МУК 4.2.1773-03  

     
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод микробиологического измерения концентрации клеток
Candida tropicalis Y-456 - продуцента ксилита в атмосферном воздухе
населенных мест

 
Дата введения 2003-12-01

     УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 24 октября 2003 г.
     
     

1. Общие положения и область применения

     
     Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Candida tropicalis Y-456 - продуцента ксилита в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 10 до 3000 клеток в 1 м воздуха.
     
     Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 "Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ" и Р 8.563-96 "Методики выполнения измерений".
     
     Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.
     
     Методические указания одобрены и рекомендованы секцией "Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды" Проблемной комиссии "Научные основы гигиены окружающей среды".
     
     

2. Биологическая характеристика Candida tropicalis Y-456
и его гигиенический норматив

     
     На сусло-агаре на 2-3 сутки штамм образует круглые кремоватые колонии с ровным краем, средний диаметр изолированных колоний составляет 0,3 см, а максимальный - 0,8 см. В центре колоний образуется небольшое возвышение - "бугорок", на среде появляется маленькое желто-оранжевое окрашивание. Консистенция колоний мягкая, неплотная, вязкая. Поверхность гладкая, слегка матовая.
     
     Морфологически штамм представлен полиморфными клетками: округлые, овальные, большей частью одиночные 2-4 мкм, иногда цепочки или конгломераты из вытянутых клеток 10-12 мкм. Наблюдается обилие бластоспор.
     
     При выращивании на кукурузном агаре по Дальмау в чашках Петри обильно образуются псевдогифы с многократными разветвлениями и бластоконидиями, расположенными одиночно или цепочками вдоль гиф (8).
     
     Систематическое положение микроорганизма
     

     
     Штамм получен из ЦМПМ ВНИИгенетика как продуцент этанола и селектирован по признаку формирования крупных колоний на средах с ксилозой. Штамм является продуцентом ксилита. Продуктивность на средах с 5% содержанием ксилозы: максимальная - 80% ксилита, средняя - 78,8-76,2% (39,5 г/л) ксилита.
     
     Штамм-продуцент растет на жидких и агаризованных средах. Оптимальная температура роста 35-37 °С, рН среды - 5,0-6,0. Для размножения используется сусло-агар 5-6 °Б, среда ДАП - глюкоза (ксилоза) - 20 г, дрожжевой экстракт - 2,0 г, пептон - 2 г, агар-агар - 20 г, вода - 1 л, рН среды - 5,0-6,0.
     
     Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе населенных мест - 30 кл/м, пометка А.
     
     

3. Пределы измерений

     
     Методика обеспечивает выполнения измерений количества клеток дрожжевого гриба в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 10 до 3000 клеток в 1 м воздуха при доверительной вероятности 0,95.
     
     

4. Метод измерений

     
     Метод основан на аспирации из воздуха клеток дрожжеподобного гриба на поверхность среды сусло-агар и подсчета выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам на 2 сутки развития. В качестве дополнительного контроля предлагается отбор пробы на чашку Петри с селективной средой для дифференцирования С. tropicalis от других дрожжеподобных грибов, обладающих способностью к образованию ростковых трубок (9, 10).
     
     

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

     
     При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.
     

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

     
5.2. Реактивы, растворы

     
     Среда сусло-агар: солодовое сусло (значение Баллинга от 5 до 6°) - 98%, агар-агар - 2%, рН среды 5,0-6,0, режим стерилизации: Р - 0,8 кгс/см, 40 мин.
     
     Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67*.

_______________
     * На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 51652-2000. - Примечание .

     
     Сыворотка или плазма крови человека (вместо них можно использовать среду 199).
     
     Антибиотик биомицин (хлортетрациклина гидрохлорид).
     
     

6. Требования безопасности

     
     При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования:
     
     6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.
     
     6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.
     
     6.3. "Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977).
     
     6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
     
     

7. Требования к квалификации операторов

     
     К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
     
     

8. Условия измерений

     
     Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20±5 °С), атмосферном давлении 30-800* мм рт.ст и влажности воздуха не более 80%.
________________
     * Соответствует оригиналу. - Примечание .
     
     

9. Проведение измерения

     
9.1. Условия отбора проб воздуха

     
     Для определения концентрации клеток продуцента воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность среды сусло-агар. Время аспирации воздуха (5-20 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента.
     
     Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
     

9.2. Выполнение анализа

     
     Метод предполагает учет количества типичных колоний, выросших на 2 сутки после посева проб воздуха по культурально-морфологическим признакам. Метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.
     
     Агаризованную среду сусло-агар расплавляют, остужают до 50-60 °С, тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности.
     
     Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.
     
     После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат при температуре 37 °С. На 2-е сутки производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.
     
     Для постановки дополнительного контроля в среду добавляют сыворотку или плазму крови человека (можно также заменить средой 199) из расчета 0,5 мл сыворотки на 5 мл среды. После отбора проб инкубируют при 37 °C в течение 3 часов. При микроскопировании некоторые дрожжеподобные грибы (С. albicans) в отличие от С. tropicalis на селективной среде образуют ростковые трубки диаметром 3-4 мкм и длиной до 20 мкм (они сходны с мицелием, но не дают сужения в месте прикрепления к дрожжевой клетке).
     
     

10. Вычисление результатов измерения

     
     Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м воздуха производят по формуле:
     

 кл/м,

где  - концентрация клеток продуцента в воздухе;
     
      - количество колоний продуцента, выросших на чашке;
     
     1000 - коэффициент пересчета на 1 м воздуха;
     
      - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

11. Оформление результатов измерений

     Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

Протокол N
количественного микробиологического анализа
штамма-продуцента Candida tropicalis Y-456 в атмосферном воздухе населенных мест

Результаты микробиологического анализа

     Ответственный исполнитель
     
     Научный руководитель
     
     

Список литературы

     
     1. Руководство по контролю загрязнения атмосферы: РД 52.04.186-89. М, 1991. 693 с.
     
     2. ГОСТ Р 8.563-96. ГСИ "Методики выполнения измерений".
     
     3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности. М., 1980. 27 с.
     
     4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. М., 1977. 7 с.
     
     5. ГОСТ 17.2.4.02-81 "Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ". М.: Изд-во стандартов, 1981. 3 с.
     
     6. Влодавец В.В., Немыря В.И. Санитарно-микологический контроль объектов окружающей среды на предприятиях микробиологической промышленности// Гиг. и сан., 1977. N 1. 25-28 с.
     
     7. Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. М.: МГУ. 122 с.
     
     8. Саттон Д., Фотергилл А., Ринальди М. Определитель патогенных и условно патогенных грибов. М.: Мир, 2001. 110 с.
     
     9. Кашкин П.Н., Лисин В.В. Практическое руководство по медицинской микологии. М.: Медицина, 1983. 153 с.
     
     10. Kwon-Chung К.J., Bennett J.E. Medical mycology. Philadelphia: Lea & Febiger, 1992. P.61-62.

          
Текст документа сверен по:
официальное издание
Методы контроля. Микробиологические факторы.

Методические указания: [Сборник]
(МУК 4.2.1767-03 - МУК 4.2.1775-03). -
М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора
Минздрава России, 2004