МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
ПО КОЛИЧЕСТВЕННОМУ КОНТРОЛЮ ЗА СОДЕРЖАНИЕМ АФЛАТОКСИНОВ
В ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

     
     
     РАЗРАБОТАНЫ под руководством академика АМН СССР Т.Ш.Шарманова в лаборатории санитарно-пищевой микологии Казахского филиала Института питания АМН СССР (руководитель лаборатории, кандидат медицинских наук П.С.Ников, старший научный сотрудник, кандидат биологических наук А.С.Бухарбаева, младший научный сотрудник М.С.Парзян, младший научный сотрудник Д.М.Божко, младший научный сотрудник А.М.Баимбетова, младший научный сотрудник Б.Т.Меербекова, младший научный сотрудник Е.А.Изатуллаев).
     
     УТВЕРЖДЕНЫ Заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 11 октября 1985 г. N 3942-85
     
     
     В ряду микотоксинов особый интерес ученых и врачей вызывают афлатоксины - сильнейшие среди известных канцерогенов биологического происхождения с ярко выраженной гепатотропностыю. По химической структуре они относятся к производным кумарина, представляют собой белые кристаллические вещества, довольно устойчивые к действию термического фактора, мало разрушающиеся в процессе кулинарной обработки пищевых продуктов, пастеризации и воздействия других технологических условий. Наибольшее санитарно-гигиеническое значение в силу особой биологической активности и широкой распространенности имеет афлатоксин . Другие основные афлатоксины менее токсичны, реже и в меньших концентрациях загрязняют пищевые продукты. Афлатоксин , обладающий примерно такой же активностью, как и афлатоксин , является метаболитом последнего и обнаруживается в молоке и других продуктах животного происхождения.
     
     Основными продуцентами афлатоксинов являются грибы Аsрегgillus flavus, A. parasiticus, распространенные в мире повсеместно. Эти грибы и их метаболиты могут загрязнять все известные пищевые продукты как растительного, так и животного происхождения.
     
     Доказана возможность токсического поражения людей указанными агентами. Установлена четкая зависимость первичного рака печени у населения отдельных регионов мира от наличия и степени загрязненности пищевых продуктов афлатоксинами.
     
     Афлатоксины попадают в продукты животного происхождения первично при скармливании животным загрязненных кормов. Загрязнение ими может происходить и вторично (в процессе неправильного хранения и транспортировки) в результате заражения грибами-продуцентами.
     
     В решении важной задачи профилактики афлатоксикозов особое внимание должно быть уделено разработке мер контроля и предупреждения загрязнения пищевых продуктов этими агентами.
     
     В 1981 г. Министерством здравоохранения СССР утверждены новые "Методические рекомендации по обнаружению, идентификации и определению содержания афлатоксинов в пищевых продуктах", разработанные Институтом питания АМН СССР (В.А.Тутельян, К.И.Эллер и др.), в которых излагается методика применительно к пищевым продуктам растительного происхождения, а также к молочным продуктам. В них ПДК афлатоксина В для растительных и животных продуктов установлена на уровне 5 мкг/кг, а ПДК афлатоксина  (для молока и молочных продуктов - 0,5 мкг/кг (при недопущении содержания в них афлатоксина  в пределах чувствительности метода - 0,5 мкг/кг).
     
     В настоящих рекомендациях представлена методика контроля за содержанием афлатоксинов , , а также ,  и  в продуктах животного происхождения (мясо, печень, почки, легкие, колбасы, консервы и др.), она может быть использована и для определения указанных токсинов в биологических средах организма (кровь, желчь, моча и др.). Методика основана на тонкослойно-хроматографическом разделении афлатоксинов и оценке последующего характера и интенсивности их флуоресценции в длиноволновом ультрафиолетовом (УФ) свете. Для афлатоксинов  и  характерно сине-фиолетовое свечение на пластине "Силуфол" с максимумом эмиссии при 430 нм. Предел обнаружения предлагаемой методики 0,5 мкг/кг. Относительное стандартное отклонение составляет 0,3-0,5.
     
     Основные достоинства методики состоят в том, что она позволяет осуществлять контроль за содержанием афлатоксинов в продуктах животного происхождения. В методике используется хроматографическая пластина для одновременного определения афлатоксинов в ряде исследуемых образцов продуктов (до 12). Продолжительность анализа при использовании ротационного испарителя составляет 4 часа. Предлагаемая модификация позволяет также существенно экономить дорогостоящие материалы и реактивы (пластины "Силуфол", стандартные афлатоксины и др.).
     
     Методические рекомендации предназначены для гигиенических институтов и лабораторий, занимающихся определением афлатоксинов в продуктах животного происхождения и биологических жидкостях (в крови, желчи, моче и др.).
     
     

МЕТОДИКА АНАЛИЗА

     
     Включает следующие этапы:
     
     1. Отбор проб и приготовление образцов.
     
     2. Экстракция и очистка
     
     3. Тонкослойная хроматография
     
     4. Обнаружение и количественное определение
     
     

ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ

     
     1. Весы технические по ГОСТ 19491-74
     
     2. Аппарат для встряхивания жидкостей АВУ-6С по ТУ 264-1-2451-78
     
     3. Микроразмельчитель тканей (тип РТ-2), Одесский экспериментальный завод "ЭМА"
     
     4. Баня водяная с электронагревателем МРТУ 42-886-63
     
     5. Лабораторный автотрансформатор (ЛАТР)
     
     6. Мясорубка
     
     7. Стеклянная четырехугольная камера для тонкослойной хроматографии (240х210х100 мм) с притертой крышкой завода "Дружная горка", ст.Сиверская, Ленинградской области
     
     8. Прибор для флуоресцентного анализа витаминов в растворе (модель 833 МРТУ 64-1-1080-63 или аппарат ВИО-1 с фильтром УФС-6)
     
     9. Насос водоструйный лабораторный стеклянный по ГОСТ 10696-75
     
     10. Ротационный испаритель по ТУ 25-11-917-76 (завод "Химлабприбор")
     
     11. Распылитель стеклянный c грушей
     
     12. Термометр 0-100°
     
     13. Воронка Бюхнера
     
     14. Колонка хроматографическая (300х20 мм), снабженная на выходе пористым стеклянным фильтром и краном
     
     15. Колба Бунзена на 500 мл
     
     16. Пипетка Пастера
     
     17. Микрошприц МШ-10
     
     18. Цилиндры 2-50, 2-100, 2-250, 2-500 по ГОСТ 1770-74
     
     19. Чашка фарфоровая на 300 мл
     
     20. Воронки стеклянные с диаметром 75 мм по ГОСТ 8613-75
     
     21. Колбы плоскодонные конические на 250, 500 мл
     
     22. Колбы мерные 2-20, 2-100, 2-250 по ГОСТ 1777-74
     
     23. Делительные воронки на 500 мл по ГОСТ 8613-75
     
     24. Ножницы
     
     25. Бумага фильтровальная (мягкая, для грубых осадков)
     
     26. Пластины для ТСХ "Силуфол" 15х15 см (ЧССР)
     
     27. Пипетки измерительные на 0,2, 5, 10 мл по ГОСТ 20292-74Е
     
     28. Силикагель ЛСЛ 100-250 мкм (ЧССР)
     
     29. Колба круглодонная коническая на 500 мл
     
     30. Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166-76
     
     31. Хлороформ медицинский или по ГОСТ 3160-51
     
     32. Гексан по ТУ 6-09-3375-74
     
     33. Метиловый спирт по ГОСТ 6995-77
     
     34. Вода дистиллированная
     
     35. Натрий хлористый по ГОСТ 4233-77
     
     36. Лимонная кислота по ГОСТ 3652-69
     
     37. Свинец уксуснокислый по ГОСТ 1027-67
     
     38. Сернокислый аммоний по ГОСТ 3769-78
     
     39. Бензол для криоскопии или по ГОСТ 5955-75
     
     40. Ацетонитрил по ТУ 6-09-3534-74
     
     41. Эфир диэтиловый медицинский по ГОСТ 6265-74
     
     42. Иод кристаллический по ГОСТ 4159-79
     
     43. Уксусная кислота (ледяная) по ГОСТ 61-75
     
     44. Азотная кислота по ГОСТ 4461-77
     
     45. Трифторуксусная кислота по МРТУ 6-09-4769-61
     
     46. Ацетон по ГОСТ 2603-79
     
     

НЕКОТОРЫЕ ОБЩИЕ УСЛОВИЯ И ФАКТОРЫ,
ВЛИЯЮЩИЕ НА РЕЗУЛЬТАТЫ АНАЛИЗА

     
     Ряд факторов могут влиять на результат анализа. К ним относится чистота растворителей и посуды, тщательность калибровки и соблюдение условий хранения, характер освещенности в лабораторной комнате и другие.
     
     Для получения точных результатов необходимо использовать органические растворители и реактивы самой высокой чистоты. Растворители, длительное время хранившиеся в пластмассовых емкостях, нельзя использовать в анализе ввиду возможности их загрязнения.
     
     Посуда, находившаяся в контакте с афлатоксинами, подлежит тщательной обработке путем погружения на 12 часов в специальный деконтаминационный раствор следующего состава: 2,5 кг NаОН, 1 кг хлорамина, 100 г стирального порошка, 50 л воды. После такой деконтаминации посуду моют общепринятым способом.
     
     

ОТБОР ПРОБ И ПРИГОТОВЛЕНИЕ ОБРАЗЦОВ

     
     Отбор проб продуктов животного происхождения рекомендуется проводить с использованием действующей в настоящее время нормативно-технической документации на конкретный вид продукта. При определении количества отбираемого образца нужно учитывать особенности каждого продукта. Свежее мясо, субпродукты (печень, почки и др.), колбасы и другие готовые изделия из мяса рекомендуется брать в количестве 50 г, молоко, кефир и другие жидкие молочные продукты - 50 мл, сухое молоко - 5 г (растворить в 45 мл воды), плотные молочные продукты - 50 г. Пробы подлежат немедленному анализу с целью получения данных, точно характеризующих партии продукта в момент контроля.
     
     Указанные навески мяса, мясных изделий, других плотных продуктов разрезают ножом или ножницами на мелкие кусочки, дважды пропускают через мясорубку, затем тщательно гомогенизируют в размельчителе тканей в 40 мл насыщенного раствора лимоннокислого натрия.* Для молока, жидких продуктов и биологических сред процесс размельчения исключается.
__________________
     * Готовят следующим образом: в 100 мл дистиллированной воды растворяют 40 г NaСl и 4,8 г лимонной кислоты, перемешивают, подогревая.
     
     

ЭКСТРАКЦИЯ И ОЧИСТКА

     
     Гомогенат переносят в 500 мл колбу, добавляют 150 мл охлажденного метанола, встряхивают 30 минут. Затем смесь фильтруют через бюхнеровскую воронку с широкопористой фильтровальной бумагой в колбу Бунзена на 500 мл под вакуумом. Фильтр с осадком осторожно переносят обратно в 500 мл колбу, заливают 60 мл водяного метанола*, встряхивают 15 минут и фильтруют. 150 мл объединенного фильтрата переносят в 500 мл колбу, добавляют 10 мл раствора ацетата свинца**, 5 г сульфата аммония в 75 мл воды, тщательно перемешивают и помещают в водяную баню при 50 °С на 15 минут. После встряхивания в течение 20 минут смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр в 250 мл градуированный цилиндр и 160 мл фильтрата переносят в 500 мл делительную воронку. К фильтрату добавляют 50 мл гексана или петролейного эфира, встряхивают 1 минуту и, после разделения, нижний водно-метаноловый слой переливают в другую делительную воронку на 500 мл. Процедуру повторяют дважды. Затем добавляют 50 мл хлороформа, встряхивают одну минуту и, после разделения, нижний хлороформенный слой сливают в круглодонную колбу с притертой пробкой на 500 мл. Процедуру повторяют трижды. Объединенные хлороформенные экстракты концентрируют в чашке на водяной бане при 60-61 °С или ротационном испарителе при 40 °С до объема около 5 мл.
_____________________
     * Раствор содержит на 100 мл: 50 мл метанола и 50 мл насыщенного раствора лимоннокислого натрия.
     
     ** В 1 л воды содержится 150 г уксуснокислого свинца.
     
     

КОЛОНОЧНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

     
     В хроматографическую колонку на стеклянный фильтр насыпают 5 г безводного сульфата натрия. На образовавшийся слой наливают суспензию силикагеля*. После осаждения в колонку осторожно насыпают еще 5 г безводного сульфата натрия. Избыток хлороформа выпускают при помощи крана и сразу же медленно наносят образец. Стенки флакона обмывают двумя 5 мл порциями хлороформа, которые также переносят в колонку. По достижении уровнем раствора образца поверхности верхнего слоя сульфата натрия в колонку порциями осторожно наливают 100 мл смеси хлороформ-метанол (97:3). Элюат собирают в 300 мл фарфоровую чашку или круглодонную колбу, концентрируют на водяной бане в чашке при 60-61 °С или ротационном испарителе при 40 °С до объема 1,5-2,0 мл. Концентрированный раствор переносят в центрифужную пробирку на 10 мл. Остатки смывают со стенок чашки или колбы 3 порциями хлороформа по 2 мл каждая. Объединенный экстракт в пробирке выпаривают досуха**.
_________________
     * Готовится из 10 г силикагеля (100-250 мкн) на 20 мл хлороформа.
     
     ** Выпаривание лучше проводить в токе азота с использованием пастеровского капиляра, погруженного в экстракт.
     
     Остаток на дне и стенках пробирки тщательно растворяют в 0,2 мл хлороформа* и тут же подвергают хроматографии в тонком слое сорбента.
_________________
     * Пробирку плотно закрывают пробкой для предупреждения выпаривания растворителя.
     
     

ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

     
     1. Подготовка аналитической хроматографической пластины (АХП).
     
     На пластине ''Силуфол" (15х15 см или 20х20 см) при помощи острого тонкого предмета (иглы, скальпеля и др.) и линейки проводят четкие параллельные линии, делящие слой сорбента на хроматографические дорожки шириной 0,8 см с промежутками между ними 0,2 см. На одной из сторон пластины (край А), соответственно указанным дорожкам, простым карандашом наносят номера исследуемых образцов. На расстоянии 4 см от края противоположной стороны (край Б) и параллельно ему в промежутках между хроматографическими дорожками наносят карандашом пунктирную линию, обозначающую уровень нанесения образцов (линия старта). Приготовленные таким образом пластины должны быть сухими, для чего их следует хранить в условиях, предупреждающих увлажнение.
     
     2. Нанесение образцов на АХП.
     
     Для достижения необходимой точности образцы объемом 20 мкл наносят на хроматографические дорожки с помощью микрошприца. При этом размеры образующихся пятен не должны превышать 3 мм в диаметре. Стандартные афлатоксины наносят на крайние хроматографические дорожки последними.
     
     3. Проявление АХП включает два последовательных этапа: обезжиривание эфиром и разделение афлатоксинов.
     
     Для обезжиривания пластину с нанесенными образцами краем А опускают в камеру с эфиром, толщина слоя которого не превышает 1 см. Используемый эфир должен быть очищен от перекисей на колонке с окисью алюминия. Предварительно камера должна быть насыщена парами эфира, что достигается путем выстилания всей площади ее задней и боковых стенок фильтровальной бумагой и последующей герметизацией в течение 20-30 минут тщательно притертой стеклянной крышкой. Пластина находится в закрытой камере до момента, когда фронт растворителя достигнет уровня 0,5 см ниже края В, после чего ее извлекают и высушивают на открытом воздухе. Процесс обезжиривания повторяют трижды. Затем край В пластины с концентрированной на нем полосой примесей обрезают, отступя 1,5 см от линии старта (пунктирной линии), и удаляют.
     
     Для разделения афлатоксинов пластину стартовым краем опускают в ненасыщенную камеру со смесью растворителей хлороформ-ацетон (9:1). Погружение пластины следует проводить быстро, но осторожно, без нарушения глади поверхности смеси, чтобы предотвратить смывание пятен афлатоксинов. Пластину оставляют в камере до момента достижения фронтом растворителя противоположного края, после чего ее извлекают и высушивают на воздухе.
     
     

ОБНАРУЖЕНИЕ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АФЛАТОКСИНОВ

     
     Проявленную хроматограмму рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Обнаружение на пластине пятен, соответствующих хроматографической подвижностью и цветом флуоресценции пятнам стандартов, свидетельствует о возможном присутствии афлатоксинов в образцах пищевых продуктов. Хроматографическая характеристика основных афлатоксинов представлена в таблице 1 (Приложение).
     
     Для исключения афлатоксиноподобных веществ рекомендуется использовать 3 дополнительных теста.
     
     Иодный тест. Проявленную хроматограмму помещают на 30 секунд в эксикатор, насыщенный парами иода*. Затем пластину рассматривают под УФ-светом. Изменение цвета и интенсивности флуоресценции говорит об отсутствии в образце афлатоксинов.
______________
     * Для насыщения на дно эксикатора насыпают 2-3 г кристаллического иода.
     
     Тест с азотной кислотой. Проявленную хроматограмму опрыскивают водным раствором азотной кислоты (2:1) и рассматривают под УФ-светом. При этом свечение пятен стандартов меняется на желтый. Если таким же образом меняется свечение пятен образцов, то это в большинстве случаев указывает на содержание в них афлатоксинов.
     
     Тест с трифторуксусной кислотой.* На соответствующие дорожки в точки нанесения конечных экстрактов исследуемых образцов и растворов стандартного афлатоксина осторожно наносят по 1 капле концентрированного раствора трифторуксусной кислоты. Затем пластину помещают в темное место на 10-15 минут, после чего проводят этап проявления по описанному выше способу. При наличии в экстрактах афлатоксинов появляется дополнительное свечение с уменьшенным .
_______________
     * Достаточно специфичен, основан на переводе афлатоксинов в полуацетальные формы.
     
     Количественное определение проводят путем сравнения интенсивности флуоресценции пятен афлатоксинов в экстрактах с интенсивностью флуоресценции различных количеств стандартов афлатоксинов, нанесенных на ту же пластину.
     
     Расчет концентрации афлатоксина в продукте следует вести по формуле:
     

,

где  - концентрация афлатоксина в мкг/кг или мкг/л
     
      - объем водно-метаноловой смеси в мл
     
     (для свежего мяса и субпродуктов - 232
     
     для готовых мясных изделий - 200
     
     для молока и жидких молочных продуктов - 250
     
     для плотных молочных продуктов - 200)
     
      - объем водно-метанолового фильтрата, предназначенного для дальнейшего анализа в мл (150)
     
      - объем водно-метанолового фильтрата и раствора уксуснокислого свинца в мл (235)
     
      - объем водно-метанолового фильтрата после обработки уксуснокислым свинцом и сульфатом аммония в мл (160)
     
      - объем очищенного раствора экстракта в хлороформе перед тонкослойной хроматографией в мкл (100)
     
      - объем раствора экстракта, наносимого на пластину в мкл (20)
     
      - навеска или объем продукта, взятого для анализа, в г или мл
     
      - количество афлатоксина в пятне образца АХП в нг
     
     При строгом соблюдении объемно-весовых отношений, указанных в приведенной формуле, последнюю можно упростить путем введения коэффициента, учитывающего вес или объем исследуемого образца и динамику его аликвот в процессе анализа. В таком случае формула приобретает следующий вид:
     

,

     
где  - коэффициент, имеющий значение
     
     для свежего мяса и субпродуктов - 0,227
     
     для готовых мясных изделий - 0,195
     
     для молока, жидких продуктов и биологических сред - 0,224
     
     для плотных молочных продуктов - 0,195
     

Приготовление эталонного раствора из кристаллического афлатоксина  

     
     1 мг кристаллического афлатоксина  помещают в мерную колбу на 100 мл и добавляют смесь бензол-ацетонитрил (98:2) до метки. 1 мл такого эталонного раствора, содержащего 10 мкг афлатоксина переносят во флакон на 20 мл и полностью выпаривают растворители. Затем добавляют 20 мл вышеуказанной смеси и закрывают флакон пpитepтой пробкой. В 1 мкл полученного раствора содержится 0,5 нг афлатоксина .
     

Приготовление эталонного раствора из кристаллического афлатоксина  

     
     Афлатоксин  выпускается обычно в ампулах, содержащих 10 мкг кристаллического препарата. Ампулу вскрывают, содержимое растворяют в 2 мл смеси бензол-ацетонитрил (98:2) и переносят в мерную колбу на 20 мл. Ампулу промывают трижды 3-х мл порциями бензол-ацетонитрила и растворы объединяют в той же мерной колбе. Колбу заполняют указанной смесью растворителей до метки 20 мл и закрывают притертой пробкой. Таким образом, в 1 мкл эталонного раствора содержится 0,5 нг афлатоксина .
     
     

ОБЩИЕ УСЛОВИЯ И ПРАВИЛА РАБОТЫ

     
     Афлатоксины - сильные токсические и канцерогенные вещества. Поэтому для работы с ними необходимы определенные условия и строгое соблюдение ряда правил.
     
     Исследования, связанные с афлатоксинами, следует проводить в отдельной комнате или в обычной химической лаборатории, имеющей боксовое отделение или настольный бокс. Афлатоксины следует хранить в местах, недоступных для посторонних (в закрывающихся на замок холодильниках или морозильных камерах, вне работы подлежащих опечатыванию).
     
     Сосуды, в которых содержатся афлатоксины, подлежат обозначению "ЯД" и в целях предупреждения загрязнения рабочего места должны находиться в стаканах или в других емкостях. Рабочее место с той же целью нужно покрыть листом фильтровальной бумаги, которая после работы переносится в герметичный мешок или контейнер для последующего сжигания.
     
     В случае попадания афлатоксинов на лабораторное оборудование и предметы их детоксикацию следует проводить тщательной обработкой 5 или 10% раствором хлорамина, а затем 1% раствором NаНСО.
     
     Работать с афлатоксинами следует в халате, марлевой маске, в клеенчатом фартуке и резиновых перчатках. Перчатки и фартук после работы необходимо обработать раствором хлорамина и тщательно промыть в проточной воде.
     
     В случае попадания афлатоксинов на открытые участки тела, в глаза, на слизистую рта и носа необходимо их немедленно и тщательно смыть 1% раствором борной кислоты, а затем проточной водой.
     
     В лабораторных помещениях, где производится работа с афлатоксинами, запрещается курить, принимать пищу и воду.
     
     

Приложение

     
Таблица 1

Физико-химические характеристики некоторых афлатоксинов

_______________
     * Брак оригинала. - Примечание .   
          
     
     
Текст документа сверен по:
/ Главное санитарно-эпидемиологическое
управление Минздрава СССР. - М.: 1985