почта Моя жизнь помощь регистрация вход
Краснодар:
погода
декабря
1
воскресенье,
Вход в систему
Логин:
Пароль: забыли?

Использовать мою учётную запись:

Курсы

  • USD ЦБ 03.12 30.8099 -0.0387
  • EUR ЦБ 03.12 41.4824 -0.0244

Индексы

  • DJIA 03.12 12019.4 -0.01
  • NASD 03.12 2626.93 0.03
  • RTS 03.12 1545.57 -0.07

  отправить на печать


МУ 4.2.2008-05

    
    
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ


4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ.
ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ

Метод идентификации генно-инженерно-модифицированных организмов (ГМО)
растительного происхождения с применением ферментного анализа
на биологическом микрочипе

    
    
Дата введения: с момента утверждения

    
    
    1. РАЗРАБОТАНЫ ГУ НИИ питания РАМН (В.А.Тутельян - руководитель, Е.Ю.Сорокина, О.Н.Чернышева, Н.А.Кашина); ФГУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора (Т.В.Воронцова, Т.Н.Потапова); Инновационной корпорацией "Биозащита" (И.В.Панкин).
    
    2. РЕКОМЕНДОВАНЫ к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
    
    3. УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Г.Г.Онищенко 17 октября 2005 года.
    
    4. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ
    
    

1. Область применения

    
    1.1. Настоящие методические указания подготовлены для идентификации генно-инженерно-модифицированных организмов (далее - ГМО) растительного происхождения в пищевых продуктах с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе и его последующей обработки на аппаратно-программном комплексе "ДЕГМИГЕН-001".
    
    1.2. Методические указания разработаны в соответствии с Федеральным законом от 30.03.99 N 52-ФЗ (в редакции от 09.05.2005 N 45-ФЗ) "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения", Законом Российской Федерации от 07.02.92 N 2300-I (в редакции от 21.12.2004 N 171-ФЗ) "О защите прав потребителей", постановлением Правительства Российской Федерации от 30.06.2004 N 322 "Об утверждении Положения о Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека", постановлением Правительства Российской Федерации от 15.09.2005 N 569 "О Положении об осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора в Российской Федерации", постановлением Правительства Российской Федерации от 24.07.2000 N 554 (в редакции от 15.09.2005 N 569) "Об утверждении Положения о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании".
    
    1.3. Методические указания предназначены для органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также других испытательных лабораторий, аккредитованных в порядке, установленном Правительством Российской Федерации.
    
    1.4. Методические указания разработаны для одновременного определения в одном лабораторном испытании пяти различных маркеров рекомбинантной ДНК при проведении скрининга с целью выявления ГМО растительного происхождения в пищевых продуктах, в т.ч., в продовольственном сырье.
    
    

2. Общие положения

    
    Методические указания содержат описание метода определения ГМО растительного происхождения в пищевых продуктах с помощью набора реагентов для выявления и идентификации ГМО растительного происхождения с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе. Метод основан на идентификации рекомбинантной ДНК с использованием метода асимметричной мультиплексной полимеразной цепной реакции (далее - амПЦР) и последующей гибридизации продуктов амПЦР с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе. Метод одновременно устанавливает наличие или отсутствие в анализируемой пробе не менее пяти различных рекомбинантных последовательностей ДНК: трех регуляторных (35 S, nos и ocs) и двух селективных (gus, nptll). Идентификация этих последовательностей позволяет проводить предварительную проверку пищевых продуктов на наличие ГМО растительного происхождения. Чувствительность метода не менее 10 г (1пг) ДНК.
    
    

3. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы

    
3.1. Аппаратура и инструменты

    

Амплификатор ДНК типа "Терцик-мс-2" под микроцентрифужные пробирки, вместимостью 0,2; 0,5 см, со скоростью нагрева/охлаждения активного элемента не менее 1,5° С/с


ТУ 9642-001-4648062-98

Комплекс аппаратно-программный для анализа биологических микрочипов типа "ДЕГМИГЕН-001"


ТУ 9443-001-02699501-03

Компьютерная программа "Arra" для анализа изображений, полученных с помощью комплекса "ДЕГМИГЕН-001"



Биологический микрочип с иммобилизованными олигонуклеотидами (прилож.1А)


ТУ 4320-002-71321417-04

Термостат суховоздушный типа ТВ3-25 с рабочей температурой 42 °С, рабочий диапазон от 20 до 60 °С точность поддержания температуры ±1 °С


ТУ 42-61961

Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ±0,0001 г


ГОСТ 24104-01

Термостат типа "TERMO 24-15" под пробирки типа "Эппендорф" вместимостью 0,5 и 1,5 мл, диапазон температур от 15 до 120 °С, количество гнезд - не менее 20 каждого типа, точность поддержания температуры - 0,2 °С, разность температур между соседними ячейками - не более 0,5



Камера морозильная, обеспечивающая температуру минус 20 °С


ГОСТ 26678-85

Холодильник бытовой


ГОСТ 26678-85

Микроцентрифуга настольная типа "Эппендорф" с частотой вращения не менее 13000 мин




Аппарат для встряхивания типа "Вортекс", скорость вращения 250-3000 мин



Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды


ГОСТ 6709-72

Микродозаторы с переменным объемом дозирования: 0,5-10,0 мм (шаг - 0,1 мм, точность ±2,5-10,0%, воспроизводимость 3-7%); 0,5-50,0 мм (шаг - 0,5 мм, точность ±2,0-5,0%, воспроизводимость 2,5-5%); 20,0-200,0 мм (шаг - 1,0 мм, точность ±1,5-2,0%, воспроизводимость 2-3%); 100-1000 мм (шаг - 5 мм, точность ±1,0-1,5%, воспроизводимость 1-2%); 2000-10000 мм (шаг - 10 мм, воспроизводимость 1-2%)



Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 или других видов


ТУ 16-535-84

    
    Примечание. Допускается использование другой аппаратуры и инструментов с аналогичными техническими характеристиками, разрешенных для применения в установленном порядке.
    
    

3.2. Лабораторная посуда и материалы

Бумага фильтровальная лабораторная


ГОСТ 12026-76

Воронки стеклянные


ГОСТ 25336-82

Колбы стеклянные мерные плоскодонные конические, вместимостью 25, 50, 100, 200, 1000 см


ГОСТ 12738-77

Чашки Петри


ГОСТ 25336-82

Цилиндры стеклянные мерные лабораторные, вместимостью 25, 100, 1000 см


ГОСТ 1770-74

Пробирки микроцентрифужные типа "Эппендорф", вместимостью 0,2; 0,5; 1,5 см



Наконечники с фильтром для дозаторов с переменным объемом дозирования до 10; 20; 200; 1000; 10000 мм




3.3. Реактивы и реагенты

Додецилсульфат натрия (SDS)



Натрия гидроокись


ГОСТ 4328-77

Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), хч


ТУ 6-09-11-1721-83

Альбумин бычий сывороточный сухой (БСА). Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N В 4287



Спирт этиловый ректификованный


ГОСТ Р 51652-00

Вода дистиллированная


ГОСТ 6709-72

Вода деионизованная


ОСТ 11.029.003-80

3%-й раствор пероксида водорода



    
    Примечание. Допускается использование других реактивов с аналогичными техническими характеристиками; препараты импортного производства должны иметь международный сертификат качества ИСО 9 000 или EN 29 000.
    
    

Набор реагентов для выявления и идентификации ГМО растительного происхождения на биологическом микрочипе состоит из набора для выделения ДНК, набора для проведения амПЦР и набора для ДНК гибридизации и ферментного анализа. Наборы рассчитаны на 100 реакций



Набор реагентов для пробоподготовки (бисер - 30 г, лизирующий реагент - 60 см (2 флакона), сорбент - 2 см (2 пробирки), солевой буфер (10-кратный) - 10 см, экстракционный раствор - 10 см)


ТУ 2643-003-71321417-04

    
    Порядок приготовления рабочего раствора солевого буфера описан в п.4.1. Остальные реагенты готовы к использованию.
    

Набор реагентов для амПЦР (включает в себя: сухие смеси реагентов (100 пробирок, каждая пробирка содержит Taq ДНК полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты и хлорид магния с конечными концентрациями, соответственно, 1 ед, 200 мкМ и 2,5 мМ, а также оптимизированную буферную систему для проведения одной стандартной ПЦР); растворитель; минеральное масло; "+" контроль амплификации - 1 пробирка, 0,5 см , праймеры на 35S-промотор вируса мозаики цветной капусты:



ТУ 2643-003-71321417-04

35S_п 5' CGG CTA CTC CAA GAA TAT CAA AGA TAC AGT TTC AGA AGA


(39 н.о.);

35S_o* 5' ССА ТТТ ТСС ТTT ТTT АТТ GTC СТТ TCG ATG AAG TGA CAG А


(40 н.о.);

праймеры на маркерный ген gus из бактерии Escherichia coli:



gus_ 5' ACC GTA CCT CGC АТТ АСС СТТ ACG СТG AAG AGA


(33 н.о.);

gus_o* 5' TGC CCG CTT CGA AAC CAA TGC CTA AAG AGA


(30 н.о.);

праймеры на терминатор nos из агробактерии Agrobacterium tumefaciens:



nos_п 5' GGA CAA GCC GTT TTA CGT TTG GAA CTG АСА GA


(32 н.о.);

nos_o* 5' GCC TGA CGT ATG TGC TTA GCT CAT TAA ACT ССА GA


(35 н.о.);

праймеры на маркерный ген nptll из транспазона Tn5 бактериального происхождения:



npt_п 5' GTG ACC CAT GGC GAT GCC TGC TTG С


(25 н.о.);

npt_o* 5' ACC CAG CCG GCC АСА GTC GAT GAA ТСС AGA


(30 н.о.);

праймеры на промотор ocs из агробактерии Agrobacterium tumefaciens:




ocs_п 5' AAA AAG TGG CAG AAC CGG TCA AAC CTA AAA GA


(32 н.о.);

ocs_o* 5' CGT TAT TAG TTC GCC GCT CGG TGT GTC GTA GA


(32 н.о.).

    
    Праймеры расфасованы в 10 пробирках по 0,5 см.
    
    Примечание: 35S_п; gus_п; nos_п; nptll_п; ocs_п - обозначают прямые праймеры; 35S_o*; gus_o*; nos_o*; nptll_o*; ocs_o* - обозначают обратные праймеры меченные биотином; н.о. - нуклеотидные остатки.
    
    

Набор реагентов для ДНК гибридизации и ферментного анализа: 20хSSC - 50 см; диаминобензидин (ДАБ) - 100 таблеток; конъюгат пероксидазы хрена со стрептавидином - 0,1 см с концентрацией 1 мг/см, 1 пробирка


ТУ 2643-003-71321417-04

    
    Примечание. Срок годности набора реагентов - 12 месяцев со дня изготовления. Основную часть реагентов, упакованную в картонную коробку, хранят в сухом темном месте при температуре от 2 до 8 °С. В отдельных пластиковых пакетах при температуре -20 °С хранят праймеры, положительный контроль и конъюгат стрептавидин-пероксидазы.
    
    

4. Подготовка к анализу. Приготовление растворов


4.1. Приготовление 0,5 М ЭДТА (рН 8,0)

    

    В мерной колбе на 100 см растворить 18,62 г этилендиаминтетрауксусной кислоты (молекулярный вес 372,2) в 80 см дистиллированной воды. Раствором 30%-й гидроокиси довести рН раствора до 8,0 дистиллированной водой - объем раствора до метки, перемешать. Хранить в колбе с притертой пробкой при комнатной температуре до года.
         

4.2. Приготовление 10%-го раствора SDS

    
    Растворить 10 г SDS в 90 см дистиллированной воды. Хранить при комнатной температуре не более 1 года.
              

4.3. Приготовление рабочего раствора солевого буфера

    
    Содержимое флакона с 10-кратным солевым буфером (10 см) (из набора реагентов) перенести из флакона в цилиндр, довести бидистиллированной водой до отметки 100 см и 96%-м этиловым спиртом до отметки 300 см и перемешать. Рабочий раствор солевого буфера следует хранить в герметично закрытой посуде при температуре 4 °С.
    
    

5. Отбор и подготовка проб пищевых продуктов для анализа

    
    Отбор проб проводят по государственным стандартам, устанавливающим порядок отбора проб для однородных групп пищевой продукции: ГОСТ 5904-82, 9163-90, 12292-00, 10852-86, 12430-66, 13979-86, 26313-84, 22617.0-77, 27668-88, 26312-84, 9792-73, 7631-85, 12036-85, 51447-99*, 135869.3-86*, 13440-89*, 17109-88, 19341-73, 26809-86, 27668-88, 27853-88, 28741-90, 29142-91, 13634-90, 15877-70, 17110-71, 17109-88, ГОСТ Р 50436-92, 50437-92, 51926-02, ГОСТ Р ИСО 2170-97.
_______________
    * Соответствует оригиналу. - Примечание .
         
    

6. Проведение анализа. Выделение ДНК

    
    6.1. В одноразовые центрифужные пробирки типа "Эппендорф" на 1,5 см внести 300 мг бисера и 70-80 мг анализируемого материала. Добавить 0,5 мл 5 мМ Na-соль ЭДТА и термостатировать при 65 °С в течение 30-60 мин. Время инкубации составляет 30 мин для процессированных продуктов (мука, чипсы, детское питание и др.) и до 60 мин для зерна. Через каждые 10-15 мин гомогенизировать пробу срезанным наконечником (для каждой пробы использовать индивидуальный наконечник).
    
    6.2. К содержимому пробирки добавить 400 мм лизирующего реагента из набора реагентов и перемешать на вортексе до максимально однородного состояния. Пробу термостатировать при 65 °С 60-120 мин.
    
    6.3. После термостатирования пробу, при необходимости, еще раз гомогенизировать, добавить 500 мм бидистиллированной воды и перемешать на вортексе.
    
    6.4. Центрифугировать пробу 1 мин при 5000 g (12000 об./мин). Прозрачный супернатант перенести в чистую пробирку.
    
    6.5. Добавить 20 мм сорбента из набора реагентов (перед использованием сорбент следует интенсивно встряхнуть на вортексе). Пробирку поместить на ротатор и перемешивать на вортексе 10 мин (10-20 об./мин).
    
    6.6. Центрифугировать пробу 10 с при 5000 g.
    
    6.7. Осторожно, не задевая осадка, удалить супернатант. К осадку добавить 200 мм лизирующего реагента из набора реагентов и перемешать на вортексе до однородного состояния. Центрифугировать пробу 10 с при 5000 g.
    
    6.8. Удалить супернатант. К осадку добавить 1 см рабочего раствора солевого буфера из набора реагентов, перемешать содержимое пробирки переворачиванием 5-10 раз. Центрифугировать пробу 10 с при 5000 g.
    
    6.9. Удалить супернатант, не задевая осадка.
    
    6.10. К осадку добавить 1 см рабочего раствора солевого буфера, перемешать на вортексе, центрифугировать пробу 10 с при 5000 g и осторожно удалить супернатант.
    
    6.11. Повторить предыдущий пункт еще раз.
    
    6.12. Подсушить осадок при 65 °С в течение 4-5 мин.
    
    6.13. К осадку добавить 50 мм экстракционного раствора из набора реагентов. Отбор раствора из исходного флакона проводить при постоянном помешивании, не допуская выпадения в осадок гранул ионообменной смолы.
    
    6.14. Суспендировать содержимое пробирки на вортексе 5-10 с до гомогенного состояния, затем термостатировать 10 мин при 65 °С.
    
    6.15. Еще раз суспендировать пробу на вортексе, центрифугировать 1 мин при 5000 g.
    
    6.16. Супернатант, содержащий очищенную ДНК, перенести в чистую пробирку и хранить при -20 °С до проведения ПЦР анализа. При отборе раствора ДНК необходимо избегать захвата осадка, содержащего сорбент.
    
    Примечание. Кроме описанного выше сорбционного метода выделения ДНК, возможно использование метода выделения, с помощью СТАВ (гексадецилтриметиламмониум бромид), описанного в методических указаниях по определению генетически модифицированных источников в продуктах питания растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции (МУК 4.2.1902-04 "Определение генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции").
    
    

7. Амплификация

    
    7.1. Перед проведением реакции вынуть из холодильника необходимое количество микропробирок с сухими реагентами из набора реагентов. Промаркировать соответствующим образом: "-" контроль", "исследуемые пробы", "+" контроль".
    
    7.2. Добавить во все пробирки по 5 мм праймеров.
    
    7.3. Добавить во все пробирки по 10 мм растворителя.
    
    7.4. В пробирку, которая служит отрицательным контролем, добавить 5 мм бидистиллированной воды. В опытные пробирки добавить по 5 мм исследуемой ДНК. В пробирку с положительным контролем добавить 5 мм раствора контрольной ДНК.
    
    7.5. Добавить во все пробирки по 20 мм минерального масла (масло не используется в случае, если амплификатор имеет термостатируемую крышку).
    
    7.6. Подготовленные для проведения реакции пробирки перенести в термоблок программируемого термостата и запустить программу амплификации в соответствии с режимами, приведенными в табл.1.
    
    

Таблица 1

    
Программа проведения амПЦР

    

Шаг программы

Температура, °С

Время инкубации, с

Количество циклов

1

94

180

1

2

94

30

42

3

62,5

30


4

72

180

1

    
     Примечание. Для пипетирования жидкостей без примесей рекомбинантной ДНК (праймеры, растворитель, вода), необходимо иметь отдельный комплект микродозаторов, не используемых при пробоподготовке или работах с ДНК-содержащими препаратами. При подготовке смесей для проведения амПЦР каждую пробирку открывают только перед отбором или внесением проб, а по окончании манипуляции сразу же закрывают. Запрещается открывать одновременно несколько микропробирок с пробами и оставлять их открытыми на длительное время.
    
    
    7.7. После завершения реакции микропробирки необходимо передать в помещение, в котором будет проводиться гибридизация. Отбор пробы для гибридизации проводится из-под слоя минерального масла в случае его использования.
    
    7.8. Подготовка проб для амПЦР и их гибридизации с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе в одном помещении не допускается. Реакционные смеси после амплификации содержат в высоких концентрациях фрагменты ДНК, контаминация которыми помещений, оборудования и реактивов может привести к получению ложноположительных результатов.
    
    

8. Проведение ДНК-гибридизации

    
    8.1. Приготовить рабочие разведения раствора 20хSSC (3М NaCI, 0,3 М цитрат натрия, рН 7,4): 2хSSC, 0,1% SDS; 0,1хSSC; 0,1хSSC, 0,1% SDS; 0,01хSSC. Для приготовления 100 см раствора можно воспользоваться табл.2.
    
    

Таблица 2

    
Приготовление рабочих растворов SSC

    

Раствор

20хSSC

10%-й SDS

НО дист.

2хSSC, 0,1% SDS

10 см

1 см

89 см

0,1xSSC

0,5 см

-

99,5 см

0,1xSSC, 0,1% SDS

0,5 см

1 см

98,5 см

0,01хSSC

0,05 см

-

99,95 см

    
    
    8.2. Микропробирки с продуктами амплификации ДНК центрифугировать 1-2 с для сбора пробы на дне пробирки и держать далее только в вертикальном положении. Добавить в каждую микропробирку 5 мм 20хSSC и 0,2 мм 10% SDS, перемешать и центрифугировать 1-2 с. Распределить полученную смесь по поверхности микрочипа, содержащей зоны иммобилизованных олигонуклеотидов.
    
    8.3. Поместить микрочип во влажную камеру (например, в чашку Петри со смоченным дистиллированной водой бумажным фильтром) и поставить на 1 ч в воздушный термостат с температурой 42 °С.
    
    8.4. По окончании реакции капли смыть буфером 2хSSC, 0,1% SDS и затем тщательно промыть чип следующими растворами:
    
     2хSSC, 0,1% SDS - 1 раз 5 мин;
    
     0,1хSSC, 0,1% SDS - 2 раза по 5 мин;
    
     0,1хSSC - 5 раз по 1 мин;
    
     0,01хSSC в течение 10 с.
    
    

9. Проведение ферментного анализа

    
    9.1. Исходный стрептавидин-пероксидазный конъюгат разбавить в 200 раз буфером 1хSSC, содержащим 1% BSA (бычий сывороточный альбумин), из расчета 25 мм на микрочип. Например, необходимо проанализировать 5 микрочипов. Для этого потребуется 25х5=125 мм раствора конъюгата. Готовят с небольшим избытком, 150 мм раствора. Для этого 1,5 мг BSA растворяют в 150 мм 1хSSC, а затем добавляют 0,75 мм исходного конъюгата.
    
    9.2. Нанести 25-30 мм разведенного конъюгата на рабочую зону микрочипа и поместить его на 30 мин во влажную камеру при комнатной температуре.
    
    9.3. Смыть конъюгат раствором 1хSSC.
    
    9.4. Залить микрочип раствором 2хSSC и промыть 5 мин.
    
    9.5. Промыть микрочип раствором 1хSSC.
    
    9.6. Непосредственно перед применением приготовить раствор субстрата - диаминобензидина (ДАБ). Для этого растворить таблетку ДАБ в 1 см буфера 0,1хSSC, добавить 30 мм 3%-го раствора пероксида водорода и перемешать. Раствор использовать немедленно.
    
    9.7. Залить рабочую зону микрочипа раствором субстрата и выдержать от 2 до 10 минут при комнатной температуре. В случае положительной реакции появляются коричневые пятна окисленного субстрата.
    
    9.8. Промыть микрочип дистиллированной водой, встряхнуть капли воды и поместить в термостат 42 °С на 5-10 мин. После сушки микрочип с окрашенными зонами необходимо хранить в темном месте.
    
    

10. Сканирование биологических микрочипов

    
    10.1. В соответствии с руководством по эксплуатации, поставляемым в комплекте с аппаратно-программным комплексом "ДЕГМИГЕН-001", подготовить сканер микрочипов к работе.
    
    10.2. Поместить микрочип в рамку для сканирования, зафиксировать его и закрыть рамку.
    
    10.3. Запустить программу сканирования, функционирующую в диалоговом режиме, дождаться появления на мониторе приглашения к сканированию и только после этого вставить рамку с микрочипом в приемное окно детектора.
    
    10.4. После завершения сканирования микрочипа необходимо сохранить изображение (прилож.1Б), присвоив файлу соответствующее имя.
    
    10.5. Для завершения работы с программой сканирования следует нажать в диалоговом окне клавишу "ВЫХОД".
    
    

11. Анализ изображений биочипов

    
    11.1. Запустить программу обработки изображения микрочипа "Arra".
    
    11.2. Ввести оцифрованное изображение в программу, для этого нужно выбрать опцию меню "Файл", и затем открыть изображение. В появившемся диалоговом окне выбрать формат, в котором представлены изображения, и выбрать в списке нужный файл, после чего изображение появится в основном окне программы.
    
    11.3. Провести операцию разметки матрицы, чтобы совместить центры измерительных зондов с центрами пятен решетки в изображении, для этого выбрать опцию меню "Анализ" и затем "Разметка матрицы". Разметка начинается с рисования прямоугольника, боковые стороны которого проходят через центры узлов крайних столбцов. Для этого нужно щелкнуть левой кнопкой мыши в центре левого верхнего пятна/ячейки. Затем, держа кнопку нажатой, переместить правую нижнюю вершину появившегося прямоугольника в центр нижнего правого узла.
    
    11.4. В результате предварительной разметки на экране появится четырехугольник с внутренними линиями, расположенными равномерно, в соответствии с заданным числом столбцов матрицы.
    
    11.5. Чтобы завершить разметку и закрыть диалоговое окно, нужно нажать клавишу "Принять".
    
    11.6. После завершения базовой разметки проводят автоматическую коррекцию положения зондов. Для этого в меню выбирается опция "Настройки/Автоматическая подстройка".
    
    11.7. Для анализа результатов нужно выбрать опцию меню "Анализ" - "Показать результаты".
    
    11.8. По окончании измерений программа предоставляет возможность подготовки и распечатки протокола испытаний (прилож.2). Для этого нужно выбрать опцию меню "Файл" и затем "Заполнить протокол". После этого появится окно с формой для заполнения. После того как она будет заполнена, нажать кнопку "Выход".
    
    

12. Интерпретация результатов

    
    12.1. Появление регистрируемого компьютерной программой Arra оптического сигнала в одной, нескольких или во всех пяти зонах гибридизации, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды, указывает на присутствие рекомбинантной ДНК, свидетельствующей о наличии ГМО растительного происхождения в анализируемом образце (пробе).
    
    12.2. Отсутствие регистрируемого оптического сигнала во всех пяти гибридизационных зонах, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды, указывает на неимение рекомбинантной ДНК, что свидетельствует о том, что анализируемый образец (проба) не имеет ГМО растительного происхождения.
    
    12.3. Появление оптического сигнала в зоне гибридизации при использовании отрицательного контроля амплификации свидетельствует о получении ложноположительного результата. Причиной может быть загрязнение реактивов и/или оборудования. В этом случае необходимо обработать поверхности лабораторных столов и оборудования раствором 1Н соляной кислоты, заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ.
    
    12.4. Отсутствие оптического сигнала при использовании положительного контроля амплификации, свидетельствует о получении ложноотрицательного результата. Причиной могут быть потеря активности одного из компонентов реакционной смеси для амПЦР и/или гибридизации с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе. В этом случае необходимо заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ.
    
    

13. Организация рабочих мест

    
    Организация рабочих мест для проведения исследований, описанных в настоящих методических указаниях, проводится в соответствии с МУК 4.2.1902-04 "Определение генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции".
    
    

Нормативные ссылки

    
    1. Федеральный закон "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" от 30.03.99 N 52-ФЗ (в редакции от 09.05.2005 N 45-ФЗ).
    
    2. Закон Российской Федерации "О защите прав потребителей" от 07.02.92 N 2300-I (в редакции от 21.12.2004 N 171).
    
    3. Постановление Правительства Российской Федерации "Об утверждении Положения о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании" от 24.07.2000 N 554 (в редакции от 15.09.2005 N 569).
    
    4. Постановление Правительства Российской Федерации "О Положении об осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора в Российской Федерации" от 15.09.2005 N 569.
    
    5. Постановление Правительства Российской Федерации "Об утверждении Положения о Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" от 30.06.2004 N 322.
    
    6. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации "О порядке проведения санитарно-эпидемиологической экспертизы пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников" от 08.11.2000 N 14.
    
    7. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации "Об усилении надзора за пищевыми продуктами, полученными из ГМИ" от 31.12.2004 N 13.
    
    8. СанПиН 2.3.2.1078-01 "Продовольственное сырье и пищевые продукты. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов".
    
    9. ГОСТ 5904-82 "Изделия кондитерские. Правила приемки, методы отбора и подготовки проб".
    
    10. ГОСТ 9163-90 "Консервы мясные и мясорастительные. Сосиски. Технические условия".
    
    11. ГОСТ 12292-00 "Консервы рыбные с растительными гарнирами. Технические условия".
    
    12. ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб".
    
    13. ГОСТ 12430-66 "Продукция сельскохозяйственная. Методы отбора проб при карантинном досмотре и экспертизе".
    
    14. ГОСТ 26313-84 "Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб".
    
    15. ГОСТ 22617.0-77 "Семена сахарной свеклы. Правила приемки и методы отбора проб".
    
    16. ГОСТ 27668-88 "Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб".
    
    17. ГОСТ 26312.1-84 "Крупа. Правила приемки и методы отбора проб".
    
    18. ГОСТ 9792-73 "Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила приемки и методы отбора проб".
    
    19. ГОСТ 7631-85 "Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Правила приемки, органолептические методы оценки качества, методы отбора проб для лабораторных испытаний".
    
    20. ГОСТ 12036-85 "Семена сельскохозяйственных культур. Правила приемки и методы отбора проб".
    
    21. ГОСТ Р 51447-99 "Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб".
    
    22. ГОСТ 17109-88 "Соя. Требования при заготовках и поставках".
    
    23. ГОСТ 19341-73 "Консервы рыбные. Печень рыб с растительными добавками. Технические условия".
    
    24. ГОСТ 26809-86 "Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу".
    
    25. ГОСТ 27853-88 "Овощи соленые и квашеные, плоды и ягоды моченые. Приемка, отбор проб".
    
    26. ГОСТ 28741-90 "Продукты питания из картофеля. Приемка, подготовка проб и методы испытаний".
    
    27. ГОСТ 29142-91 "Семена масличных культур. Отбор проб".
    
    28. ГОСТ 13634-90 "Кукуруза. Требования при заготовках и поставках".
    
    29. ГОСТ 15877-70 "Кукуруза сахарная консервированная. Технические условия".
    
    30. ГОСТ 17110-71 "Соя (промышленное сырье). Требования при поставках. Технические условия".
    
    31. ГОСТ Р 50436-92 "Зерновые. Отбор проб зерна".
    
    32. ГОСТ Р 50437-92 "Бобовые культуры в мешках. Отбор проб".
    
    32. ГОСТ Р 51926-2002 "Консервы. Икра овощная. Технические условия".
    
    34. ГОСТ ИСО 2170-97 "Зерновые и бобовые. Отбор проб молотых продуктов".
    
    

Приложение 1

    
Пример гибридизационной картины продуктов амПЦР
на биологическом микрочипе

    
    

    А
            

    
    

     Б
         

         
    
    A - схема негелевого биологического микрочипа для идентификации ГМИ растительного происхождения;
    
    Б - гибридизационная картина на экране компьютера, полученная в результате анализа генетически модифицированной сои, содержащей промотор 35S и терминатор nos.
    
    

Приложение 2

Форма протокола испытаний по идентификации генно-инженерно-
модифицированных организмов (ГМО) растительного происхождения
с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе

    
ПРОТОКОЛ ИСПЫТАНИЙ

Серия АБ N 0000000

    

N_____от "__" __________200__г.

Продукция



Производитель сырья или продукции



Предъявитель сырья или продукции



Отбор проб произведен в соответствии с нормативным документом на соответствующую группу сырья или продукции



Акт отбора проб и техническое задание на испытания N ___от



Испытания проведены на основании требований

Номер образца



Характеристика испытуемого образца (маркировка, вид и состояние упаковки, этикетки, штрих кода)

в образцах N _______ отсутствует, а в образце N ______ присутствует

Маркировка:



Годен до

Штриховой код





    
    Результаты испытаний
    

Номер образца

Трансгенные последовательности


35S

gus

nos

nptll

ocs













    
    

Результаты анализа






Исполнители:


       подпись


         подпись


       подпись


         подпись


Руководитель испытательной лаборатории


подпись

М. П.


Фамилия, инициалы

Заключение распространяется на образец, представленный на испытания.

    
    
    
Текст документа сверен по:
официальное издание
Бюллетень нормативных и методических
документов госсанэпиднадзора, Выпуск N 4(22), 2005

  отправить на печать

Личный кабинет:

доступно после авторизации

Календарь налогоплательщика:

ПнВтСрЧтПтСбВс
01
02 03 04 05 06 07 08
09 10 11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22
23 24 25 26 27 28 29
30 31

Заказать прокат автомобилей в Краснодаре со скидкой 15% можно через сайт нашего партнера – компанию Автодар. http://www.avtodar.ru/

RuFox.ru - голосования онлайн
добавить голосование