МУК 4.1.1232-03  

     
     
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

     
     
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

     
Определение остаточных количеств трифлоксистробина
в воде, почве, яблоках и его метаболита ЦГА 321113 в воде и почве
газохроматографическим методом

     
     
Дата введения  2003-07-01

     
     
     УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 16 марта 2003 г.
          
     

1. Вводная часть

     
     Фирма-производитель: Сингента (Швейцария).
     
     Торговое название: ЗАТО, ФЛИНТ.
     
     Действующее вещество: трифлоксистробин (ЦГА 279202).
     
     (Е,Е)-метоксиимино-{2-[1-(3-трифторметилфенил)-этилиденамино-оксиметил]-фенил} уксусной кислоты метиловый эфир (ИЮПАК).
     
     Структурная формула:     

          
     Эмпирическая формула: CHFNO.
     
     Молекулярная масса: 408,4.
     
     Белый порошок без запаха.
     
     Температура плавления: 72,9 °С.
     
     Давление паров при 25 °С: 3,4х10 Па.
     
     Растворимость (г/л) при 25 °С: вода - 0,0006, гексан - 11, толуол - 500, дихлорметан - 500, метанол - 76, ацетон - 500, этилацетат - 500.
     
     Стабильность к гидролизу при 20 °С: DT=3139 дней (рН 5), 80,1 дня (рН 7), 1,1 дня (рН 9).
     
     В биологически активных почвах в анаэробных условиях трифлоксистробин быстро разрушается: DT<1,1 дня, DT=2-3 дня.
     
     Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность (LD) для крыс - более 5000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD) для крыс - более 2000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC) для крыс - более 4646 мг/м. Трифлоксистробин не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз кролика, не обладает мутагенными и сенсибилизирующими свойствами.
     
     Трифлоксистробин токсичен для дафний, рыб и водорослей в лабораторном эксперименте.
     
     Гигиенические нормативы:
     
     ПДК в воде водоемов - 0,03 мг/дм;
     
     ОДК в почве- 0,2 мг/кг;
     
     МДУ в яблоках и грушах - 0,1 мг/кг.
     
     Основной метаболит трифлоксистробина: ЦГА 321113.
     
     (Е,Е)-метоксиимино-{2-[1-(3-трифторметилфенил) этилиденамино-оксиметил]-фенил} уксусная кислота (ИЮПАК).
     
     Структурная формула:     
     

               
     Эмпирическая формула: CHFNO.
     
     Молекулярная масса: 394,4.
     
     Белый порошок без запаха.
     
     Другие физико-химические и токсикологические характеристики основного метаболита трифлоксистробина отсутствуют.
     
     В биологически активных почвах в аэробных условиях метаболит ЦГА 321113 достаточно стабилен: DT=110 дней, DT=279 дней.
     
     Область применения препарата. Трифлоксистробин - синтетический фунгицид из класса стробилуринов, являющихся продуцентами гриба Strobilurus tenacellus. Вещество эффективно против широкого круга грибных патогенов хлебных злаков, овощных, кормовых, технических и плодовых культур. Обладает защитным и лечебно-профилактическим действием.
     
     Проходит регистрационные испытания в России и странах СНГ под торговым названием Зато, ВДГ (500 г/кг) в яблоневых и грушевых садах в качестве средства борьбы с возбудителями мучнистой росы, парши, пятнистостей и болезней при хранении с нормой расхода препарата 0,10-0,15 кг/га при 4-6-кратной обработке (до и после цветения) за сезон с 10-14-дневными интервалами.
     
     Трифлоксистробин весьма лабильное вещество и при попадании в воду или почву достаточно быстро гидролизуется с образованием довольно устойчивого соединения - (Е,Е)-метоксиимино-{2-[1-(3-трифторметилфенил)-этилиденамино-оксиметил]фенил}-уксусной кислоты (ЦГА 321113). В яблоках трифлоксистробин разрушается слабо.
          
     

2. Методика определения остаточных количеств трифлоксистробина в воде,
почве, яблоках и его метаболита ЦГА 321113 в воде и почве
газохроматографическим методом

     
2.1. Основные положения  

     
2.1.1. Принцип методики  

     
     Методика основана на газохроматографическом определении трифлоксистробина и его метаболита ЦГА 321113 (в виде метилового эфира) на неподвижной фазе OV-17 с использованием электронзахватного детектора (ДЭЗ) после экстракции препарата из воды гексаном, из почвы и яблок водным ацетоном, а метаболита из подкисленной воды хлористым метиленом и из почвы водным ацетоном при ультразвуковой обработке, предварительной очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, метилирования метаболита диазометаном до трифлоксистробина и окончательной очистки экстрактов на колонке с силикагелем.
     
     Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.
     

2.1.2. Избирательность метода

     
     В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых при возделывании яблоневых садов.
     

2.1.3. Метрологическая характеристика метода  

     
     
Таблица 1

     
Метрологические параметры метода

     
     
2.2. Реактивы, растворы, материалы

     
2.3. Приборы, аппаратура, посуда  

     
2.4. Отбор проб  

     
     Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79).
     
     Отобранные пробы почвы и яблок хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более трех дней. Для длительного хранения пробы почвы доводят до воздушно-сухого состояния и хранят в холодильнике; пробы яблок хранят до анализа в морозильной камере при температуре -18 °С. Пробы воды хранят при температуре не выше 4 °С в течение 3 дней, при температуре -18 °С в течение месяца.
     
     Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, а яблоки измельчают.
     

2.5. Подготовка к определению  

     
2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей  

     
     Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан и хлористый метилен встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока свежая порция кислоты не перестанет окрашиваться. Затем гексан последовательно промывают водой, 2%-м раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.
     
     Этилацетат промывают равным объемом 5%-го раствора двууглекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.
     
     Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 л ацетона 10 г KМnО и 2 г KСО).
     
     Диэтиловый эфир (1 л) предварительно встряхивают с 20 мл свежеприготовленного раствора железного купороса (30 г сульфата железа в 50 мл воды с добавлением 1,5 г концентрированной серной кислоты). Затем диэтиловый эфир последовательно промывают 0,5%-м раствором перманганата калия, 5%-м раствором гидроксида натрия и водой, после чего сушат над хлористым кальцием и перегоняют.
     

2.5.2. Подготовка и кондиционирование колонки  

     
     Готовую насадку /3% OV-17 на Хромосорбе W(HP)/ засыпают в стеклянную колонку, уплотняют под вакуумом, колонку устанавливают в термостат хроматографа, не подсоединяя к детектору, и стабилизируют в токе азота при температуре 250 °С в течение 8-10 ч.
     

2.5.3. Приготовление стандартных растворов  

     
     Основной стандартный раствор трифлоксистробина с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,010 г препарата, содержащего 99,9% д.в., в толуоле в мерной колбе на 100 мл. Раствор хранят в холодильнике не более месяца.
     
     Рабочие стандартные растворы с концентрациями 0,025; 0,05; 0,125 и 0,25 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора трифлоксистробина соответствующим последовательным разбавлением толуолом. Рабочие растворы хранят в холодильнике не более 3 дней.
     
     При изучении полноты открывания трифлоксистробина в модельных матрицах используются ацетоновые растворы вещества.
     
     Основной стандартный раствор метаболита ЦГА 321113 с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,010 г препарата, содержащего 99,0% д.в., в ацетоне в мерной колбе на 100 мл. Раствор хранят в холодильнике не более месяца.
     
     Из основного стандартного раствора метаболита готовят разбавлением ацетоном рабочие растворы с концентрациями 0,1; 0,5 и 2,5 мкг/мл, которые хранят в холодильнике не более 3 дней. Рабочие растворы используются при изучении полноты открывания метаболита в воде и почве. При расчете количества вводимого в матрицу метаболита учитывают соотношение молекулярных масс ЦГА 321113 и трифлоксистробина.
     

2.5.4. Построение калибровочного графика  

     
     Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа вводят по 2 мкл рабочего стандартного раствора трифлоксистробина с концентрацией 0,025, 0,05, 0,125 и 0,25 мкг/мл. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение высоты хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости высоты хроматографического пика в мм от концентрации трифлоксистробина в растворе в мкг/мл.
     

2.5.5. Приготовление раствора диазометана в эфире  

     
     В круглодонной колбе на 100 мл растворяют 5 г N-Метил-N-нитрозо-п-толуолсульфонамида в 16 мл смеси диэтилового эфира и метанола (1:1). Колбу присоединяют к холодильнику, нижний конец которого снабжен алонжем с отводом, проходящим через резиновую пробку с отводом и погруженным в слой эфира (40 мл) на дне приемника. Приемник охлаждают смесью льда и соли. В капельницу помещают 15 мл 50%-го раствора едкого калия.
     
     Реакцию начинают добавлением в реакционный сосуд раствора едкого калия по каплям, избегая бурного вскипания реакционной массы. Об окончании реакции судят по прекращению выделения диазометана в диэтиловый эфир.
     

2.5.6. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта  

     
     В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1,2 см вставляют тампон из стекловаты, закрывают кран и приливают около 10 мл гексана. Затем в колонку вносят суспензию 5 г силикагеля в 20 мл гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают последовательно 50 мл элюента N 2 и 30 мл элюента N 1 со скоростью 1-2 капли в секунду, после чего она готова к работе.
     

2.5.7. Проверка хроматографического поведения трифлоксистробина на колонке с силикагелем  

     
     В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора трифлоксистробина с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 3 мл элюента N 1 и наносят на колонку. Промывают колонку 50 мл элюента N 1, затем 70 мл элюента N 2 со скоростью 1-2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл толуола и анализируют на содержание трифлоксистробина по п.2.7.
     
     Фракции, содержащие трифлоксистробин, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 4 мл толуола и вновь анализируют по п.2.7. Рассчитывают содержание трифлоксистробина в элюате, определяют полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для очистки экстракта объем элюента.
     
     Примечание. Профиль вымывания трифлоксистробина может меняться при использовании новой порции сорбента и растворителей.
          
     

2.6. Описание определения  

     
2.6.1. Экстракция трифлоксистробина и метаболита ЦГА 321113 и очистка экстракта  

     
     2.6.1.1. Вода. В делительную воронку емкостью 250 мл помещают 100 мл предварительно отфильтрованной воды. Добавляют 20 мл гексана и встряхивают 1 мин. Верхний органический слой отделяют, собирая в грушевидную колбу на 100 мл. Водную фазу экстрагируют гексаном еще дважды порциями по 20 мл. Объединенную органическую фазу пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают на роторном вакуумном испарителе досуха при температуре 30 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п.2.6.3.
     
     Водную фазу, оставшуюся после экстракции гексаном, переносят в делительную воронку емкостью 250 мл, подкисляют 1 н НС1 до рН 2 и трижды экстрагируют хлористым метиленом порциями по 20 мл. Объединенную органическую фазу, содержащую метаболит трифлоксистробина, пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают небольшими порциями в 20-мл грушевидной колбе на роторном вакуумном испарителе досуха при температуре 30 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п.п.2.6.2 и 2.6.3.
     
     2.6.1.2. Яблоки. К навеске (25 г) измельченного материала добавляют 100 мл смеси ацетон-вода (2:1, по объему), гомогенизируют 3 мин при 10000 об./мин и суспензию перемешивают в течение 20 мин на аппарате для встряхивания. Добавляют 2 г целита и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу на 250 мл. Осадок на фильтре промывают 50 мл смеси ацетон-вода (2:1, по объему). Из объединенного экстракта отбирают аликвоту раствора (около 15 мл), эквивалентную 2,5 г растительного материала, и упаривают ее до водной фазы на роторном вакуумном испарителе при температуре 40 °С. Водный остаток переносят в делительную воронку емкостью 100 мл, приливают 10 мл насыщенного раствора хлорида натрия и 15 мл гексана. Смесь встряхивают в течение 1 мин и после ее расслоения отделяют гексановый слой, который пропускают через стеклянный фильтр, заполненный безводным сульфатом натрия, в грушевидную колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию водной фракции гексаном повторяют еще два раза (по 15 мл). Объединенный гексановый экстракт, содержащий трифлоксистробин, выпаривают на роторном испарителе досуха при температуре 30 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п.2.6.3.
     
     2.6.1.3. Почва. Навеску (25 г) воздушно-сухой почвы помещают в коническую колбу емкостью 250 мл, приливают 100 мл смеси ацетон-вода (2:1, по объему) и помещают в ультразвуковую баню на 5 мин. К суспензии добавляют 2 г целита и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Осадок на фильтре промывают 50 мл смеси ацетон-вода (2:1, по объему). Из объединенного экстракта отбирают аликвоту раствора (около 27 мл), эквивалентную 5 г почвы, и упаривают ее до водной фазы на роторном вакуумном испарителе при температуре 40 °С. Водный остаток переносят в делительную воронку емкостью 100 мл, приливают 15 мл бидистиллированной воды и 15 мл гексана. Смесь встряхивают в течение 1 мин и после ее расслоения отделяют гексановую фракцию, которую пропускают через стеклянный фильтр, заполненный безводным сульфатом натрия, в грушевидную колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию водной фракции гексаном повторяют еще два раза (по 15 мл). Объединенный гексановый экстракт, содержащий трифлоксистробин, выпаривают на роторном испарителе досуха при температуре 30 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п.2.6.3.
     
     Оставшуюся после обработки гексаном водную фазу подкисляют 1 н НС1 до рН 2 и переносят в делительную воронку емкостью 100 мл. Приливают 10 мл хлористого метилена и воронку встряхивают в течение 1 мин. После разделения слоев отделяют дихлорметановую фракцию, которую пропускают через стеклянный фильтр, заполненный безводным сульфатом натрия, в грушевидную колбу вместимостью 20 мл. Экстракцию водной фракции хлористым метиленом повторяют еще два раза (10+10 мл). Объединенный дихлорметановый экстракт, содержащий метаболит ЦГА 321113, выпаривают на роторном испарителе досуха при температуре 30 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п.п.2.6.2 и 2.6.3.
     

2.6.2. Метилирование  

     
     К сухим остаткам водного (из п.2.6.1.1) и почвенного (из п.2.6.1.3) экстрактов, содержащим метаболит ЦГА 321113, приливают соответственно 2 и 3 мл эфирного раствора диазометана (из п.2.5.5), перемешивают, закрывают колбочки пробками и оставляют стоять в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем растворы упаривают досуха током воздуха.
     

2.6.3. Очистка на колонке с силикагелем  

     
     Остаток в колбе, полученный при упаривании экстрактов воды, растительного материала и почвы (из п.п.2.6.1.1, 2.6.1.2 и 2.6.1.3) или метилированных по п.2.6.2 экстрактов воды и почвы, количественно переносят тремя 1-мл порциями элюента N 1 в подготовленную хроматографическую колонку (п.2.5.6). Промывают колонку 40 мл элюента N 1, которые отбрасывают. Трифлоксистробин элюируют 60 мл элюента N 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С. Сухие остатки экстрактов воды, почвы и яблок растворяют в 2 мл толуола и анализируют по п.2.7.
     

2.7. Условия хроматографирования  

     
     Каждую анализируемую пробу вводят 3 раза и вычисляют среднюю высоту пика.
     
     Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,25 мкг/мл, разбавляют толуолом.
     

2.8. Обработка результатов анализа  

     
     Содержание трифлоксистробина рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:
     

,

     
где  - содержание трифлоксистробина в пробе, мг/кг или мг/дм;

      - высота пика образца, мм;
     
      - высота пика стандарта, мм;
     
      - концентрация стандартного раствора трифлоксистробина, мкг/мл;
     
      - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;
     
      - объем или масса анализируемой части образца, мл или г (для воды - 100 мл; для яблок - 2,5 г; для почвы - 5 г).
     
     Содержание метаболита ЦГА 321113 рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:
     

,

     
где  - содержание ЦГА 321113 в пробе, мг/кг или мг/дм;
     
      - высота пика образца, мм;
     
      - высота пика стандарта, мм;
     
      - концентрация стандартного раствора трифлоксистробина, мкг/мл;
     
      - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;
     
      - объем (мл) или масса (г) анализируемой части образца (для воды - 100 мл; для почвы - 5 г).
     
      - коэффициент пересчета, учитывающий соотношение молекулярных масс трифлоксистробина и ЦГА 321113, равный 1,035.
          
     

3. Требования техники безопасности

     
     Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами.
     
          

4. Контроль погрешности измерений

     
     Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95 "ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа".
          
     

5. Разработчики

     
     Павлова Н.Н., н.с., канд. биол. н.; Талалакина Т.Н., н.с., Чканикова Е.В., н.с., канд. мед. н.; Макеев А.М., зав. лаб., канд. биол. н. ВНИИ фитопатологии, 143050 Московская обл., п/о Большие Вяземы.
     
     
     
Текст документа сверен по:
официальное издание
Определение остаточных количеств
пестицидов в пищевых продуктах,
сельскохозяйственном сырье и объектах
окружающей среды: Сборник методических указаний.
Выпуск 2. Часть 5. -
М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии
Роспотребнадзора, 2006