МУК 4.1.1962-05

    

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение фумонизинов B и В в кукурузе (зерно, крупа, мука) методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии

    
    
Дата введения 2005-07-01

    
    
    1. РАЗРАБОТАНЫ: ГУ НИИ питания РАМН (академик РАМН, профессор В.А.Тутельян, д.х.н. К.И.Эллер, к.х.н. М.Г.Киселева, к.б.н. Л.П.Захарова, И.Б.Седова).
    
    2. УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Г.Г.Онищенко 21 апреля 2005 г.
    
    3. ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ с 1 июля 2005 г.
    
    4. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.
    
    

1. Назначение и область применения

    
    Настоящий документ устанавливает методику обнаружения, идентификации и количественного определения фумонизинов B и В в продовольственном сырье и пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Данная методика испытана и рекомендуется для количественного определения фумонизинов B и В (ФB и ФВ) в зерне кукурузы и продуктах переработки кукурузы.
    
    Методические указания предназначены для проведения лабораторных исследований безопасности пищевой продукции центрами гигиены и эпидемиологии, а также для предприятий и организаций, осуществляющих контроль качества и безопасности пищевых продуктов и аккредитованных в установленном порядке.
    
    Предел обнаружения метода: 0,01 мг/кг (для ФВ); 0,04 мг/кг (для ФВ).
    
    Общая погрешность измерений не превышает 31%.
    
    

2. Общие положения

    
    Фумонизины принадлежат к большой группе микотоксинов, продуцируемых микроскопическими грибами рода Fusarium. Наиболее часто в природных условиях встречается фумонизин В, значительно, реже и в меньших количествах - фумонизины В и В (ФВ, ФВ и ФВ). Подтверждено, что основными продуцентами этих токсинов являются F. moniliforme Sheldon (син. F. verticillioides (Sacc. Nirenberg). Имеются данные о высокой частоте обнаружения фумонизинов в зерне кукурузы и продуктах ее переработки в США, Австралии, в ряде стран Европы.
    
    Фумонизины представляют собой диэфиры пропан-1,2,3-трикарбоновой кислоты и 2-амино-12,16-диметилполигидроксиэйкозана, хорошо растворимы в воде и полярных растворителях. Фумонизины не обладают естественной флуоресценцией и не имеют специфических хромофоров, что обусловливает необходимость стадии дериватизации для проведения высокочувствительного определения.
    
    Фумонизины в экспериментах in vivo поражают печень, почки, поджелудочную железу и центральную нервную систему у разных видов животных, а также обладают канцерогенным действием. Международное Агентство по изучению рака классифицирует фумонизины, как соединения потенциально канцерогенные для человека (Группа 2В). Комитет экспертов ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам и контаминантам предложил установить величину допустимого суточного потребления (ДСП) ФВ+ФВ+ФВ с пищей на уровне 2 мкг/кг массы тела.
    
    

3. Принцип метода

    
    Метод включает следующие этапы.
    
    Экстракция ФВ и ФВ из проб зерна кукурузы, муки, крупы осуществляют смесью ацетонитрил-вода (50:50% об.). В пробах детского питания и многокомпонентных пищевых продуктах - смесью ацетонитрил-метанол-вода (25:25:50% об.):
    
     очистка и концентрирование пробы на патронах, заполненных силикагелем, химически связанным с октадецилселаном (ОДС-патроны). В пробах детского питания и многокомпонентных пищевых продуктах очистка проводится на иммунно-афинных колонках (ИА-колонки);
    
     дериватизация фумонизинов о-фталевым реагентом;
    
     определение ФВ и ФВ с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с флуориметрическим детектором при длине волны возбуждения () 335 нм и длине волны эмиссии () 440 нм.
    
    Предел обнаружения метода: 0,01 мг/кг (для ФВ); 0,04 мг/кг (для ФВ).
    
    Относительное стандартное отклонение измерения времени удерживания составляет - 0,02 (для ФВ) и 0,03 (для ФВ), высот хроматографических пиков - 0,05 (для ФВ) и 0,08 (для ФВ), площадей хроматографических пиков - 0,06 (для ФВ) и 0,08 (для ФВ).
    
    Степень извлечения добавленных в продукт фумонизинов составляет 89,8% для ФВ и 89,5% для ФВ.
    
    

4. Характеристика погрешностей измерения

    
    Данные методические указания обеспечивают выполнение измерений с погрешностью, не превышающей величин, приведенных в табл.1.
    
    

Таблица 1

    
Приписанные характеристики погрешностей результатов определения концентрации
ФВи ФВв продукте методом ВЭЖХ при доверительной вероятности Р=0,95

    
    
5. Средства измерений, вспомогательные устройства, посуда,
реактивы и материалы

5.1. Средства измерений

    
    Система ВЭЖХ, состоящая из насоса высокого давления, инжектора типа Rheodyne-7125 (США) с объемом петли-дозатора 20 мкл, спектрофлуориметрического детектора, обеспечивающего возбуждение флуоресценции в спектральной области 330-340 нм и регистрацию эмиссии флуоресценции при длине волны 440 нм и системы для сбора и обработки данных типа Мультихром (Амперсенд, Россия) или аналогичной, хроматографической колонки (250х4,6 мм), заполненной сорбентом Kromasil С18 (MetaChem Texnologies, США), размер частиц 5 мкм, или подобным сорбентом.
    

5.2. Вспомогательное оборудование

5.3. Реактивы и материалы

    

6. Подготовка к выполнению измерений

6.1. Приготовление стандартных и рабочих растворов ФВ и ФВ

    
   Для приготовления стандартных растворов микотоксинов рекомендуется использовать растворители, очищенные перегонкой.
    
    Для получения раствора хранения фумонизинов с концентрацией 50 мг/л в мерную колбу вместимостью 100 мл помещают навеску фумонизина (5 мг), взятую с точностью до 0,01 мг, приливают небольшое количество смеси ацетонитрил-вода (1:1) и тщательно перемешивают до полного растворения вещества, доводят смесь до метки.
    
    Для получения исходных рабочих растворов фумонизинов с концентрацией стандарта 10 мг/л следует в 5 раз разбавить раствор хранения фумонизинов.
    
    Из исходных рабочих растворов ФВ и ФВ с концентрациями 10 мг/л сначала готовится их смесь в соотношении (1:1), а затем путем последовательного разбавления этой смеси готовят рабочий стандартный раствор, для чего необходимую аликвоту смеси микотоксинов доводят до соответствующего объема смесью ацетонитрил-вода (1:1) согласно табл.2.
    
    

Таблица 2

    
Приготовление рабочих растворов ФВи ФВ

    
    
    Например: для приготовления смеси стандартных растворов ФВ и ФВ с концентрациями по 5 мг/л в вайл вносят по 1 мл исходных рабочих растворов ФВ и ФВ с концентрациями 10 мг/л.
    
    Для приготовления смеси рабочих стандартных растворов ФВ и ФВ с концентрацией:
    
     2,0 мг/л - в вайл вносят 800 мкл смеси ФВ и ФВ с концентрацией 5 мг/л и добавляют 1200 мкл смеси ацетонитрил-вода (1:1);
    
     1,0 мг/л - в вайл вносят 400 мкл смеси ФB и ФВ с концентрацией 5 мг/л и добавляют 1600 мкл смеси ацетонитрил-вода (1:1) или 1000 мкл смеси рабочих стандартных растворов ФВ и ФВ с концентрацией 2 мг/л добавляют 1000 мкл смеси ацетонитрил-вода (1:1);
    
     0,4 мг/л - в вайл вносят 800 мкл смеси  ФВ и ФВ с концентрацией 1 мг/л и добавляют 1200 мкл смеси ацетонитрил-вода (1:1);
    
     0,2 мг/л - в вайл вносят 1000 мкл смеси ФВ и ФВ с концентрацией 0,4 мг/л и добавляют 1000 мкл смеси ацетонитрил-вода (1:1). При необходимости по аналогии с вышеизложенным делается нужное разбавление.     
    

6.2. Хранение стандартных растворов фумонизинов

    
    Растворы хранения фумонизинов следует держать в стеклянной посуде с притертыми пробками в темном прохладном месте (при температуре около 0 °С) до одного года и использовать для приготовления рабочих стандартных растворов. Смеси рабочих стандартных растворов хранят в вайлах из темного стекла в темном прохладном месте (при температуре около 0 °С) в течение 1 недели.
    
    Перед использованием рабочих стандартных растворов их следует довести до комнатной температуры и только после этого следует открывать пробки.
         

6.3. Приготовление буферных растворов

    
6.3.1. Приготовление 0,1 М фосфатного буферного раствора, рН=3,0

    
    Навеску натрия фосфорно-кислого однозамещенного, 2-водного массой 7,8 г переносят в мерную колбу вместимостью 500 мл, добавляют 20-50 мл дистиллированной воды. Доводят объем раствора в колбе до метки и перемешивают. Срок хранения - 1 месяц в холодильнике.
    

6.3.2. Приготовление 0,08 М фосфатного буферного раствора, рН=4,5

    
    Навеску натрия фосфорно-кислого однозамещенного, 2-водного массой 6,24 г переносят в мерную колбу вместимостью 500 мл, добавляют 20-50 мл дистиллированной воды. Доводят объем раствора в колбе до метки и перемешивают. Срок хранения - 1 месяц в холодильнике.
    

6.3.3. Приготовление 0,025 М фосфатного буферного раствора, рН=7,0

    
    Навеску натрия фосфорно-кислого двузамещенного 12-водного массой 0,895 г переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляют 10-20 мл дистиллированной воды. Доводят объем раствора в колбе до метки и перемешивают. Срок хранения - 1 месяц в холодильнике.
    

6.3.4. Приготовление фосфатного буферного раствора, рН=7,4

    
    Навеску натрия фосфорно-кислого двузамещенного 12-водного массой 1,15 г, навеску натрия однозамещенного 2-водного массой 0,124 г и навеску натрия хлорида массой 1,74 г переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляют 10-20 мл дистиллированной воды. Доводят объем раствора в колбе до метки и перемешивают. Срок хранения - 1 месяц в холодильнике.
    
    

7. Отбор и подготовка проб для анализа

7.1. Отбор проб

    Для учета специфики отбора проб отдельных видов продуктов следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией:
    
     "Зерно. Правила приемки и методы отбора проб", ГОСТ 13586.3-83;
    
     "Крупа. Правила приемки и методы отбора проб", ГОСТ 27312-84;
    
     "Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб", ГОСТ 27668-88;
    
     "Продукты пищевые консервированные. Отбор проб и подготовка их к испытанию", ГОСТ 8756.0-70.
    
    Для получения среднего образца зерна, представительного по концентрации микотоксинов для всей партии, следует измельчить до гомогенизированного состояния двухкилограммовый исходный образец и выделить из этого размола средний образец зерна.
    
    Для однородных продуктов (мука, крупа, детское питание, хлопья и др.) пробы следует отбирать в количестве единиц упаковки, соответствующих величине среднего образца (100-200 г), при условии, что продукт происходит из одной партии.
         

7.2. Подготовка проб для анализа

    Отобранные пробы измельчают в течение 1-2 мин в лабораторной мельнице. При этом используют две параллельные пробы и одну - холостую.
    

7.2.1. Экстракция

    
    7.2.1.1. Для однокомпонентных пищевых продуктов: навеску 10 г измельченной пробы помещают в плоскодонную коническую колбу на 100 мл, добавляют 50 мл смеси ацетонитрил-вода (50:50% об.). Экстрагируют на аппарате для встряхивания проб в течение 90 мин. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр "синяя лента". Отбирают 5 мл фильтрата и добавляют 5 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора, рН=3,0. Полученный раствор центрифугируют в течение 15 мин при 2,5 тыс. об./мин.
    
    7.2.1.2. Для проб детского питания и многокомпонентных пищевых продуктов экстракцию ФВ и ФВ из 10 г измельченной пробы проводят встряхиванием в 50 мл смеси ацетонитрил-метанол-вода (25:25:50% об.) в течение 120 мин. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр "синяя лента". К 2 мл супернатанта добавляют 8 мл фосфатного буферного раствора, рН=7,4 и центрифугируют в течение 15 мин при 2,5 тыс. об./мин.
    

7.2.2. Очистка экстракта

    
    7.2.2.1. Для однокомпонентных пищевых продуктов: перед использованием ОДС-патроны предварительно кондиционируют, пропуская последовательно по 2 мл ацетонитрила и 0,1 М фосфатного буферного раствора, рН=3,0. Затем на патрон наносят 8,0 мл анализируемого экстракта и промывают 1,0 мл 0,1 М фосфатным буферным раствором, рН=3. Фумонизины элюируют с патрона 2,0 мл смеси ацетонитрил-0,025 М фосфатного буферного раствора, рН=7,0 (70:30% об.).
    
    7.2.2.2. Для очистки проб детского питания и многокомпонентных пищевых продуктов на ИА-колонку наносят со скоростью 1-2 капли в секунду 8 мл полученного раствора, промывают 10 мл фосфатного буферного раствора, рН=7,4. Фумонизины элюируют с колонки 1,5 мл метанола и 1,5 мл дистиллированной воды.
    
  

8. Выполнение измерений

8.1. Дериватизация фумонизинов о-фталевым альдегидом

    
    Для приготовления ОФА-реагента 40 мг о-фталевого альдегида растворяют в 1 мл метанола, добавляют 5 мл 0,05 М водного раствора тетрабората натрия и 50 мкл 2-меркаптоэтанола. Полученный раствор хранят в темноте в течение 1 недели при =6 °С.
    
    Дериватизацию фумонизинов о-фталевым альдегидом проводили в течение 1 мин после смешивания 40 мкл пробы и 40 мкл ОФА-реагента.
    

8.2. Определение фумонизинов B и В методом ВЭЖХ

    
    Условия ВЭЖХ: подвижная фаза ацетонитрил-метанол-0,08 М фосфатный буферный раствор (50:10:40% об.), рН 4,5, скорость подвижной фазы 1,3 мл/мин. Рекомендуется использовать перегнанный метанол, ацетонитрил и бидистиллированную воду. Все растворители необходимо предварительно отфильтровать.
    
    Флуориметрический детектор устанавливают на длину волны возбуждающего излучения 335 нм, на линии эмиссии устанавливают эмиссионный фильтр с полосой пропускания 440 нм.
    
    

9. Обработка результатов измерения

    
    9.1. Для построения калибровочного графика проводят хроматографический анализ серии рабочих растворов стандартов. В инжектор с помощью микрошприца вводят 20 мкл перемешанной в течение 1 мин смеси, состоящей из 40 мкл ОФА-реагента и 40 мкл рабочего раствора стандарта с концентрацией 5 мг/л, что соответствует 100 нг ФВ и 100 нг ФВ. Подобное делается для других стандартных растворов с концентрациями по 2,0, 1,0, 0,4, 0,2 мг/л, что в свою очередь соответствует 40, 20, 8 и 4 нг ФВ и ФВ во вколе. На основании полученных данных строят калибровочную кривую (зависимость площади хроматографического пика от концентрации фумонизина во вколе). В интервале линейности градуировочный график описывается уравнением прямой:
    

,

где - площадь хроматографического пика;
          
     - концентрация фумонизина в очищенном экстракте, мг/кг;
    
    , - коэффициенты градуировочного графика.
    
    Для анализа проб в инжектор хроматографа вводят с помощью микрошприца 20 мкл смеси, перемешанной в течение 1 мин и состоящей из 40 мкл ОФА-реагента и 40 мкл очищенного экстракта. При наличии пика, совпадающего по времени удерживания с ФВ или ФВ, рассчитывают их концентрацию в очищенном экстракте с помощью уравнения градуировочного графика.
    
    Для того чтобы рассчитать содержание фумонизинов в исходном образце необходимо концентрацию ФВ и ФВ в пробе умножить на коэффициент разбавления.
    
    9.2. Коэффициент разбавления в случае использования С-18 колонок:
    

,*

где - коэффициент разбавления;
            
     - объем смеси ацетонитрил-вода, взятой для экстракции, мл (50 мл);
           
     - навеска образца, взятого для анализа, г (10 г);
           
     - объем водно-ацетонитрильного экстракта, взятого для анализа, мл (5 мл);
          
     - объем смеси водно-ацетонитрильного экстракта и фосфатного буфера, взятых для центрифугирования, мл (10 мл);
          
     - объем смеси после центрифугирования, взятой для твердофазной очистки, мл (8 мл);
         
    * - объем собранного элюата после стадии твердофазной очистки, мл (2 мл).
________________
    * Формула и экспликация к ней соответствуют оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.
    
    Расчет концентрации ФВ и ФВ в пробе проводится по формуле:
    

    
,

где - концентрация ФВ и ФВ, мг/кг;
                
    2,5 - коэффициент разбавления;
         
     - концентрация ФВ в очищенном экстракте, мг/кг;
         
     - концентрация ФВ в очищенном экстракте, мг/кг.
    
    При высоких уровнях загрязнения фумонизинами кукурузы или продуктов ее переработки, экстракт перед реакцией дериватизации необходимо разбавить, в этом случае при расчете содержания фумонизинов в исходном образце, необходимо дополнительно учесть это разбавление ().     

    
,

где - коэффициент дополнительного разбавления экстракта.

    В указанных условиях время удерживания находится для ФВ в диапазоне от 7,0 до 8,5, для ФВ - 24-27 мин. Примерный вид хроматограммы, полученной с помощью модельной смеси, где (ФВ)=(ФВ) =0,5 мг/кг, представлен на рис.1.
    

Рис.1. Вид хроматограммы на примере модельной смеси

_______________
    * Качество рисунка соответствует оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.

    9.2. Коэффициент разбавления в случае использования ИА-колонок:
    

*

    
     - коэффициент разбавления;
          
     - объем смеси ацетонитрил-метанол-вода, взятой для экстракции, мл (50 мл);
         
     - навеска образца, взятого для анализа, г (10 г);
         
     - объем ацетонитрил-метанол-водного экстракта, взятого для анализа, мл (2 мл);
         
     - объем смеси ацетонитрил-метанол-водного экстракта и фосфатного буферного раствора, взятых для центрифугирования, мл (10 мл);
         
     - объем смеси после центрифугирования, взятой для твердофазной очистки, мл (8 мл);
         
    * - объем собранного элюата после стадии твердофазной очистки, мл (3 мл).
____________________
    * Формула и экспликация к ней соответствуют оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.
    
    Расчет концентрации ФВ и ФВ в пробе проводится по формуле:     

    
,

где - концентрация ФВ и ФВ, мг/кг;
           
    9,375 - коэффициент разбавления;
         
     - концентрация ФВ в очищенном экстракте, мг/кг;
         
     - концентрация ФВ в очищенном экстракте, мг/кг.
    
    При высоких уровнях загрязнения фумонизинами кукурузы или продуктов ее переработки экстракт перед реакцией дериватизации необходимо разбавить, в этом случае при расчете содержания фумонизинов в исходном образце необходимо дополнительно учесть это разбавление ().     

    
,

где - коэффициент дополнительного разбавления экстракта.
    
    

10. Вычисление результатов анализа

    
    За окончательный результат испытаний принимается среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений.
    

    
    Определяют допустимое расхождение между параллельными определениями , используя , % из табл.3.
    

, мг/кг

, мг/кг

    
    
Таблица 3

    
Значение нормативов оперативного контроля сходимости при доверительной вероятности Р=0,95

    
    
    Если расхождение между параллельными определениями не превышает допустимого:
    

,

,

то среднее арифметическое принимают за результат анализа.
    
    При превышении норматива следует повторить измерения, используя резервные пробы. В случае повторного превышения указанного норматива, выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам анализа, устраняют их и повторяют анализ пробы.
    
    

11. Оперативный контроль результатов измерения

11.1. Алгоритм проведения оперативного контроля воспроизводимости

    
    Периодичность контроля воспроизводимости измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.
    
    Пробами для контроля являются рабочие пробы продуктов, продовольственного сырья. Отбирают 2 пробы, которые анализируют в точном соответствии с прописью методики, максимально варьируя условия проведения анализа, а именно: используя разные наборы мерной посуды, разные партии реактивов и участие двух разных аналитиков. Целесообразно также проведение анализа этих аналитических проб в разных лабораториях.
    
    

11.2. Алгоритм проведения оперативного контроля погрешности

    
    Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.
    
    Образцами контроля являются рабочие пробы пищевых продуктов или продовольственного сырья. Отбирают пробу и разделяют ее на 2 равные части. Одну из них оставляют без изменений, а к другой добавляют раствор стандартов ФB и ФВ в таком количестве, чтобы массовая доля каждого из них в пробе по сравнению с исходным значением увеличилась на 50-100%. Добавка должна вводиться в пробу перед началом пробоподготовки.
    
    Обе пробы анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результаты анализа исходной пробы ( и ), мг/кг и пробы с добавкой ( и ). Определение проводят в одинаковых условиях, а именно: анализ проводит один аналитик, с использованием одного набора мерной посуды, реактивов, растворов и т.д.
    
    Алгоритм проведения оперативного контроля погрешности с использованием метода добавок состоит в сравнении результата контрольного определения, равного разности между результатом контрольного измерения пробы с добавкой (* и ), пробы без добавки ( и ) и величиной добавки ( и ), с нормативом оперативного контроля . Решение об удовлетворительной погрешности принимается при выполнении условия (при =0,95)
________________
    * Соответствует оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.
         

    
    Норматив оперативного контроля погрешности рассчитывают по формулам при проведении:
    
     внутрилабораторного контроля (=0,90)
    

, мг/кг

    
, мг/кг;

    
     внешнего контроля (=0,95)
    

, мг/кг

    
, мг/кг,

    
где , - абсолютные погрешности измерений для исходной пробы с добавкой, мг/кг;
          
    , - абсолютные погрешности измерений для исходной пробы, мг/кг;
    

                     
    , - содержание определяемых компонентов в пробе;
    

         
     и приведены в табл.1.
    
    При превышении норматива оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют с использованием другой пробы. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и устраняют их.
    
    

12. Требования техники безопасности

    
    При выполнении анализов необходимо соблюдать правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.2.007.0 и ГОСТ 4658. Помещение лаборатории должно соответствовать санитарным правилам проектирования, оборудования, эксплуатации и содержания производственных и лабораторных помещений, предназначенных для проведения работ с органическими растворителями. Аналитическая лаборатория должна быть оснащена вентиляционными системами по ГОСТ 12.4.021.
    
    

13. Требования к квалификации исполнителя

    
    К выполнению анализа ФВ и ФВ в пищевых продуктах допускаются лица со специальным высшим образованием или средним специальным образованием, владеющие техникой ВЭЖХ-анализа, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие опыт работы в химической лаборатории.
    
    

14. Условия выполнения измерений

    
    Температура окружающего воздуха от 15 до 25 °С.
    
    Относительная влажность воздуха не более 80% при 25 °С.
    
    Атмосферное давление 730-760 мм рт.ст.
    
    Напряжение электропитания: 210-220 В. Частота переменного тока: 45-50 Гц.