ГОСТ 25311-82

Группа С19

     
     
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

     
     
МУКА КОРМОВАЯ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

     
Методы бактериологического анализа

     
Feeding flour of animal origin.
Methods of bacteriological analysis

     
     
ОКСТУ 9209

Дата введения 1983-07-01

     
     
ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ

     
     1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Министерством мясной и молочной промышленности СССР
     
     РАЗРАБОТЧИКИ
     
     А.Ф.Савченко, канд. техн. наук; В.Г.Дедаш, канд. вет. наук; А.Е.Широченко, канд. биолог. наук; Н.В.Луданова, старший инженер
     
     2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 17.06.82 N 2421
     
     3. ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
     
     4. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ
     

     
     
     5. Ограничение срока действия снято по протоколу N 2-92 Межгосударственного Совета по стандартизации, метрологии и сертификации (ИУС 2-93)
     
     6. ПЕРЕИЗДАНИЕ с Изменением N 1, утвержденным в декабре 1987 г. (ИУС 4-88)
     
     
     Настоящий стандарт распространяется на кормовую муку животного происхождения и устанавливает методы бактериологического анализа:
     
     определение общего количества микробов;
     
     определение присутствия бактерий группы кишечной палочки;
     
     определение присутствия бактерий из рода сальмонелл;
     
     определение присутствия бактерий анаэробов.
     
     

1. ОТБОР И ПОДГОТОВКА ПРОБ

     
     1.1. Отбор проб для бактериологического анализа проводят по ГОСТ 17536 сухим стерильным щупом в сухую стерильную стеклянную банку.
     
     1.2. Масса точечной пробы должна быть не менее 100 г. Масса объединенной пробы должна быть не менее 500 г.
     
     1.3. Объединенную пробу тщательно перемешивают и делят пополам. Каждую часть упаковывают в стерильную стеклянную банку. Одну банку направляют в лабораторию, а другую сохраняют на предприятии до окончания анализа.
     
     1.4. При отборе проб составляют акты в двух экземплярах, которые должны содержать следующие данные: наименование предприятия-изготовителя, номер партии, вид и массу продукта, количество упаковочных единиц, дату изготовления продукции и отбора проб.
     
     

2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ

     
     2.1. Для проведения бактериологических анализов применяют следующие аппаратуру, материалы и реактивы:
     
     автоклав;
     
     анаэростат;
     
     весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104* 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г;
_______________
     * С 1 июля 2002 г. вводится в действие ГОСТ 24104-2001.
     
     гомогенизатор бактериологический, смеситель или аппарат для измельчения тканей с частотой вращения не менее 8000 об/мин;
     
     дистиллятор;
     
     лупы измерительные с увеличением 3 и 5 по ГОСТ 25706;
     
     лампы ртутно-кварцевые;
     
     микроскоп марок МБИ и МБР по НТД или других аналогичных марок;
     
     мясорубку бытовую по ГОСТ 4025;
     
     потенциометр по ГОСТ 7164;
     
     прибор для подсчета колоний;
     
     термостат электрический с автоматическим терморегулятором;
     
     холодильник электрический бытовой по ГОСТ 16317;
     
     шкаф сушильный лабораторный;
     
     агар микробиологический по ГОСТ 17206;
     
     агар сухой с эозином метиленовым синим (среда Левина);
     
     агар Эндо сухой бактериологический;
     
     агар Плоскирева сухой бактериологический;
     
     агар сухой висмут-сульфит;
     
     альфанафтиламин по НТД;
     
     алхилбензолсульфонат;
     
     баню водяную с терморегулятором;
     
     бульон мясо-пептонный по ГОСТ 20730;
     
     бумагу парафинированную по ГОСТ 9569*;
_________________
     * С 01.01.2008 на территории Российской Федерации действует ГОСТ 9569-2006. - Примечание изготовителя базы данных.

     
     бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026;
     
     вату медицинскую гигроскопическую по ГОСТ 5556;
     
     воду мясную по ГОСТ 20729;
     
     воду дистиллированную по ГОСТ 6709;
     
     воронки стеклянные по ГОСТ 25336;
     
     дрожжи хлебопекарные прессованные по ГОСТ 171;
     
     желатин пищевой по ГОСТ 11293;
     
     колбы стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336;
     
     кристаллизатор с мостиком;
     
     марлю бытовую по ГОСТ 11109;
     
     марлю медицинскую по ГОСТ 9412;
     
     масло иммерсионное для микроскопии по ГОСТ 13739;
     
     масло вазелиновое медицинское по ГОСТ 3164;
     

     мел химический осажденный по ГОСТ 8253;
     
     мясо-говядину по ГОСТ 779;
     
     набор углеводов для исследования ферментации микробов кишечной группы (большой);
     
     набор адсорбированных поливалентных сальмонеллезных 0-сывороток основных пяти групп (А, В, С, Д, Е) и редких групп;
     
     набор 0-моно и поливалентных агглютинирующих колисывороток;
     
     палочки стеклянные;
     
     парафин по ГОСТ 23683;
     
     пептон венгерский фирмы "Рихтер", чешский "Спофа";
     
     пептон сухой ферментативный для бактериологических целей по ГОСТ 13805;
     
     песок кварцевый для тонкой керамики по ГОСТ 7031;
     
     печень говяжью;
     
     пинцеты для предметных стекол;
     
     пипетки вместимостью 1, 2, 5, 10 см с ценой деления 0,1 см с широким концом;
     
     пипетки Мора вместимостью 25, 50 см;
     
     пипетки пастеровские;
     
     поплавки для пробирок и колб длиной 20, 45 и 75 мм и диаметром 5, 9 и 10 мм соответственно;
     
     препарат с индикатором ВР и глюкозой;
     
     пробирки стеклянные бактериологические по ГОСТ 25336;
     
     пробки корковые по ГОСТ 5541*;
_______________
     * На территории Российской Федерации действует ГОСТ 5541-2002. - Примечание изготовителя базы данных.

     
     пробки резиновые конусные по НТД;
     
     проволоку из никелевых сплавов диаметром 0,3-0,5 мм по ГОСТ 1791;
     
     стекла покровные для микропрепаратов по ГОСТ 6672;
     
     стекла предметные для микропрепаратов по ГОСТ 9284;
     
     ступки фарфоровые с пестиком по ГОСТ 9147;
     
     среду КОДА сухую питательную;
     
     флаконы Сокслета;
     
     цилиндры мерные наливные 1-100, 1-250, 1-500 по ГОСТ 1770;
     
     колбы мерные наливные 1-100-2, 1-250-2, 1-500-2 по ГОСТ 1770;
     
     часы песочные на 1, 2, 5 мин;
     
     чашки стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336 типа ЧБН (чашки Петри);
     
     шпатели Дригальского;
     
     штативы для пробирок;
     
     шумовку;
     
     яйца куриные;
     
     бриллиантовый зеленый;
     
     бромкрезолпурпур;
     
     бромтимоловый синий;
     
     геницианвиолет;
     
     глицерин по ГОСТ 6259, х.ч.;
     
     глюкозу кристаллическую гидратную по ГОСТ 975, х.ч.;
     

     железо хлористое по ГОСТ 4147;
     
     йод по ГОСТ 4159, х.ч.;
     
     калий йодистый по ГОСТ 4232;
     
     калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198, х.ч.;
     
     калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный по ГОСТ 2493, ч.д.а.;
     
     калий едкий;
     
     кальций углекислый по ГОСТ 4530;
     
     кислоту розоловую;
     
     кислоту щавелевую;
     
     кислоту сульфаниловую по ГОСТ 5821;
     
     лактозу, х.ч.;
     
     магний хлористый 6-водный по ГОСТ 4209, х.ч.;
     
     магний сернокислый 7-водный по ГОСТ 4523;
     
     маннит по НТД, х.ч.;
     
     метиленовый голубой;
     
     мочевину по ГОСТ 6691, х.ч.;
     
     натрия гидроокись по ГОСТ 4328;
     
     сахарозу по ГОСТ 5833, х.ч.;
     
     спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962*;
_______________
     * В Российской Федерации действует ГОСТ Р 51652-2000.
     
     спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300;
     
     фенолрот;
     
     фуксин основной для микробиологических целей;
     
     фуксин (основной и кислый) для микробиологических целей;
     
     хинозол;
     
     натрий сернистокислый безводный по ГОСТ 195.
     
     (Измененная редакция, Изм. N 1).
     
     

3. ПОДГОТОВКА К АНАЛИЗУ

     
     3.1. Приготовление питательных сред: пептонной воды, мясо-пептонного агара (МПА), сред Эндо, Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука, Киллиана, Кауфмана, Мюллера, магниевой среды, селенитового бульона, Гисса, "ХБ" (хинозол-бромкрезол-пурпуровый), хлористо-магниевой среды "М" (модифицированной), среды Хейфеца, Булира, Кесслера, Эйкмана, Левина, Ресселя, Плоскирева, висмут-сульфит агара, КОДА, Крумвиде-Олькеницкого, полужидкого агара, кровяного агара по Цейслеру, среды Китт-Тароцци, короткого пестрого ряда среды Вильсон-Блера - производят по ГОСТ 9958, ГОСТ 18963, ГОСТ 21237 и по методикам, утвержденным в установленном порядке.
     
     (Измененная редакция, Изм. N 1).
     
     3.2. Приготовление испытуемой взвеси и разведений
     
     От общей пробы отвешивают на лабораторных весах навеску массой 50 г и помещают ее в стерильную колбу или стакан гомогенизатора, содержащий 450 см стерильного физиологического раствора, и тщательно перемешивают в течение 30 мин, получая основное десятикратное разведение. После отстаивания в течение 10-15 мин из надосадочного слоя берут пипеткой 1 см жидкости, вносят в пробирку с 9 см стерильного физиологического раствора и получают последующее разведение. Из этой пробирки готовят последующие разведения (тысячекратное и т.д.).
     
     

4. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

     
     4.1. Определение общего количества микробов в 1 г муки
     
     4.1.1. Метод основан на способности живых бактериальных клеток образовывать макроколонии при оптимальных условиях культивирования на питательных средах.
     
     4.1.2. По 1 см каждого разведения вносят в стерильные бактериологические чашки и заливают 10-15 см стерильного, расплавленного и охлажденного до 45 °С мясо-пептонного агара. После застывания среды чашки помещают (вверх дном) в термостат при температуре (30,0±0,5) °С на 72 ч.
     
     (Измененная редакция, Изм. N 1).
     
     4.1.3. Обработка результатов
     
     Выросшие на чашках колонии подсчитывают, умножают на кратность соответствующего разведения. За общее количество микроорганизмов в 1 г муки принимают среднее арифметическое результатов двух смежных разведениий.
     
     4.2. Определение присутствия бактерий группы кишечной палочки
     
     4.2.1. Метод основан на способности бактерий группы кишечной палочки расщеплять маннит и лактозу, образовывать на средах "ХБ" и Хейфеца кислые продукты, изменяющие цвет индикаторов, входящих в состав этих сред.
     
     (Измененная редакция, Изм. N 1).
     
     4.2.2. По 1 см каждого разведения вносят (по выбору) в пробирки, содержащие по 5 см среды: Эйкмана, Кесслер, Булира, Хейфеца, "ХБ" или КОДА. Посевы помещают в термостат при температуре 43 °С для первых пяти сред и 37 °С для последней.
     
     4.2.3. Через 24 ч учитывают рост на средах Эйкмана, Булира по помутнению среды и образованию газа, на средах Хейфеца, "ХБ" и КОДА - по изменению цвета сред.
     
     (Измененная редакция, Изм. N 1).
     
     4.2.4. Из пробирок, где наблюдается рост микробов, производят посев в количестве 0,1-0,2 см на плотные дифференциально-диагностические среды (Эндо, Левина) и выдерживают в термостате при температуре 37 °С в течение 18-24 ч.
     
     Типичные колонии Е. Соli характеризуются круглой формой, выпуклой или слегка приподнятой в центре поверхностью, ровными краями, розового, красного или малинового цвета с металлическим блеском или без него на среде Эндо и фиолетового или черного - на среде Левина.
     
     Выросшие изолированные колонии (не менее 4) пересевают на мясо-пептонный бульон, выдерживают в термостате при температуре 37 °С в течение 18-24 ч. После этого одну часть пробирок используют для приготовления мазков, посева на дифференциально-диагностические среды, заражения мышей, вторую - для приготовления кипяченого антигена.
     
     4.2.5. У выделенных культур изучают морфологические, культурально-биохимические и патогенные свойства с целью проведения их родовой дифференциации. Культурально-биохимические свойства изучают по комплексу ЛИМАЦ (лактоза+индол+метилрот+реакция фогес Проскауэра-, цитратно-аммонийные соли +).
     
     Одновременно с определением морфологических, культурально-биохимических и патогенных свойств бактерий проводят серологическую типизацию культур кишечной палочки по 0-антигену.
     
     Для приготовления антигена каждую предназначенную для типизации суточную агаровую культуру (пробирку со скошенным агаром) смывают стерильным физиологическим раствором, доводят суспензию бактерий до концентрации 5-6 млрд/см, кипятят в водяной бане в течение 1 ч и ставят реакцию агглютинации на стекле с комплексной 0-сывороткой, разведенной физиологическим раствором в соотношении 1:5.
     
     (Измененная редакция, Изм. N 1).
     
     4.2.6. Если комплексные 0-колисыворотки в начальной реакции не агглютинируют антиген убитой нагреванием культуры, то готовят из этого штамма суспензию бактерий и автоклавируют ее при давлении 10 Па (1 атм) в течение 2 ч для разрушения термостабильного А-антигена. Автоклавированный антиген исследуют с сыворотками 08, 09, 0101.
     
     4.2.7. Обработка результатов
     
     При наличии агглютинации дают заключение о присутствии в исследуемой муке энтеропатогенных типов Е. Coli.
     
     Кроме этого, энтеропатогенными признают культуры Е. Coli, которые:
     
     серологически типизируются набором типоспецифических колисывороток, но не вызывают гибель белых мышей;
     
     серологически не типизируются, но вызывают гибель белых мышей.
     
     4.3. Определение присутствия бактерий из рода сальмонелл
     
     4.3.1. Метод выявления сальмонелл основан на определении их характерного роста на элективных средах и установлении ферментативных и серологических свойств.
     
     4.3.2. Навеску муки массой от 50 до 200 г помещают в колбу, содержащую одну из сред предварительного обогащения (физиологический раствор, пептонная вода) при соотношении муки и среды 1:5. Содержимое колбы тщательно перемешивают и помещают в термостат при температуре 37 °С. Через 16-18 ч производят посевы на две (по выбору) основные среды обогащения (селенитовый бульон, магниевую среду, среды Киллиана, Мюллера, Кауфмана) в соотношении 1:5.
     
     После 16-18 ч термостатирования при температуре 37 °С из обогатительных сред бактериологической петлей производят посевы в чашки с твердыми дифференциально-диагностическими средами висмут-сульфит агар, среды Плоскирева или Левина (по две чашки), которые помещают в термостат при температуре 37 °С.
     
     4.3.3. Засеянные чашки просматривают через 24-48 ч.
     
     На висмут-сульфит агаре S. typhi, S. paratyphi А растут в виде мелких, нежных серовато-зеленых колоний с черным центром; S. Cholerae suis - в виде зеленых колоний. Колонии почти всех других сальмонелл значительно крупнее, темно-коричневого цвета с металлическим блеском, окруженные светлым ореолом, цвет участка среды под колонией - черный.
     
     На среде Плоскирева сальмонеллы растут в виде прозрачных или нежно-розовых колоний; на среде Левина - прозрачные, бледные, нежно-розовые или розовато-фиолетовые колонии.
     
     При обнаружении колоний, подозрительных на сальмонеллы, три-пять из них засевают на комбинированные среды: Расселя, Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука или трехсахарную (лактоза, глюкоза, сахароза) "скошенный столбик" с мочевиной.
     
     Высев колоний делают на короткий пестрый ряд, включающий скошенный агар и среды Гисса с лактозой, глюкозой и сахарозой, а также на бульон Хоттингера для определения индола и сероводорода.
     
     Культуры, представляющие грамотрицательные подвижные палочки, ферментирующие глюкозу с образованием газа, не ферментирующие лактозу и сахарозу, не разлагающие мочевину и не образующие индол, подвергаются серологическому исследованию - испытанию в реакции агглютинации на предметном стекле с поливалентной адсорбированной 0-сывороткой.
     
     4.3.4. Обработка результатов
     
     Обнаружение подвижных (кроме S. pullorum, S. gallinarum) грамотрицательных палочек, дающих характерный рост на элективных средах, не ферментирующих лактозу и сахарозу, ферментирующих глюкозу и маннит с образованием кислоты и газа (S. typhi suis не ферментирует маннит), дающих положительную реакцию агглютинации с поливалентной адсорбированной 0-сывороткой, указывает на наличие бактерий из рода сальмонелл.
     
     4.3.3, 4.3.4. (Измененная редакция, Изм. N 1).
     
     4.4. Определение присутствия бактерий анаэробов
     
     4.4.1. Метод основан на способности анаэробов расти в отсутствие кислорода воздуха, морфологии возбудителей, росте на питательных средах и на выявлении патогенности возбудителей путем заражения лабораторных животных.
     
     4.4.2. В пробирки со средами Китт-Тароцци и Вильсон-Блера и в чашки с кровяным агаром по Цейслеру вносят по 1 см первых трех разведений испытуемой взвеси, помещают в термостат и инкубируют при температуре (37,0±0,5) °С в течение 24-48 ч.
     
     Почернение среды Вильсон-Блера, а также быстрое начало роста на среде Китт-Тароцци при обильном газообразовании является характерным для С. perfringens. На кровяном агаре через 24 ч поверхность колоний С. perfringens слегка выпуклая, округлая, продолговатая, сочные колонии от серого до зеленого цвета, окружены большой зеленовато-коричневой зоной гемолиза. В мазках, приготовленных с кровяного агара, хорошо выражены капсулы и центрально расположенные, крупные овальные, по объему превышающие ширину палочки, споры. Биологическую пробу проводят на морских свинках и белых мышах путем внутрибрюшного заражения двухсуточной бульонной культурой. При положительном результате подопытные животные гибнут через 2-3 сут. Рост С. botulinum наблюдается на 2-3 сут. и характеризуется помутнением среды Китт-Тароцци, образованием осадка и запахом прогорклого масла. При исследовании на наличие токсина берут навеску муки массой не менее 50 г, помещают в колбу, содержащую стерильный физиологический раствор в соотношении 1:4. Подготовленный материал настаивают в течение 2-3 ч, затем центрифугируют и центрифугатом заражают внутрибрюшинно или подкожно морских свинок в дозе 1-2 см или белых мышей в дозе 0,2-0,3 см. Контрольным животным вводят подогретый на водяной бане при температуре 100 °С в течение 30 мин центрифугат в тех же дозах.
     
     (Измененная редакция, Изм. N 1).
     
     4.4.3. Обработка результатов
     
     Наиболее характерные признаки роста С. perfringens - почернение среды Вильсон-Блера, интенсивный рост на среде Китт-Тароцци с обильным образованием газа, слегка выпуклые, круглые или продолговатые колонии серо-зеленоватого цвета на кровяном агаре. Биопробу считают положительной, когда подопытные животные погибают в течение двух суток после введения им центрифугата, не подвергнутого кипячению.