорэтан - 0,81, метанол - 8,28, этилацетат - 1,49, н-октанол - 3,91, вода - 10,0 (рН 2), 0,16 (рН 4), 0,03 (рН 7-10).
    
    Устойчив к гидролизу. Водный фотолиз (20 °С, рН 5, DT 29 часов); pКa=4,73; рКа=12,00.
    
    Краткая токсикологическая характеристика: Острая пероральная токсичность (LD) для мышей - 3600 мг/кг, крыс - 3100 мг/кг, кроликов - 3800 мг/кг, птиц - более 2250 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD) для кроликов - более 2000 мг/кг, не ирритант; ингаляционная токсичность (LC) для крыс - более 0,5 мг/кг. Не токсичен для пчел. CК для рыб 0,55 мг/л при экспозиции 96 часов. Класс токсичности по ВОЗ - III.
    
    Гигиенические нормативы для тиабендазола в России:
    
    ОДК в почве - 1,0 мг/кг;
    
    ОДУ в воде водоемов - 0,05 мг/л (с.-т.);
    
    МДУ: для зерна хлебных злаков - 0,2 мг/кг (ВМДУ). Для зерна риса, кукурузы и проса, гороха, семян и масла подсолнечника гигиенические нормативы в России не установлены.
    
    Область применения препарата: системный фунгицид защитного и лечебного действия. Тиабендазол образует защитный слой на обработанной поверхности плодов и клубней, используется на овощных, плодовых и зерновых культурах. Не совместим с купратами и окисляющими агентами, такими как хлораты и нитраты.
    
    

2. Методика определения тиабендазола в воде, почве, зерне и соломе
зерновых культур (колосовые, рис, кукуруза, просо), в горохе, зеленой массе,
семенах и масле подсолнечника методом ВЭЖХ

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

    Методика основана на определении тиабендазола методом ВЭЖХ с использованием УФ детектора после его извлечения из образцов водно-ацетоновой смесью и очистке путем перераспределения между двумя жидкими фазами, а также на колонке с силикагелем.
    

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

    
    Метрологическая характеристика метода представлена в табл.1 и 2.
    

Таблица 1

    
Метрологическая характеристика метода

    
    
Таблица 2

    
Полнота определения тиабендазола в воде, почве, зерне и соломе риса, зерне кукурузы
и проса, горохе (N=5 для каждой концентрации)

    
    
2.1.3. Избирательность метода

    
    Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.
    

2.2. Реактивы и материалы

2.4. Подготовка к определению

    
2.4.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

    
    Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан и хлористый метилен встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.
    
    Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташем (на 1 л ацетона 10 г KMnО и 2 г KСО).
    
    Ацетонитрил (хч) сушат над пентоксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием.
    

2.4.2. Кондиционирование колонки

    
    Перед началом анализа колонку Symmetry-C18 или Nucleosyl С-18 кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 мл/мин) до стабилизации нулевой линии в течение 1-2 часов.
    

2.4.3. Приготовление растворов

    
    Для получения 0,05М раствора калия фосфорно-кислого 1-замещенного 6,8 г кристаллического KНРО помещают в мерную колбу объемом 1 л, растворяют в 600 мл дистиллированной воды и доводят объем до метки дистиллированной водой. Для получения 0,02М раствора ортофосфорной кислоты 2 г 98% (или 2,24 г 87%) кристаллической НРО помещают в мерную колбу объемом 1 л, растворяют в 600 мл дистиллированной воды и доводят до метки дистиллированной водой. Для получения 50%-го водного ацетона в колбе емкостью 1 л смешивают 500 мл ацетона с 500 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры. Для получения 4М раствора NaOH 160 г гидроксида натрия помещают в мерную колбу объемом 1 л, растворяют в 600 мл дистиллированной воды и доводят объем до метки дистиллированной водой. Для приготовления подвижной фазы N 1 в колбе на 1000 мл смешивают 400 мл ацетонитрила с 600 мл 0,02М ортофосфорной кислоты, смесь фильтруют, при необходимости дегазируют. Для приготовления подвижной фазы N 2 смешивают в колбе на 1000 мл 150 мл ацетонитрила с 850 мл 0,05М раствора KНРО, рН которого доведен добавлением ортофосфорной кислоты до значения 2,2 (контроль осуществляют рН-метром), смесь фильтруют, при необходимости дегазируют. Для приготовления элюента N 1 в колбе на 1000 мл смешивают 700 мл н-гексана и 300 мл ацетона. Для приготовления элюента N 2 в колбе на 1000 мл смешивают 400 мл н-гексана и 600 мл ацетона.
    

2.4.4. Приготовление стандартного и градуировочных растворов

    
    Берут точную навеску тиабендазола (50 мг), переносят в мерную колбу на 50 мл, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки (стандартный раствор с концентрацией 1,0 мг/мл). Градуировочные растворы с концентрациями 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 и 2,0 мкг/мл готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы [смесь ацетонитрил-0,05М KНРО (рН 2,2) (15:85, по объему)]. Стандартный и градуировочные растворы можно хранить в холодильнике при температуре 0-4 °С в течение 1 месяца. Для внесения в контрольный образец при определении полноты извлечения используют стандартный раствор, разбавленный ацетонитрилом до нужного уровня концентраций методом последовательного разбавления.
    

2.4.5. Построение градуировочного графика

    
    Для построения градуировочцого графика (площадь пика - концентрация тиабендазола в растворе) в хроматограф вводят по 50 мкл градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации тиабендазола в градуировочном растворе (мкг/мл).
    

2.4.6. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

    
    В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г силикагеля в 20 мл смеси гексан-ацетон (70:30, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку последовательно промывают 50 мл смеси гексан-ацетон (40:60, по объему) и 30 мл смеси гексан-ацетон (70:30, по объему) со скоростью 1-2 капли в секунду, после чего она готова к работе.
    

2.4.7. Проверка хроматографического поведения тиабендазола на колонке с силикагелем

    
    В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора тиабендазола с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 5 мл элюента N 1 и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 мл элюента N 1 и также наносят на колонку. Промывают колонку 25 мл элюента N 1, затем 70 мл элюента N 2 со скоростью 1-2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п.2.4.3) и анализируют на содержание тиабендазола по п.2.5.6.
    
    Фракции, содержащие тиабендазол, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п.2.5.6. Рассчитывают содержание тиабендазола в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для очистки экстракта объем элюента.
    
    Примечание: профиль вымывания тиабендазола может меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.
    
    

2.4.8. Подготовка приборов и средств измерения

    
    Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями стандартов и технической документации.
    

2.5. Проведение определения

    
2.5.1. Определение тиабендазола в воде

    
    Образец предварительно отфильтрованной воды объемом 100 мл подкисляют 1 мл концентрированной НСl, промывают 2 раза по 25 мл гексаном и 2 раза по 25 мл хлористым метиленом. рН раствора доводят 4М NaOH до 10-11 (контроль осуществляют рН-метром) и экстрагируют хлористым метиленом трижды по 30 мл. Объединенный экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия (3 г), осушитель промывают 10-15 мл хлористого метилена. Полученный раствор выпаривают на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 1 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 50 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.
    

2.5.2. Экстракция тиабендазола из проб почвы, зерна и соломы зерновых культур
(зерновых колосовых, риса, кукурузы и проса), гороха, зеленой массы и семян подсолнечника

    
    Навеску массой 10 г воздушно-сухой почвы или измельченных проб растительного происхождения помещают в коническую колбу емкостью 100 мл и экстрагируют тиабендазол 50 мл 50%-ного водного ацетона на ультразвуковой установке в течение 15 мин. Суспензию фильтруют через бумажный фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют дважды порциями по 25 мл. Объединенный экстракт концентрируют на роторном испарителе при температуре 40 °С до объема 50-55 мл. Водный раствор доводят дистиллированной водой до объема 100 мл и подкисляют при перемешивании 1 мл концентрированной соляной кислоты. Далее очистку экстракта проводят по п.2.5.4.
    
    Примечание. При необходимости повышения чувствительности определения массу навески можно увеличить до 25 г.
    
    

2.5.3. Экстракция тиабендазола из масла подсолнечника

    
    Навеску масла массой 10 г растворяют в 25 мл гексана, раствор помещают в делительную воронку объемом 100 мл и экстрагируют тиабендазол 30 мл 0,1М раствора соляной кислоты. Смесь встряхивают в течение 2 мин, нижний водный слой собирают. Операцию экстракции осуществляют еще дважды. Экстракты объединяют. Далее очистку проводят по п.2.5.4.
    

2.5.4. Очистка экстракта

    
    Водный раствор помещают в делительную воронку объемом 500 мл и при энергичном встряхивании в течение 2-3 мин промывают дважды по 25 мл гексаном (верхний органический слой отбрасывают) и дважды по 25 мл хлористым метиленом (нижний органический слой отбрасывают)*. рН раствора доводят 4М NaOH до 10-11 (контроль осуществляют рН-метром). Тиабендазол переэкстрагируют трижды хлористым метиленом, порциями по 30 мл, встряхивая делительную воронку в течение 2-3 мин. Верхний водный слой отбрасывают. Объединенный экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10-15 мл хлористого метилена. Полученный раствор выпаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.5.5**.
_________________
    * В случае образования сравнительно стойких эмульсий при очистке экстрактов для сокращения времени расслоения можно добавить в делительную воронку небольшое количество (до 10 мл) этилового спирта.

    ** В случаях, когда очистка экстрактов контрольных проб дает удовлетворительные результаты, дополнительную очистку на колонке с силикагелем можно исключить.
    

2.5.5. Очистка на колонке с силикагелем

    
    Остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п.2.5.4 экстрактов растительных материалов, количественно переносят двумя порциями по 5 мл смеси гексан-ацетон (70:30, по объему) в кондиционированную хроматографическую колонку (п.2.4.6). Промывают колонку 25 мл элюента N 1, которые отбрасывают. Тиабендазол элюируют 70 мл элюента N 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор выпаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2-8 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 50 (или 20) мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.
    

2.5.6. Условия хроматографирования

    
    1. Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки.
    
    Колонка Symmetry - С18 (250х4,6) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA).
    
    Температура колонки 30±1 °С.
    
    Предколонка Waters Symmetry C-18 для защиты аналитической колонки.
    
    Подвижная фаза для ВЭЖХ: ацетонитрил-0,02М раствор НРО (9:91, по объему).
    
    Скорость потока элюента: 1 мл/мин.
    
    Рабочая длина волны: 300 нм.
    
    Объем вводимой пробы: 20 мкл.
    
    Время удерживания тиабендазола: 9,00±0,25 мин.
    
    Линейный диапазон детектирования: 0,1-2,00 мкг/мл.
    
    2. Жидкостный хроматограф "Gold System" фирмы "Beckman", снабженный двойным насосом и УФ-детектором.
    
    Колонка Nucleosyl - С18 (250х4,6) мм, зернение 5 мкм (Sygma-Aldrich, USA).
    
    Предколонка Nucleosyl C-18 для защиты аналитической колонки.
    
    Подвижная фаза для ВЭЖХ: ацетонитрил-0,05М KНРО (рН 2,2) (15:85, по объему).
    
    Скорость потока элюента: 1 мл/мин.
    
    Рабочая длина волны: 300 нм.
    
    Объем вводимой пробы: 50 мкл.
    
    Время удерживания тиабендазола: 9,25±0,25 мин.
    
    Линейный диапазон детектирования: 0,1-2,00 мкг/мл.
    

2.5.7. Обработка результатов анализа

    
    Количественное определение проводят методом абсолютной градуировки, содержание тиабендазола в образце воды, почвы или проб растительного происхождения (, мг/кг) вычисляют по формуле:
    

где

    
     - площадь пика тиабендазола в стандартном растворе, мм;

     - площадь пика тиабендазола в анализируемой пробе, мм;
    
     - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, мл;
    
     - навеска анализируемого образца, г;
    
     - концентрация стандартного раствора тиабендазола, мкг/мл.
    
    Содержание остаточных количеств тиабендазола в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2 параллельных определений.
    
    Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор тиабендазола 2 мкг/мл разбавляют.
    
    

3. Требования техники безопасности

    
    При проведении работы необходимо соблюдать требования инструкции "Основные правила безопасной работы в химической лаборатории", общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, а также инструкции по эксплуатации жидкостного хроматографа и электрооборудования до 400 В.
    
    

4. Контроль погрешности измерений

    
    Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа.
    
    

5. Разработчики