МУК 4.1.769-99

     
     
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Количественное определение формальдегида
в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

     
Дата введения 1999-09-06

     
     УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 6 июля 1999 г.
     
     
     Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТа 8.563-96 "Методики выполнения измерений", ГОСТа Р 1.5-92 "Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов". Методика анализа аттестована и обеспечивает определение формальдегида в диапазоне концентраций 0,001-2,0 мкг/см.
     

     Формальдегид (муравьиный альдегид, метаналь) - газ с резким запахом. 35-40%-ный водный раствор формальдегида называется формалином или формолем. Растворы выделяют газообразный формальдегид при комнатной температуре. Т - минус 19,3 °С, Т - минус 118,3 °С. Формальдегид растворим в воде и органических растворителях (бензол, толуол, ацетон, этанол, этилацетат и др.). Формальдегид - раздражающий газ, вызывает дегенеративные процессы в паренхиматозных органах, сенсибилизирует кожу, действует на ЦНС. Относится ко 2 классу опасности.
     
     Методика обеспечивает выполнение измерений с суммарной погрешностью результата измерений 20,0% при доверительной вероятности 0,95.
     
     

Сущность метода

     
     Методика основана на предварительном переводе формальдегида в 2,4-динитрофенилгидразон формальдегида, концентрировании продукта дериватизации из биологического материала экстракцией гексаном, упаривании гексанового экстракта, растворении упаренного остатка в ацетонитриле и анализе на жидкостном хроматографе.
     
     Измерение концентрации формальдегида выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием УФ-детектора.
     
     Нижний предел измерения в объеме пробы - 0,05 мкг.
     
     Определению не мешают метанол, этанол, уксусный альдегид, ацетон, муравьиная кислота и другие карбонильные соединения.
     
     Длительность анализа, включая подготовку пробы, - 40 мин.
     
     

Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы

     
     При выполнении анализа применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы.
     

Требования к безопасности

     
     Помещение для проведения измерений должно соответствовать требованиям "Пожарных норм проектирования зданий и сооружений" (СНиП ПА-5-700) и "Санитарных норм проектирования промышленных предприятий" (СН-245-71) и СНиП-74.
     
     При выполнении работ должны быть соблюдены меры противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТа 12.1.004-85 и правила техники безопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.007-76.
     
     При работе необходимо соблюдать "Правила по технике безопасности и производственной санитарии при работе в химических лабораториях", утверждены МЗ СССР 20.12.82 (М.,1981), и "Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением", утверждены Госгортехнадзором СССР 27.11.87 (М.: Недра, 1989).
     
     При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТу 12.1.005-88.
     
     При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.
     

Требования к квалификации оператора

     
     К выполнению хроматографических измерений биологических проб допускаются лица, прошедшие обучение работе на жидкостном хроматографе.
     
     

Условия измерений

     
     При подготовке проб к анализу и приготовлении растворов соблюдают следующие условия:
     
      температура воздуха (20±10) °С;
     
      атмосферное давление 630-800 мм рт.ст.;
     
      влажность воздуха - не более 80% при температуре 25 °С.
     
     Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией по прибору.
     

Подготовка к выполнению измерений

     
     Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды и растворителей, приготовление растворов, подготовка хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики.
     

Подготовка посуды

     
     Используемую посуду необходимо тщательно вымыть хромовой смесью, тщательно ополоснуть водопроводной и дистиллированной водой и просушить при температуре 120 °С.
     

Подготовка растворителей

     
     Очистка ацетонитрила от примесей. В колбу вместимостью 2 дм помещают 1 дм ацетонитрила и 20 г КМnО, кипятят с обратным холодильником в течение 1 ч, затем перегоняют с дефлегматором, отбирая фракции по 200 см. Когда в колбе останется около 200 см продукта, перегонку прекращают. Остаток можно смешивать с новой порцией растворителя. Первую фракцию отбрасывают, а остальные проверяют на поглощение в УФ-области.
     

Приготовление растворов

     
     Хромовая смесь. В термостойкий стакан вместимостью 2 дм насыпают 50 г хромовокислого калия, осторожно приливают по палочке частями, тщательно перемешивая, 1 дмконцентрированной серной кислоты.
     
     Элюент для хроматографии. 50 см очищенного ацетонитрила смешивают с 50 см дистиллированной воды. Подвижную фазу фильтруют через воронку Шотта (пор 16) и дегазируют барботированием гелия или азота в течение 5-10 мин со скоростью 50-60 об/мин.
     
     Соляная кислота, 2 моль/дм. 163,0 см концентрированной HCl (плотность 1,19 г/см) вносят в мерную колбу вместимостью 1 дм доводят объем до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.
     
     2,4-динитрофенилгидразин, 0,2%-ный раствор в 2М соляной кислоте. 0,2 г 2,4-динитрофенилгидразина вносят в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят до метки 2М раствором соляной кислоты.
     
     Исходный раствор формальдегида для калибровки (раствор А). 1 см ГСО формальдегида с концентрацией 1,0 мг/см переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят дистиллированной водой до метки. Срок хранения раствора - 36 ч.
     
     Рабочий раствор для градуировки УФ-детектора. В мерную колбу вместимостью 100 см вносят 10 см раствора А и доводят дистиллированной водой до метки (раствор Б). Срок хранения раствора - 36 ч.
     
     Идентификация хроматографического пика 2,4-динитрофенилгидразона формальдегида. Готовят раствор 2,4-динитрофенилгидразона формальдегида в ацетонитриле с концентрацией 0,01-0,02 мг/см, вводят в колонку хроматографа 1-2 мм раствора. Снимают хроматограмму в условиях хроматографического анализа и определяют время удерживания 2,4-динитрофенилгидразона формальдегида.
     

Подготовка хроматографической колонки

     
     Колонку устанавливают на хроматограф и подают элюирующую жидкость (ацетонитрил : вода = 1:1) со скоростью 1 см/мин до установления равновесия колонки, которое определяют по стабильности нулевой линии детектора.
     

Установление градуировочной характеристики

     
     Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика на хроматограмме от концентрации формальдегида в моче, устанавливают по пяти сериям растворов для градуировки. Каждую серию, состоящую из шести растворов, готовят из растворов А и Б.
     
     Растворы для установления градуировочной характеристики готовят в мерных колбах вместимостью 50 см. Для этого в каждую колбу вносят раствор А (или раствор Б) в соответствии с таблицей, доводят объем до метки мочой, не содержащей формальдегид, и тщательно перемешивают. Растворы готовят непосредственно перед определением.
     
     

Таблица

     
Растворы для установления градуировочной характеристики при определении концентрации
формальдегида в моче (фрагмент шкалы)

     
     
     50 см каждого рабочего раствора помещают в делительную воронку, добавляют 2,5 см 0,2%-ного раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2М соляной кислоте, 2 капли концентрированной соляной кислоты, 5 см гексана и экстрагируют 15 мин. После расслоения гексана и мочи верхний слой (гексановый) переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 1-2 мин со скоростью 2750 об/мин, затем 2 см гексана переносят в бюкс и выпаривают досуха под ИК-лампой. Высушенный остаток растворяют в 0,5 см ацетонитрила и вводят в хроматограф аликвотную часть (10 мм). Проводят по пять параллельных вводов обработанных экстрактов каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях:
     

     По средним для каждой точки значениям аналитического сигнала (площади пика) строят градуировочную характеристику , где  - площадь пика, мм (или усл. ед);  - концентрация градуировочного раствора, мкг/см. По установленной градуировочной характеристике и по значению аналитического сигнала пробы определяют концентрацию формальдегида в исследуемом образце.
     

Отбор проб

     
     Для отбора проб мочи используют чистую стеклянную посуду объемом 100 см с плотно закрывающейся крышкой. Срок хранения пробы мочи в холодильнике - не более суток.
     
     

Выполнение измерений

     
     50 см анализируемой пробы помещают в делительную воронку, добавляют 2,5 см 0,2%-ного раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2М соляной кислоте, 2 капли концентрированной соляной кислоты, 5 см гексана и экстрагируют 15 мин. После расслоения гексана и мочи верхний слой (гексановый) переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 1-2 мин со скоростью 2750 об/мин, затем 2 см гексана переносят в бюкс и выпаривают досуха под ИК-лампой. Высушенный остаток растворяют в 0,5 см ацетонитрила и вводят в хроматограф аликвотную часть (10 мм). Анализ проводят при вышеуказанных условиях работы хроматографа. По установленной градуировочной характеристике и по значению аналитического сигнала пробы определяют концентрацию формальдегида в исследуемом образце.
     
     

Вычисление результатов измерения

     
     Вычисляют значение площади хроматографического пика 2,4-динитрофенилгидразона формальдегида по формуле:
     

, мм,

     
где  - высота пика, мм;
     
      - ширина пика на половине высоты, мм.
     
     По значению площади хроматографического пика 2,4-динитрофенилгидразона формальдегида из градуировочных характеристик находят массовую концентрацию формальдегида в моче, мкг/см.
     
     

Внутренний оперативный контроль

     
     Внутренний оперативный контроль качества результатов контрольного химического анализа (сходимость, воспроизводимость, точность) осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве анализов и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению (МИ 2335-95).
     

Оперативный контроль сходимости

     
     Периодичность контроля сходимости измерений зависит от количества рабочих измерений (2 параллельные пробы). Отбирают 2 пробы мочи и каждую из них анализируют в точном соответствии с прописью методики.
     
     Результаты признаются удовлетворительными, если выполняется условие:
     

,

     
где  и  - результаты анализа 1 и 2 проб;
     
      - допустимое расхождение между двумя результатами одной и той же пробы (=55%);
     
      - среднее значение между двумя определениями.
     

Оперативный контроль точности

     
     Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.
     
     Образцами для контроля являются представительные пробы биосред, к которым делаются добавки в виде раствора. Отбирают 2 пробы и к одной из них делают добавку в виде раствора таким образом, чтобы их содержание увеличилось по сравнению с исходным на 50-150%. Каждую пробу анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результат анализа исходной рабочей пробы  и рабочей пробы с добавкой . Результаты анализа исходной рабочей пробы  и рабочей пробы с добавкой  получают не по возможности, а в одинаковых условиях, т.е. их получает один аналитик с использованием одного набора мерной посуды, одной партии реактивов и т.д.
     
     Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется условие:
     

,

где  - добавка к пробе в виде раствора с концентрацией мкг/см;
     
      - норматив оперативного контроля погрешности, мкг/см.
     
     При внешнем контроле (=0,95) принимают
     

,

     
где  и  - характеристики погрешностей для исходной пробы и пробы с добавкой, мкг/см.
     

 и .

     
     При внутрилабораторном контроле (=0,90) принимают, что
     

.

          
     При превышении оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и их устраняют.
     
     
     
Текст документа сверен по:
официальное издание
Определение химических соединений
в биологических средах: Сборник методических
указаний МУК 4.1.763-4.1.779-99. -
М.: Федеральный центр
госсанэпиднадзора Минздрава России, 2000