МУК 4.1.1959-05

     МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
   

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Спектрофотометрическое определение
субтилизина (протеазы) в атмосферном воздухе

     
Дата введения 2005-07-01

     
     
     1. РАЗРАБОТАНЫ ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН (к.х.н. А.А.Беззубовым) и НИЦ "ЭКОС" (В.А.Смирновым).
     
     2. УТВЕРЖДЕНЫ Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 21 апреля 2005 г.
     
     3. ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ с 1 июля 2005 г.
     
     4. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.
     
     

1. Область применения

     
     Настоящие методические указания устанавливают количественный спектрофотометрический анализ атмосферного воздуха для определения в нем субтилизина (протеазы) в диапазоне концентраций 0,005-0,05 мг/м.
     
     Методические указания предназначены для использования лабораториями центров гигиены и эпидемиологии при осуществлении аналитического контроля химического загрязнения атмосферного воздуха в районе расположения производства субтилизина (протеазы), производственными лабораториями предприятий, научно-исследовательскими институтами, работающими в области гигиены окружающей среды.
     
     Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-96 "Методика выполнения измерений", ГОСТ 17.2.4.02-81 "Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ".
     
     Методические указания одобрены и рекомендованы к практическому применению на бюро секции по физико-химическим методам исследования объектов окружающей среды Проблемной комиссии "Научные основы экологии человека и гигиены окружающей среды" и бюро Комиссии по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
     
     

2. Физико-химические и токсикологические свойства

     
     Субтилизин (протеаза) является ферментом класса гидролаз и катализирует гидролиз белков и пептидов, а также сложных эфиров и амидов N-защищенных аминокислот. Продуцируется Bacillus subtilis и родственными бактериями. Молекулярная масса более 27000. Выпускается в виде гранул кремового цвета со слабым запахом. Растворим в воде и растворах щелочей. Применяется в химической промышленности, в частности, как добавка к синтетическим моющим средствам.
     
     Субтилизин (протеаза) обладает раздражающим действием на кожу и слизистые оболочки глаз, является аллергеном. В атмосферном воздухе находится в виде аэрозоля. ОБУВ протеазы щелочной - 0,01 мг/м.
     
     

3. Погрешность измерений

     Методика обеспечивает выполнение измерений с погрешностью, не превышающей ±21%. При доверительной вероятности 0,95.
     
     

4. Метод измерений

     Измерение концентраций субтилизина (протеазы) основано на улавливании его из воздуха и концентрировании на фильтре с последующей десорбцией 2Н раствором гидрооксида натрия, реакции образования окрашенного комплекса с солью меди (метод Лоури) и последующем спектрофотометрировании при длине волны 650 нм.
     
     Нижний предел измерения содержания субтилизина (протеазы) в анализируемом объеме пробы - 10 мкг.
     
     Измерению мешают фенол, тимол, сульфосалицил, а также белки.
     
     

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы

     При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы.
     

5.1. Средства измерений  

     
5.2. Вспомогательные устройства

     
5.3. Материалы

     
5.4. Реактивы

     
     
6. Требования безопасности

     6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88.
     
     6.2. При выполнении измерений концентраций субтилизина (протеазы) с использованием спектрофотометра СФ-46 и электроаспиратора следует соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.
     
     

7. Требования к квалификации оператора

     
     К выполнению измерений и обработке их результатов на спектрофотометре и электроаспираторе допускаются лица, знающие устройство и правила эксплуатации приборов.
     
     

8. Условия измерений

     
     При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
     
     8.1. Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20±5) °С, атмосферном давлении 630-800 мм рт.ст. и влажности воздуха не более 80%.
     
     Выполнение измерений на спектрофотометре СФ-46 проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору и настоящими методическими указаниями.
     
     

9. Подготовка к выполнению измерений и проведение измерений

     
     Перед выполнением измерений проводят следующие работы: приготовление реактивов, подготовка спектрофотометра к работе, установление градуировочной характеристики, отбор проб.
     

9.1. Приготовление растворов

     Исходный раствор протеазы для градуировки (=1 мг/см). В мерную колбу емкостью 25 см вносят 26,3 мг (95% основного вещества), доводят 2Н раствором гидроокиси натрия до метки и тщательно перемешивают. Срок хранения исходного раствора 6 часов.
     
     Рабочий раствор протеазы для градуировки (=100 мкг/см). В мерную колбу емкостью 25 см помещают 2,5 см исходного раствора, доводят 2Н раствором гидрооксида натрия до метки и тщательно перемешивают. Срок хранения рабочего раствора 6 часов.
     
     0,1 Н раствор гидрооксида натрия. В колбу емкостью 1000 см помещают 4,0 г гидрооксида натрия, приливают дистиллированную воду до метки и тщательно перемешивают до полного растворения.
     
     2 Н раствор гидрооксида натрия. В колбу емкостью 1000 см помещают 80,0 г гидроокиси натрия, приливают дистиллированную воду до метки и тщательно перемешивают до полного растворения.
     
     Рабочий раствор N 1. В колбу емкостью 100 см помещают 10,0 г углекислого натрия, 0,2 г калий-натрий тартрата, 0,05 г серно-кислой меди, приливают дистиллированную воду до метки и тщательно перемешивают.
     
     Исходный раствор реактива Фолина. В круглодонную колбу емкостью 1000 см помещают 50,0 г натрия вольфрамово-кислого, 12,5 г натрия молибденово-кислого, добавляют 360 см дистиллированной воды и перемешивают до полного растворения реактивов. К полученному раствору добавляют 25 см 85% раствора ортофосфорной кислоты, 50 см концентрированной соляной кислоты и смесь кипятят в течение 10 ч с обратным холодильником. Затем добавляют 76 г лития сернокислого, 25 см дистиллированной воды и 3 капли брома. Кипятят под тягой без обратного холодильника для удаления остатка брома. Охлаждают до комнатной температуры и доводят дистиллированной водой до объема 500 см, перемешивают и фильтруют. Из фильтрата отбирают 1 см, добавляют 9 см дистиллированной воды и титруют 0,1 н раствором гидрооксида натрия по фенолфталеину. Реактив Фолина с установленным титром доводят дистиллированной водой до 1 н концентрации. Раствор хранят в темной склянке с притертой пробкой в холодильнике. Срок хранения реактива - 1 месяц.
     
     Рабочий раствор реактива Фолина готовят перед употреблением путем разбавления 1 см исходного раствора реактива Фолина дистиллированной водой до объема 8 см в расчете на одну пробу.
     

9.2. Подготовка спектрофотометра к работе

     
     Подготовку спектрофотометра к работе проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации.
     

9.3. Установление градуировочной характеристики

     
     Градуировочную характеристику устанавливают на градуировочных растворах. Она выражает зависимость оптической плотности растворов от массы субтилизина (протеазы) и устанавливается по 5 сериям растворов для градуировки.
     
     Каждую серию, состоящую из 6 растворов, готовят в пробирках с притертыми пробками. Для этого в них вносят рабочий раствор протеазы и 2 Н раствор гидрооксида натрия в соответствии с таблицей. После этого в каждую пробирку приливают 2,0 см рабочего раствора N 1, тщательно перемешивают и выдерживают в течение 10 мин. Затем добавляют 8 см рабочего раствора реактива Фолина, перемешивают и нагревают на водяной бане при температуре 50 °С в течение 5 мин. После быстрого охлаждения замеряют оптическую плотность растворов в кювете с толщиной оптического слоя 2,0 мм при длине волны 650 нм по отношению к раствору N 1 в таблице. Строят градуировочную характеристику, нанося на ось ординат значения оптических плотностей градуировочных растворов, а на ось абсцисс - соответствующие им величины содержания протеазы. Градуировку проверяют 1 раз в 3 месяца или в случае использования новой партии реактивов.
     
     

Таблица

     
Растворы для установления градуировочной характеристики
при определении концентрации субтилизина (протеазы)

  
   
9.4. Отбор проб

     
     Отбор проб воздуха, содержащего субтилизин (протеазу), проводят согласно ГОСТ 17.2.3.01-86. Воздух аспирируют с помощью электроаспиратора через фильтр со скоростью 200 дм/мин в течение 30 мин. Отобранные пробы помещают в пробирки с притертыми пробками. Срок хранения - 3 дня.
     

10. Выполнение измерений

     
     Фильтр с отобранной пробой помещают в бюкс, заливают 3 см 2 Н раствора гидрооксида натрия и оставляют на 10-15 мин, периодически помешивая стеклянной палочкой. Степень десорбции протеазы с фильтра 98%. Фильтр отжимают и отбрасывают. Для анализа отбирают 1,0 см полученного раствора и далее проводят анализ в условиях, описанных в п.9.3.
     
     Расчет содержания субтилизина (протеазы) проводят по градуировочной характеристике.
     
     

11. Вычисление результатов измерений

     
     Концентрацию субтилизина (протеазы) в атмосферном воздухе (мг/м ) вычисляют по формуле:
     

, где

     
      - содержание субтилизина (протеазы) в анализируемом объеме пробы, мкг;
     
     - общий объем пробы, см;
     
      - объем пробы, взятой для анализа, см;
     
      - объем воздуха, взятого для анализа и приведенного к нормальным условиям, дм;
     

, где

     
      - объем воздуха, взятого для анализа, дм;
     
      - атмосферное давление, мм рт.ст.;
     
      - температура воздуха в месте отбора пробы, °С.
     
     

12. Оформление результатов измерений

     
     Результаты измерений концентраций субтилизина (протеазы) оформляют протоколом в виде: , мг/м; ±21% с указанием даты проведения анализа, места отбора пробы, названия лаборатории, юридического адреса организации, ответственного исполнителя и руководителя лаборатории.
     
     

13. Контроль погрешности измерений

     
     Контроль погрешности измерений содержания субтилизина (протеазы) проводят на градуировочных растворах в соответствии с пп.10 и 11. Рассчитывают среднее значение результатов измерения содержания протеазы в градуировочных растворах:

, где

     
      - число измерений в градуировочной смеси,
     
      - результат измерения содержания вещества в -ой пробе градуировочного раствора, мг/дм.
     
     Рассчитывают среднее квадратичное отклонение измерений концентрации:     

     
     Рассчитывают доверительный интервал:
     

, где

     
      - коэффициент нормированных отклонений, определяемый по табл. Стьюдента, при доверительной вероятности 0,95, и затем относительную погрешность определения концентраций:
     

, %

     
     Если 21%, то погрешность измерения удовлетворительная. Если данное условие не выполняется, то выясняют причину и повторяют измерения.
     
     
     
Текст документа сверен по:
официальное издание
М.: Федеральный центр гигиены
и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2006