МУК 4.1.1218-03

     
     
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ  

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств изоксафлютола и его метаболита
RPA-202248 в воде; изоксафлютола (в виде RPA-202248) в почве, зерне
и зеленой массе кукурузы методом высокоэффективной жидкостной
хроматографии, а также изоксафлютола в воде методом
газожидкостной хроматографии

     
     
Дата введения 2003-07-01

     
     
     УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 16 марта 2003 г.
     
     

1. Вводная часть

     
     Фирма производитель: Рон Пуленк.
     
     Торговое название: Мерлин, 75% в.г.
     
     Название действующего вещества по ИСО: изоксафлютол.
     
     Название действующего вещества по ИЮПАК: 5-циклопропил-1,2-оксазол-4-ил ,,-трифтор-2-мезил--толилкетон.
     
     Синонимы: RPA 201772.
     
     Структурная формула:
          

          
     Эмпирическая формула: CHFNOS.
     
     Молекулярная масса: 359,3.
     
     Химически чистый изоксафлютол представляет собой белый кристаллический порошок без запаха.
     
     Температура плавления: 140 °С.
     
     Давление паров: 1·10 мПа (при 25 °С).
     
     Коэффициент перераспределения в системе октанол-вода: 2,32.
     
     Растворимость в воде при 10,2 °С - 5,3 мг/л, при 19,9 °С - 6,2 мг/л, при 30,3 °С - 11,8 мг/л.
     
     Растворимость в органических растворителях (г/л при 24 °С): ацетонитрил - 233, гексан - 0,1, дихлорметан - 346, метанол - 13,8, октанол - 0,76, толуол - 31,2, этилацетат - 142, ацетон - 293.
     
     Максимум поглощения в ультрафиолетовой области спектра находится на длине волны 268,7 нм.
     
     Вещество стабильно при нагревании (14 дней при 54 °С) и на свету, но быстро разрушается в щелочной среде в результате гидролиза (T составляет при рН 5 - 11,1 суток, при рН 7 - 20,1 дней, при рН 9 - 3,2 дня).
     
     Основной метаболит изоксафлютола - RPA 202248.
     

          
     Структурная формула:     
     

          
     Эмпирическая формула: CHFNOS.
     
     Молекулярная масса: 359,3.
     
     Химически чистый RPA 202248 представляет собой бесцветный кристаллический порошок без запаха.
     
     Температура плавления - 137,3 °С.
     
     Коэффициент перераспределения в системе октанол-вода: -0,88.
     
     Растворимость в воде при 25 °С - 326 мг/л.
     
     RPA 202248 - кислота с рКа 1,64.
     
     Максимум поглощения в ультрафиолетовой области спектра находится на длине волны 302,0 нм.
     
     Второй метаболит изоксафлютола - RPA 203328.
     
     Название действующего вещества по ИЮПАК: 2-метилсульфонил-4-трифторбензойная кислота.
     
     Структурная формула:      
     

          
     Эмпирическая формула:CHFOS.
     
     Молекулярная масса: 268,2.
     
     Химически чистый RPA 203328 представляет собой бесцветный кристаллический порошок без запаха.
     
     Температура плавления - 157,1 °С.
     
     Коэффициент перераспределения в системе октанол-вода: 0,61 при рН 3,0 и менее 0 при рН 7,0.
     
     Растворимость в воде при 25 °С - 8460 мг/л.
     
     RPA 203328 - кислота с рКа 2,4.
     
     Краткая токсикологическая характеристика: изоксафлютол относится к малоопасным по оральной токсичности соединениям (ЛД для крыс составляет более 5000 мг/кг) с низкой дермальной (ЛД для кроликов более 2000 мг/кг) и ингаляционной (ЛК для крыс составляет более 5230 мг/м) токсичностью. Кумулятивные свойства изоксафлютола выражены слабо: не раздражает кожу и слабо раздражает слизистую оболочку глаз. Аллергенное действие изоксафлютола не выявлено.
     
     МДУ в зерне кукурузы - 0,05 мг/кг.
     
     Область применения препарата. Изоксафлютол - гербицид системного действия, проникающий через корни и листья растений и ингибирующий биосинтез каротиноидов. Хорошо подавляет развитие широколистных и злаковых сорняков в посевах кукурузы при довсходовом или допосевном внесении с нормой расхода 75-140 г д.в./га.
     
     Проходит регистрационные испытания в России и странах СНГ под торговым названием Мерлин, 75% в.г., в качестве гербицида в посевах кукурузы с нормой расхода 0,10-0,15 кг/га при однократной обработке за сезон.
     
     По данным фирмы-регистранта, метаболиты изоксафлютола токсикологического значения не имеют.
     
     

2. Методика определения остаточных количеств изоксафлютола
и его метаболита RPA-202248 в воде; изоксафлютола (в виде RPA-202248)
в почве, зерне и зеленой массе кукурузы методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии, а также изоксафлютола в воде
методом газожидкостной хроматографии

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

     
     Методика основана на определении изоксафлютола и его метаболита R в воде, а также изоксафлютола в виде его метаболита RPA 202248 в других средах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, перевода изоксафлютола в его метаболит (при необходимости), очистки экстракта путем перераспределения между двумя несмешивающимися растворителями и на концентрирующих патронах.
     
     Методика определения изоксафлютола в воде с помощью газожидкостной хроматографии основана на использовании детектора с постоянной скоростью рекомбинации ионов и неподвижной фазы OV-210. При этом изоксафлютол путем гидролиза превращается в RPA 202248 и экстрагируется из воды органическим растворителем. Затем за счет метанолиза RPA 202248 переводится в RPA 203328, который после очистки экстракта перераспределением действующего вещества между несмешивающимися фазами метилируется и хроматографируется в виде метилового эфира 2-метилсульфонил-4-трифторбензойной кислоты.
     
     Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.
     

2.1.2. Метрологическая характеристика метода.

     
     Метрологическая характеристика метода представлена в табл.1, 2.
     
     

Таблица 1

     
Метрологическая характеристика метода

     
     
Таблица 2

     
Полнота определения изоксафлютола в воде, почве, зерне и зеленой массе кукурузы
(5 повторностей для каждой концентрации)

     

2.1.3. Избирательность метода

     
     В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых при выращивании кукурузы.
     
     

2.2. Реактивы, растворы, материалы и оборудование

     
2.2.1. Реактивы, материалы и растворы

2.3. Подготовка к определению

     
2.3.1. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии

     
     Колонку с неподвижной фазой Zorbax SB-C18 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при t=25 °С и скорости потока подвижной фазы 1 мл/мин в течение 3-4 ч.
     

2.3.2. Подготовка и кондиционирование колонки для газожидкостной хроматографии

     
     Готовую насадку (5% OV-210 на Газохроме-Q) засыпают в стеклянную колонку, уплотняют под вакуумом, колонку устанавливают в термостате хроматографа, не подсоединяя к детектору, и стабилизируют в токе азота при температуре 230 °С в течение 8-10 ч.
     

2.3.3. Приготовление стандартных растворов

     
     Взвешивают 100 мг RPA 202248 в мерной колбе объемом 100 мл. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом (стандартный раствор N 1, концентрация RPA 202248 - 1,0 мг/мл). Затем 1 мл стандартного раствора N 1 отбирают пипеткой в мерную колбу объемом 100 мл и доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании (стандартный раствор N 2, концентрация RPA 202248 - 10 мкг/мл). Стандартные растворы N 1 и 2 можно хранить в холодильнике в течение 3-х месяцев. Методом последовательного разведения ацетонитрилом из раствора N 2 готовят растворы, содержащие по 5,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,2 мкг/мл вещества и используют эти растворы для построения калибровочного графика и внесения в контрольный образец при отработке методики.
     
     Аналогично готовят стандартные растворы изоксафлютола N 1 (1 мг/мл) и 2 (10 мкг/мл).
     
     Для отработки методики определения остаточных количеств изоксафлютола и RPA 202248 в воде методом ВЭЖХ готовят смешанный стандарт, содержащий оба вещества в равной концентрации. В мерную колбу объемом 100 мл помещают по 1 мл стандартных растворов изоксафлютола и RPA 202248 с концентрацией 1 мг/мл и доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании (стандартный раствор с концентрацией изоксафлютола и RPA 202248 - 10 мкг/мл). Для построения калибровочного графика и внесения в контрольный образец при отработке методики методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы с концентрацией изоксафлютола и RPA 202248 2,0; 0,8; 0,4; 0,2 мкг/мл.
     

2.3.4. Приготовление растворов для жидкостной хроматографии

     
     2.3.4.1. Очистка бидистиллированной воды.
     
     Бидистиллят кипятят в течение 6 ч с марганцово-кислым калием, добавленным из расчета 1 г/л, и затем перегоняют.
     
     2.3.4.2. Очистка ацетонитрила.
     
     Ацетонитрил перегоняют на стеклянной установке для дистилляции, собирая фракцию, кипящую при температуре 81,6 °С.
     
     2.3.4.3. Приготовление 0,2%-ного водного раствора трифторуксусной кислоты.
     
     В мерную колбу объемом 1000 мл наливают 300 мл очищенной воды, прибавляют туда же 2 мл концентрированной трифторуксусной кислоты и тщательно перемешивают, после чего доводят раствор до метки очищенной водой.
     
     2.3.4.4. Приготовление подвижной фазы для ВЖХА.
     
     В плоскодонную колбу объемом 1 л помещают 500 мл ацетонитрила и 500 мл 0,2%-ного водного раствора трифторуксусной кислоты. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 мл/мин в течение 5 мин, после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 мин. Полученный раствор используют в качестве подвижной фазы.
     
     2.3.4.5. Приготовление раствора для разведения проб.
     
     В плоскодонную колбу объемом 100 мл помещают 80 мл ацетонитрила и 20 мл 0,2%-ного водного раствора трифторуксусной кислоты. Смесь тщательно перемешивают. Полученный раствор используют для растворения проб перед вводом их в хроматограф.
     

2.3.5. Построение калибровочного графика (ВЖХ)

     
     Для построения калибровочного графика вводят в хроматограф последовательно 3 раза по 20 мкл каждого из полученных четырех растворов RPA 202248 (с концентрацией 2,0; 1,0; 0,5 и 0,2 мкг/мл), измеряют площадь пиков, рассчитывают среднее значение площади пика для каждой концентрации и строят график зависимости площади пика от концентрации RPA 202248 (мкг/мл).
     
     Для построения калибровочного графика для смешанного стандарта вводят в хроматограф последовательно 3 раза по 20 мкл каждого из полученных четырех растворов изоксафлютола и RPA 202248 (с концентрацией 2,0; 0,8; 0,4; 0,2 мкг/мл), измеряют площадь пиков, рассчитывают среднее значение площади пика для каждой концентрации и строят график зависимости площади пика от концентрации каждого компонента смешанного стандарта - изоксафлютола и RPA 202248.
     

2.3.6. Подготовка концентрирующего патрона Диапак-Диол (2 ОН) (0,6 г) для очистки экстракта

     
     Все процедуры происходят с использованием вакуума.
     
     Патрон Диапак-Диол устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 мл (используют, как емкость для элюентов).
     
     Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают последовательно 5 мл метанола и 5 мл смеси гексана с ацетоном в соотношении 50:50. Элюат отбрасывают. Нельзя допускать высыхания поверхности картриджа!
     

2.3.7. Подготовка картриджа Sep-Pak Diol (2 ОН) (5 г) для очистки экстракта

     
     Все процедуры происходят без использования вакуума при нормальном атмосферном давлении.
     
     Кондиционирование: картридж промывают последовательно 20 мл метанола и 20 мл смеси гексана с ацетоном в соотношении 50:50. Элюат отбрасывают.
     
     Нельзя допускать высыхания поверхности картриджа!
     

2.3.8. Проверка хроматографического поведения RPA 202248 на картриджах и концентрирующих патронах

     
     В круглодонную колбу объемом 50 мл вносят по 1 мл стандартного раствора RPA 202248 с концентрацией 1 мкг/мл и упаривают досуха при температуре не выше 30 °С.
     
     Добавляют 1 мл ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 1 мл гексана, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор наносят на картридж. Концентратор тщательно обмывают 2 мл смеси гексан-ацетон в соотношении 50:50 и смесь также вносят на картридж. Картридж промывают последовательно 10 мл гексана и 10 мл смеси гексан-ацетон в соотношении 50:50 со скоростью 2 мл/мин. Элюат отбрасывают. Затем RPA 202248 элюируют с картриджа пятью порциями по 2 мл метанола. Каждую фракцию упаривают досуха при температуре не выше 30 °С. Каждую фракцию анализируют отдельно, для чего сухой остаток после упаривания растворяют в смеси: ацетонитрил + 0,2%-ный водный раствор трифторуксусной кислоты в соотношении 80:20 и аликвоту объемом 20 мкл вводят в хроматограф.
     
     Рассчитывают содержание RPA 202248 в каждой фракции и определяют полноту элюирования вещества с картриджа или патрона и необходимый для очистки объем элюата.
     
     Примечание: Хроматографическое поведение RPA 202248 на картриджах и патронах обязательно проверяют при отработке методики и каждый раз при использовании новых партий картриджей и патронов.
     
     

2.3.9. Приготовление 1 М раствора гидроксида натрия в метаноле

     
     Взвешивают 4 г гидроксида натрия в мерной колбе на 100 мл, растворяют навеску в метиловом спирте и доводят объем до метки метанолом (необходимо добиться полного растворения щелочи).
     

2.3.10. Получение N-нитрозо-N-метилмочевины

     
     При отсутствии коммерческого препарата N-нитрозометилмочевины осуществляют его синтез. Все работы необходимо проводить в вытяжном шкафу! В круглодонную колбу со шлифом вместимостью 1 л, снабженную обратным холодильником, помещают 80 г метиламина гидрохлорида и 300 г мочевины, растворяют содержимое в 400 мл воды и кипятят 3 ч с обратным холодильником на водяной бане. По истечении срока раствор в колбе охлаждают до комнатной температуры и добавляют в него 110 г нитрита натрия. Затем раствор охлаждают в бане со льдом, содержащим поваренную соль, до 0 °С. Охлажденный раствор медленно (Осторожно! Вспенивание.) при перемешивании переливают в стакан емкостью 2 л, содержащий смесь 600 г льда и 60 мл концентрированной серной кислоты, охлаждаемый снаружи смесью льда с поваренной солью, следя за тем, чтобы температура внутри стакана не поднималась выше 2 °С. Всплывшие кристаллы нитрозометилмочевины немедленно отфильтровывают через фильтр в воронке Бюхнера под вакуумом и промывают на фильтре ледяной водой.
     
     Внимание! Нитрозометилмочевину хранят во влажном состоянии в темной склянке с пластмассовой пробкой в морозильнике, так как под действием света и тепла она может взорваться.
     

2.3.11. Приготовление раствора диазометана

     
     Диазометан взрывоопасен и очень ядовит. Все работы необходимо проводить в вытяжном шкафу!
     
     В коническую колбу на 100 мл вносят 20 мл 40%-ного раствора гидроксида калия и 50 мл диэтилового эфира, колбу помещают в баню со льдом и охлаждают до температуры 2-4 °С. В охлажденную смесь порциями при перемешивании на магнитной мешалке или путем встряхивания вносят 5 г нитрозометилмочевины. Реакционную смесь выдерживают на холоде 10 мин. Затем эфирный слой сливают в чистую коническую колбу вместимостью 100 мл, добавляют 10-15 гранул гидроксида калия и колбу оставляют в бане со льдом на 2,5-3,0 ч для осушения раствора.
     
     Раствор диазометана в эфире годен к употреблению при хранении в морозильнике в течение 1-2 суток. При хранении сосуды с диазометаном нельзя плотно закрывать!
     

2.3.12. Метилирование аналитического стандарта и анализируемого образца

     
     К остатку, полученному после превращения стандартного раствора изоксафлютола в RPA-203328, к сухому остатку при анализе образцов, в концентраторы добавляют 2 мл эфирного раствора диазометана и выдерживают смесь при комнатной температуре 30 мин. Эфир отдувают прохладным воздухом досуха.
     

2.3.13. Модификация аналитического стандарта изоксафлютола для построения калибровочного графика и калибровки прибора перед анализом серии образцов

     
     Отбирают 1 мл стандартного раствора изоксафлютола N 2 (10 мкг/мл) в концентратор и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 10 мл этанола, добавляют 2%-ный раствор гидроксида натрия до рН 9,0-10,0 и оставляют на 1 ч при комнатной температуре. При этом изоксафлютол гидролизуется до RPA 202248. По истечении срока в концентратор добавляют 8-10 мл дистиллированной воды и упаривают спирт на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С до водного остатка.
     
     Водную фракцию переносят в делительную воронку, добавляют 20 мл насыщенного раствора хлористого натрия и 70 мл дистиллированной воды, подкисляют до рН1 концентрированной соляной кислотой (2 мл) и трижды экстрагируют RPA 202248 хлористым метиленом порциями по 50 мл. Объединенные экстракты пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха.
     
     Сухой остаток из концентратора переносят в мерную пробирку с притертой пробкой, тщательно обмывая концентратор тремя порциями диэтилового эфира по 5 мл. Эфир упаривают в токе теплого воздуха. В пробирку добавляют 5 мл 1 М раствора гидроксида натрия в метаноле и растворяют сухой остаток, выдерживая пробирку в ультразвуковой ванне в течение 2 мин, после чего пробирку плотно закрывают и нагревают в песчаной бане в течение 1 ч при температуре 110 °С (недопустимо присутствие воды, т.к. любое ее количество ингибирует метанолиз). По истечении срока пробирку охлаждают до комнатной температуры. В остывшую пробирку добавляют 5 мл дистиллированной воды и переносят содержимое в делительную воронку. Пробирку ополаскивают водой еще 3 раза по 5 мл. Водную фазу подкисляют до рН1 концентрированной соляной кислотой (2 мл), добавляют 6 г хлористого натрия и трижды экстрагируют хлористым метиленом порциями по 15 мл. Объединенные экстракты пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха.
     
     Сухой остаток метилируют следуя пункту 2.3.12.
     
     После метилирования сухой остаток в концентраторе растворяют в 5 мл гексана, раствор переносят в мерную колбу объемом 10 мл, обмывая концентратор гексаном, и доводят объем колбы до метки гексаном. Концентрация полученного раствора соответствует 1 мкг изоксафлютола в 1 мл. Методом последовательного разведения гексаном готовят растворы с концентрацией изоксафлютола 1,0; 0,5; 0,25; 0,1 мкг/мл. Для построения калибровочного графика вводят в хроматограф последовательно 3 раза по 2 мкл каждого из полученных четырех растворов, измеряют высоту пиков, рассчитывают среднее значение высоты пика для каждой концентрации и строят график зависимости высоты пика от концентрации изоксафлютола (мкг/мл).
     
     Указанные в п.2.3.13 операции проводят перед постановкой методики в лаборатории и при анализе очередной серии образцов воды.
     
     

2.4. Отбор проб

     
     Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Отобранные пробы зерна кукурузы в початках подсушивают до стандартной влажности и хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре при комнатной температуре. Замороженные образцы зеленой массы хранят в морозильной камере при температуре не выше 18 °С. Для длительного хранения пробы почвы подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Початки обрушивают, зерно измельчают на лабораторной мельнице.
     
     

2.5. Описание определения

     
2.5.1. Вода

     
     2.5.1.1. Высокоэффективная жидкостная хроматография.
     
     Пробу воды объемом 200 мл помещают в делительную воронку емкостью 500 мл, добавляют 1,0 мл концентрированной соляной кислоты и трижды экстрагируют хлористым метиленом порциями по 50 мл, интенсивно встряхивая воронку в течение 2 мин. После разделения фаз в воронке нижний слой (хлористый метилен) собирают в концентратор, пропуская его через безводный сульфат натрия, осушитель обмывают еще 10 мл этилацетата и объединяют с экстрактом. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 2,0 мл смеси: ацетонитрил + 0,2%-ный раствор трифторуксусной кислоты в соотношении 80:20 и аликвоту 20 мкл вводят в хроматограф.
     
     2.5.1.2. Газожидкостная хроматография.
     
     Образец воды объемом 100 мл помещают в коническую колбу на 250 мл, добавляют 2%-ный водный раствор гидроксида натрия до рН 9-10 (2,5 мл) и помещают на механический встряхиватель на 1 ч.
     
     После встряхивания воду переносят в делительную воронку, добавляют 20 мл насыщенного раствора хлористого натрия, подкисляют до рН1 концентрированной соляной кислотой (2 мл) и трижды экстрагируют RPA 202248 хлористым метиленом порциями по 50 мл. Объединенные экстракты пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха.
     
     Сухой остаток из концентратора переносят в мерную пробирку с притертой пробкой, тщательно обмывая концентратор тремя порциями диэтилового эфира по 5 мл. Эфир упаривают в токе теплого воздуха. В пробирку добавляют 5 мл 1 М раствора гидроксида натрия в метаноле и растворяют сухой остаток, выдерживая пробирку в ультразвуковой ванне в течение 2 мин, после чего пробирку плотно закрывают и нагревают в песчаной бане в течение 1 ч при температуре 110 °С (недопустимо присутствие воды, т.к. любое ее количество ингибирует метанолиз). По истечении срока пробирку охлаждают до комнатной температуры. В остывшую пробирку добавляют 5 мл дистиллированной воды и переносят содержимое в делительную воронку. Пробирку ополаскивают водой еще 3 раза по 5 мл. Водную фазу подкисляют до рН1 концентрированной соляной кислотой (2 мл), добавляют 6 г хлористого натрия и трижды экстрагируют хлористым метиленом порциями по 15 мл. Объединенные экстракты пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха.
     
     Сухой остаток метилируют следуя пункту 2.3.12.
     
     После метилирования сухой остаток в концентраторе растворяют в 5 мл гексана и 2 мкл раствора вводят в хроматограф.
     

2.5.2. Почва

     
     2.5.2.1. Экстракция и предварительная очистка. Образец почвы массой 50 г помещают в коническую колбу объемом 250 мл, добавляют 20 мл дистиллированной воды, встряхивают колбу до полного смешивания и дают выстояться в течение 10 мин. Затем в колбу прибавляют 100 мл ацетонитрила и экстрагируют изоксафлютол и RPA 202248 на встряхивателе в течение 30 мин. Полученную смесь центрифугируют и супернатант фильтруют в делительную воронку объемом 250 мл через фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют еще два раза, используя 100 и 75 мл ацетонитрила и экстрагируя на встряхивателе по 30 мин с обязательным центрифугированием. Экстракты фильтруют и объединяют в делительной воронке объемом 250 мл. К объединенному экстракту в делительной воронке добавляют 30 мл гексана и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения слоев верхний гексановый слой отбрасывают, нижний ацетонитрильный слой собирают в химический стакан объемом 200 мл. Ацетонитрильный экстракт возвращают в делительную воронку и промывают еще раз 30 мл гексана. Гексан отбрасывают. Ацетонитрил собирают в концентратор, пропуская через слой безводного сульфата натрия, осушитель промывают 10 мл ацетонитрила, объединяют смыв с экстрактом и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
     
     Сухой остаток растворяют в 3 мл ацетона, добавляют 30 мл дистиллированной воды, 1,5-2,0 мл 2%-ного раствора едкого натра (до рН 9), 20 мл насыщенного раствора хлористого натрия и переносят в делительную воронку. Полученную смесь выдерживают в течение 20 мин при комнатной температуре. Экстракт в делительной воронке трижды промывают гексаном порциями по 30 мл, интенсивно встряхивая делительную воронку в течение 2 мин. После полного разделения слоев верхний гексановый слой отбрасывают. Водную фазу возвращают в делительную воронку. RPA 202248 трижды экстрагируют этилацетатом порциями по 30 мл, интенсивно встряхивая делительную воронку в течение 2 мин. После полного разделения слоев верхний этилацетатный экстракт собирают в концентратор, пропуская через слой безводного сульфата натрия. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
     
     2.5.2.2. Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак-Диол.
     
     Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 1 мл гексана, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор наносят на картридж. Концентратор тщательно обмывают 2 мл смеси гексан-ацетон в соотношении 50:50 и смесь также вносят на картридж. Картридж промывают последовательно 10 мл гексана и 10 мл смеси гексан-ацетон в соотношении 50:50 со скоростью 2 мл/мин. Элюат отбрасывают. RPA 202248 элюируют с картриджа 10 мл метанола, элюат упаривают досуха при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в смеси: ацетонитрил + 0,2%-ный водный раствор трифторуксусной кислоты в соотношении 80:20 и аликвоту объемом 20 мкл вводят в хроматограф.
     

2.5.3. Зерно кукурузы

     
     2.5.3.1 Экстракция и предварительная очистка. Образец размолотого зерна массой 20 г помещают в коническую колбу объемом 250 мл, прибавляют 50 мл ацетонитрила и экстрагируют изоксафлютол и его метаболит в гомогенизаторе в течение 3 мин. Экстракцию повторяют еще два раза, используя каждый раз по 50 мл ацетонитрила и гомогенизируя в течение одной минуты. Экстракты объединяют в делительной воронке объемом 250 мл, отфильтровывая их через фильтр "красная лента". К объединенному экстракту добавляют 30 мл гексана и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения слоев верхний гексановый слой отбрасывают, нижний ацетонитрильный слой собирают в химический стакан объемом 200 мл. Ацетонитрильный экстракт возвращают в делительную воронку и промывают еще раз 30 мл гексана. Гексан отбрасывают. Ацетонитрил собирают в концентратор, пропуская через слой безводного сульфата натрия, осушитель промывают 10 мл ацетонитрила, объединяют смыв с экстрактом и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
     
     Сухой остаток растворяют в 3 мл ацетона, добавляют 30 мл дистиллированной воды, 1,5-2,0 мл 2%-ного раствора едкого натра (до рН 9), 20 мл насыщенного раствора хлористого натрия и переносят в делительную воронку. Полученную смесь выдерживают в течение 20 мин при комнатной температуре. Экстракт в делительной воронке трижды промывают гексаном порциями по 20 мл, интенсивно встряхивая делительную воронку в течение 2 мин. Каждый раз после полного разделения слоев верхний гексановый слой отбрасывают. Водную фазу возвращают в делительную воронку, прибавляют туда 30 мл хлороформа. Делительную воронку интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения слоев нижний хлороформовый слой отбрасывают. RPA 202248 трижды экстрагируют этилацетатом порциями по 30 мл, интенсивно встряхивая делительную воронку в течение 2 мин. После полного разделения слоев верхний этилацетатный слой собирают в концентратор, пропуская через слой безводного сульфата натрия. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
     
     2.5.3.2. Очистка экстракта на картридже Sep-Pak Diol (2 ОН) (5 г).
     
     Сухой остаток растворяют в 2,5 мл ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 2,5 мл гексана, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на картридж. Картридж промывают последовательно 20 мл смеси гексан-ацетон в соотношении 50:50 и 10 мл метанола со скоростью 2 мл/мин. Элюаты отбрасывают. RPA 202248 элюируют с картриджа 10 мл метанола с той же скоростью, элюат упаривают досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в смеси: ацетонитрил + 0,2%-ный водный раствор трифторуксусной кислоты в соотношении 80:20 и аликвоту объемом 20 мкл вводят в хроматограф.
     
     Возможна замена этой процедуры на очистку по п.2.5.2.2.
     

2.5.4. Зеленая масса кукурузы

     
     2.5.4.1. Экстракция и предварительная очистка. Образец зеленой массы весом 10 г измельчают, помещают в коническую колбу объемом 250 мл, прибавляют 75 мл ацетонитрила и встряхивают на встряхивателе в течение 15 мин. Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 50 мл ацетонитрила и экстрагируя на встряхивателе по 15 мин. Экстракт фильтруют в делительную воронку объемом 250 мл через фильтр "красная лента". К объединенному экстракту в делительной воронке добавляют 50 мл насыщенного раствора хлористого натрия и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний водный слой отбрасывают. К экстракту в делительной воронке добавляют 30 мл гексана и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения слоев верхний гексановый слой отбрасывают, нижний ацетонитрильный слой собирают в химический стакан объемом 200 мл. Ацетонитрильный экстракт возвращают в делительную воронку и промывают еще раз 30 мл гексана - гексан отбрасывают. Ацетонитрил собирают в концентратор, пропуская через слой безводного сульфата натрия, осушитель промывают 10 мл ацетонитрила, объединяют смыв с экстрактом и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
     
     Сухой остаток растворяют в 3 мл ацетона, добавляют 30 мл дистиллированной воды, 1,5-2,0 мл 2%-ного раствора едкого натра (до рН 9), 20 мл насыщенного раствора хлористого натрия и переносят в делительную воронку. Полученную смесь выдерживают в течение 20 мин при комнатной температуре. Экстракт трижды промывают гексаном порциями по 30 мл, интенсивно встряхивая делительную воронку в течение 2 мин. После полного разделения слоев верхний гексановый слой отбрасывают. Водную фазу возвращают в делительную воронку, прибавляют туда 1,5 мл 2%-ного раствора едкого натра (до рН 9) и 30 мл хлороформа. Делительную воронку интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения слоев нижний хлороформовый слой отбрасывают. К водному остатку добавляют еще 30 мл хлороформа и процедуру повторяют, хлороформ отбрасывают. RPA 202248 трижды экстрагируют этилацетатом порциями по 30 мл, интенсивно встряхивая делительную воронку в течение 2 мин. После полного разделения слоев верхний этилацетатный экстракт собирают в концентратор, пропуская через слой безводного сульфата натрия. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
     
     2.5.4.2. Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак-Диол.
     

     Далее поступают, как указано в п.2.5.2.2.
     
     

2.6. Условия хроматографирования и обработка результатов

     
     2.6.1. Условия хроматографирования для метода ВЭЖХ
     
     Хроматограф "Уотерс" или другой с аналогичными характеристиками с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны.
     
     Колонка стальная Zorbax SB-C18, 4,6 мм х 25 см.
     
     Температура колонки 25 °С.
     
     Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,2%-ный водный раствор трифторуксусной кислоты в соотношении 50:50 (по объему).
     
     Скорость потока элюента: 1 мл/мин.
     
     Рабочая длина волны: 300 нм.
     
     Чувствительность: 0,0025 ед. оптической плотности на шкалу.
     
     Объем вводимой пробы: 20 мкл.
     

    
      Линейный диапазон детектирования: 4-40 нг.
     

2.6.2. Условия хроматографирования для метода ГЖХ

     
     Хроматограф "Цвет-550М" с детектором постоянной скорости рекомбинации ионов с пределом детектирования по Линдану не выше 4·10 г/см.
     
     Рабочая шкала электрометра 64·10 и 32·10. Скорость движения ленты самописца 200 мм/ч.
     
     Колонка стеклянная, спиральная, длина 2 м, внутренний диаметр 2 мм. Носитель Газохром-Q, размер частиц 0,200-0,250 мм, неподвижная фаза 5% ОV-210.
     
     Температура испарителя - 280 °С, термостата колонки 190 °С, детектора - 340 °С.
     
     Газовый режим: азот - 30 мл/мин.
     
     Абсолютное время удерживания RPA 202248 - 4 мин 06 сек.
     
     Линейность детектирования сохраняется в пределах 0,2-2,0 нг.
     
     Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю высоту пика.
     
     Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 1,0 мкг/мл, разбавляют.
     

2.6.3. Обработка результатов анализа

     
     Содержание изоксафлютола рассчитывают по формуле:
     

,

где  - содержание изоксафлютола в пробе, мг/кг или мг/л;
     
      - высота (площадь) пика стандарта, мм;
     
      - высота (площадь) пика образца, мм;
     
      - концентрация стандартного раствора, мкг/мл;
     
      - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;
     
      - масса анализируемого образца, г (мл);
     
      - содержание изоксафлютола или RPA 202248 в аналитическом стандарте, %.
     
     

3. Требования техники безопасности

     Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.
     
     

4. Контроль погрешности измерений

     
     Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95* ГСИ. "Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа".
_______________
     * Действует МИ 2335-2003. - Примечание .     
     
     

5. Разработчики

     
     Калинин В.А., Калинина Т.С., Довгилевич Е.В., Довгилевич А.В., Осипенкова О.В.
     
     Московская сельскохозяйственная академия имени К.А.Тимирязева. 127550, Москва, Тимирязевская ул., д.53/1, УНКЦ "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов". Телефон/факс: 976-43-26.
     
     
     
Текст документа сверен по:
официальное издание
Определение остаточных количеств пестицидов
в пищевых продуктах, сельскохозяйственном
сырье и объектах окружающей среды:
Сб. методических указаний.
Выпуск 2. Часть 2. МУК 4.1.1217-4.1.1220-03. -
М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии
Роспотребнадзора, 2005