ГОСТ Р 50928-96

Группа С19

     
     
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПРЕМИКСЫ

Методы определения витаминов A, D, Е

Premixes.
Methods for determination of vitamins A, D, E

     
     
ОКС 65.120
ОКСТУ 9209, 9709

Дата введения 1997-01-01

     
     
Предисловие

     
     1 РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН МТК 4, АООТ "Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности" (АООТ "ВНИИКП")
     
     2 ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 29 июля 1996 года N 487
     
     3 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
     
     4 ПЕРЕИЗДАНИЕ
     
     

     1 Область применения

     
     Настоящий стандарт распространяется на премиксы и устанавливает хроматографические методы определения витаминов A, D, Е в премиксах с различными наполнителями из одной навески.
     
     

     2 Нормативные ссылки

     
     В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:
     
     ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия
     
     ГОСТ 4166-76 Натрий сернокислый. Технические условия
     
     ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
     
     ГОСТ 9412-93 Марля медицинская. Технические условия
     
     ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб
     
     ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия
     
     ГОСТ 19627-74 Гидрохинон (парадиоксибензол). Технические условия
     
     ГОСТ 24104-88* Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия
_________________
     * С 1 июля 2002 года вводится в действие ГОСТ 24104-2001.
     
     ГОСТ 24363-80 Калия гидроокись. Технические условия
     
     ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
     
     ГОСТ 26573.0-85 Премиксы. Технические условия
     
     ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой
     
     ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
     
     ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия
     
     

     3 Определение витаминов А, Е обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографией

     
     Сущность метода заключается в экстракции витаминов А (ретинола ацетат) Е (-токоферола ацетата) из премикса изопропиловым спиртом и последующем анализе содержания витаминов с использованием жидкостного хроматографа "Милихром".
     
     3.1 Аппаратура, материалы и реактивы
     
     Хроматограф жидкостный микроколоночный "Милихром" по нормативному документу [1] или его последующие модификации со спектрофотометрическим детектором и спектральным диапазоном 190-360 нм.
     
     Спектрофотометр со спектральным диапазоном работы 186-1100 нм.
     
     Колонка хроматографическая одного из указанных размеров: 2x64, 2x80, 2x120 мм с числом теоретических тарелок не менее 4 тыс., заполненная одним из следующих сорбентов: Силасорб С 18, Силасорб РНС 18, Сепарон С 18.
     
     Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.
     
     Насос водоструйный по ГОСТ 25336.
     
     Баня водяная с терморегулятором.
     
     Колбы конические со шлифом вместимостью 25, 50 см, КН-2-25-18МХС по ГОСТ 25336.
     
     Пипетки 1-1-(1, 2)-1 по ГОСТ 29169.
     
     Пипетки 1-1-1(2)-1(10) по ГОСТ 29227.
     
     Цилиндры 1(2, 3, 4)-100, 1(2, 3, 4)-500 по ГОСТ 1770.
     
     Колбы мерные 2-25-1(2) (исполнения 2, вместимостью 25 см, 1-го или 2-го класса точности) по ГОСТ 1770.
     
     Колбы мерные 2-50-1(2) по ГОСТ 1770.
     
     Воронка ВФО-40-ПОР 16 ХС по ГОСТ 25336.
     
     Холодильник ХПТ-1-100-18 ХС по ГОСТ 25336.
     
     Ретинол ацетат по нормативному документу [11].
     
     Витамин Е-ацетат по нормативному документу [12].
     
     Спирт изопропиловый (пропанол-2), х. ч. по нормативному документу [2].
     
     Спирт пропиловый (пропанол-1), х. ч. по нормативному документу [3].
     
     Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, х. ч. по нормативному документу [4].
     
     Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
     
     Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.
     
     3.2 Порядок подготовки к проведению контроля
     

     3.2.1 Отбор проб - по ГОСТ 13496.0
     
     3.2.2 Приготовление элюента для хроматографии
     
     Трехкомпонентный элюент готовят смешиванием ацетонитрила, пропилового спирта и дистиллированной воды в объемном соотношении 42:50:8. Для этого в склянку вместимостью 1000 см вносят цилиндром 500 см пропилового спирта, 420 см ацетонитрила и 80 см дистиллированной воды.
     
     Приготовленную смесь растворителей фильтруют через стеклянный фильтр и помещают в стеклянный сосуд с притертой пробкой. Полученный раствор можно хранить в течение 1 мес.
     
     3.2.3 Подготовка хроматографической колонки
     
     При использовании новой колонки или колонки после длительного перерыва в работе из нее следует удалить воздух и тщательно промыть элюентом до получения стабильной нулевой линии. Для этого через колонку пропускают элюент в количестве 20-30 свободных объемов колонки, т.е. два полных шприца насоса хроматографа при расходе элюента сначала 50 мкдм/мин, а затем 100 мкдм/мин. Промывку колонки заканчивают при получении стабильной нулевой линии.
     
     После промывки колонки проводят ее насыщение витаминами А, Е, для этого выполняют 7-10 анализов наиболее концентрированных градуировочных растворов витаминов А, Е. Насыщение колонки прекращают, когда отношение разности между двумя последовательными определениями концентрации витамина А(Е) к среднему арифметическому значению этих операций не превышает 3%.
     
     При правильной эксплуатации колонка выдерживает 500-600 анализов.
     
     3.2.4 Приготовление растворителя для экстракции витаминов А, Е из премикса
     
     Для экстракции витаминов используют двухкомпонентный экстрагент состава: изопропиловый спирт и дистиллированную воду в объемном соотношении 97:3. Для этого в мерную колбу вместимостью 1000 см вносят пипеткой 30 см дистиллированной воды и доводят до метки изопропиловым спиртом.
     
     Хранят в стеклянной емкости с притертой пробкой до полного использования экстрагента.
     
     3.2.5 Определение активности витамина А в масляном препарате
     
     (0,1±0,002) г препарата растворяют в абсолютном спирте в мерной колбе вместимостью 50 см. Доводят этим же спиртом объем раствора в колбе до метки и перемешивают. Отбирают 1-2 см полученного раствора в колбу вместимостью 50 см, заполняют ее до метки абсолютным спиртом и измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 326 нм в кювете толщиной слоя 1 см. В качестве контрольного раствора применяют абсолютный спирт.
     
     Массовую концентрацию витамина А, , г/см, определяют по формуле
     

,                                                 (1)

     
где  - оптическая плотность раствора;
     
     ,  - первое и второе разведения, см;
     
      - плотность препарата, г/см;
     
      - масса навески препарата, г;
     
      - объем раствора, используемый для второго разведения, см;
     
     1550 - удельный показатель поглощения Е при длине волны 326 нм для 100%-ного раствора витамина А в абсолютном спирте;
     
     100 - коэффициент.
     
     Содержание витамина А в 1 см соответственно должно быть 0,0310-0,0378 г (90000-110000 ME), 0,0619-0,0757 г (180000-220000 ME), 0,0774-0,0946 г (225000-275000 ME).
     
     Полученные результаты используют для расчета содержания витамина А в стандартном растворе.
     
     3.2.6 Построение градуировочного графика для витамина А
     
     Для приготовления стандартного раствора взвешивают навеску масляного препарата витамина А, необходимую для получения раствора с активностью 30000 ME в 50 см или 600 МЕ/см. Навеску помещают в мерную колбу вместимостью 50 см, растворяют в изопропиловом спирте, перемешивают и доводят этим спиртом до метки.
     
     Раствор хранят в холодильнике в емкости с притертой пробкой и используют в течение одной недели.
     
     Из этого раствора готовят градуировочные (рабочие) растворы, содержащие 120, 300, 600, 1200, 3000, 6000, 12000 ME витамина А в 25 см. Для этого берут соответственно 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0; 20,0 см основного раствора, помещают в мерные колбы вместимостью 25 см и доводят до метки изопропиловым спиртом.
     
     Срок годности растворов не более 1 мес при хранении в холодильнике в емкости с притертой пробкой при температуре 4-10 °С.
     
     Полученные рабочие растворы анализируют на жидкостном хроматографе "Милихром" при следующих условиях:
     
     хроматографическая колонка 2x64 (2x80), (2x120) мм;
     
     сорбент - Силасорб С, Силасорб SPHC, Сепарон С;
     
     трехкомпонентный элюент на основе ацетонитрила;
     
     объем пробы - 6 мкдм;
     
     длина волны - 328 нм;
     
     постоянная времени - 0,2 с;
     
     скорость подачи элюента - 150 мкдм/мин.
     
     Удерживаемый объем пика витамина А составляет 300-360 мкдм (может меняться в зависимости от длины колонки).
     
     Каждый раствор хроматографируют 2 раза. После выхода пика колонку промывают, прокачивая через нее 100-200 мкдм элюента до выхода на нулевую линию.
     
     Значения средних высот хроматографических пиков, выраженных в единицах оптической плотности (е.о.п.), откладывают по оси ординат градуировочного графика, а по оси абсцисс - значения активности витамина А в 25 см раствора.
     
     Градуировочный график строят также, откладывая по оси ординат средние высоты хроматографических пиков, выраженные в миллиметрах.
     
     Построение градуировочных графиков можно заменить расчетом коэффициентов наклона , МЕ/е.о.п. или МЕ/мм, по формуле
     

,                                                                  (2)

     
где  - коэффициент наклона градуировочного графика для -го градуировочного раствора, МЕ/е.о.п. или МЕ/мм;
     
      - количество точек, по которым строится градуировочная кривая.
     
     Значение коэффициента наклона , МЕ/е.о.п. или МЕ/мм, вычисляют по формуле
     

,                                                           (3)

     
где  - содержание витамина А в соответствующем -м градуировочном растворе, ME;
     
      - высота -го хроматографического пика, е.о.п. или мм.
     
     3.2.7 Построение градуировочного графика для витамина Е
     
     0,02 г витамина Е-ацетата стандарта растворяют в изопропиловом спирте в колбе вместимостью 50 см, доводят спиртом до метки и перемешивают. Получают основной раствор витамина Е с концентрацией 0,4 мг/см.
     
     Из полученного основного раствора готовят рабочие растворы, содержащие 7, 5, 3, 1, 0,5, 0,1 и 0,05 мг витамина Е в 25 см раствора. Для этого соответственно 17,5; 12,5; 7,5; 2,5; 2,25; 1,25; 0,25; 0,125 см основного раствора помещают в мерные колбы вместимостью 25 см и объем доводят до метки изопропиловым спиртом. Рабочие растворы анализируют на жидкостном хроматографе при следующих условиях:
     
     хроматографическая колонка 2x64 мм (2x80 мм), (2x120 мм);
     
     сорбент - Силасорб C, Силасорб SPHC, Сепарон С;
     
     трехкомпонентный элюент на основе ацетонитрила;
     
     объем пробы - 6 мкдм;
     
     длина волны - 286 нм;
     
     скорость подачи элюента - 100 мкдм/мин;
     
     постоянная времени - 0,2 с.
     
     Удерживаемый объем пика витамина Е составляет 540-660 мкдм (может меняться в зависимости от длины колонки).
     
     Каждый раствор хроматографируют 2 раза. После выхода пика колонку промывают, прокачивая через нее 200-250 мкдм элюента до выхода на нулевую линию.
     
     Значение средних высот хроматографических пиков (в единицах оптической плотности или миллиметрах) откладывают по оси ординат градуировочного графика, а по оси абсцисс - значение активности витамина Е в миллиграммах в 25 см раствора.
     
     Построение градуировочного графика можно заменить расчетом коэффициента наклона  по 3.2.6.
     
     3.2.8 Проверка градуировочных графиков
     
     Градуировочные графики контролируют не реже 1 раза в неделю. Для этого 1-2 рабочих растворов витаминов А, Е следует хроматографировать по 3.2.6 и 3.2.7.
     
     Отклонение полученных результатов (высота пика, выраженная в единицах оптической плотности или миллиметрах) от измеренных в момент построения градуировочного графика , %, определяют по формуле
     

,                                                          (4)

     
где  и  - высота хроматографического пика, определенная при построении градуировочного графика и в момент проверки соответственно, е.о.п. или мм.
     
     При отклонении более 5% строят новый градуировочный график по свежеприготовленным растворам масляного препарата витамина А, витамина Е-ацетат стандарта.
     
     3.3 Порядок проведения контроля
     
     3.3.1 Экстракция витаминов А, Е из премиксов
     
     Из тщательно перемешанной пробы исследуемого премикса берут навеску с погрешностью не более 0,0005 г. Затем навеску премикса помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 25 см или 50 см и приливают раствор для экстракции в соответствии с таблицей 1.
     
     
Таблица 1
     

     
     
     Колбу соединяют с обратным холодильником и нагревают на водяной бане при температуре (75±1) °С в течение 10 мин. Колбу с экстрактом премикса отсоединяют от обратного холодильника, закрывают притертой пробкой, охлаждают под струей воды до комнатной температуры и фильтруют через фильтр ПОР-16 с размером пор 10-16 мкм с использованием водоструйного вакуумного насоса. Фильтрат собирают в мерную колбу вместимостью 25 см. Коническую колбу и осадок на фильтре тщательно промывают два-три раза небольшими порциями (2-3 см) изопропилового спирта. Раствор в мерной колбе доводят до метки изопропиловым спиртом, тщательно перемешивают и хроматографируют.
     
     3.3.2 Хроматографирование
     
     Полученные экстракты хроматографируют по 3.2.6 и 3.2.7. Примеры хроматограмм экстрактов витаминов А, Е из премиксов представлены в приложении А, рисунок А.1.
     
     При возникновении сомнений в правильности выбора пика (по объему или времени удержания), соответствующего витамину А(Е), необходимо в анализируемый экстракт внести небольшое количество одного из градуировочных растворов витамина А(Е) (объемное соотношение экстракт - раствор витамина А(Е) равно 10:2 (10:5). Увеличение высоты соответствующего пика по сравнению с высотой этого пика на хроматограмме, полученной до введения градуировочного раствора в анализируемый экстракт, свидетельствует, что этот пик соответствует витамину А(Е).
     
     3.4 Обработка результатов контроля
     
     Для определения содержания витаминов А, Е в премиксе проводят две экстракции и каждый экстракт хроматографируют два раза. Находят среднеарифметическое значение высоты пиков, выраженное в единицах оптической плотности или миллиметрах, и по градуировочному графику определяют содержание витаминов А, Е в международных единицах и миллиграммах соответственно.
     
     Содержание в премиксах витаминов А , Е , МЕ/г или мкг/г, определяют по формуле
     

,                                                                   (5)

     
где ,  - содержание витаминов А, Е, найденное по градуировочным графикам, соответственно ME, мкг;
     
      - масса навески премикса, г.
     
     Содержание в премиксе витамина А  или витамина Е , МЕ/г или мкг/г, при использовании коэффициента  вычисляют по формуле
     

,                                                             (6)

     
где  - коэффициент наклона градуировочного графика для витамина А, Е соответственно МЕ/е.о.п., мкг/е.о.п.;
     
     ,  - высота хроматографического пика витамина А, Е соответственно, е.о.п;
     
      - масса навески премикса, г.
     
     3.5 Оформление результатов контроля
     
     3.5.1 Результаты контроля витаминов в премиксе записывают в специальном журнале для регистрации анализов.
     
     3.5.2 Журнал ведется работником, на которого возложено проведение анализов по определению содержания витаминов в премиксах.
     
     В журнале регистрируют все пробы с обязательным заполнением следующих данных:
     
     - обозначения премикса и витамина, на который проводится анализ;
     
     - наименования предприятия-поставщика премикса;
     
     - массы партии;
     
     - даты отбора пробы;
     
     - фамилии и личной подписи лица, отобравшего пробу;
     
     - результата контроля;
     
     - фамилии и личной подписи лица, проводившего контроль.
     
     При необходимости в журнал могут быть включены дополнительные сведения.
     
     3.5.3 Записи должны вестись четко, аккуратно.
     
     3.6 Допустимая погрешность контроля
     
     Результат контроля вычисляют с точностью до первого десятичного знака и округляют до целого числа.
     
     За окончательный результат контроля принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности =0,95 не должны быть более 10% для витамина А и 15% для витамина Е относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях, при доверительной вероятности =0,95 расхождения не должны превышать 15% для витамина А и 20% для витамина Е соответственно.
     

    
     4 Определение витаминов A, D, E нормально-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографией

     
     Сущность метода заключается в омылении навески премикса водно-спиртовым раствором гидроокиси калия, экстракции витаминов A, D, Е гексаном с последующим определением витаминов на жидкостном хроматографе.
     
     Метод применим в диапазоне концентраций витамина А от 10 до 10000 международных единиц на 1 г премикса (МЕ/г), витамина D от 40 до 10000 МЕ/г, витамина Е от 10 до 10000 МЕ/г.
     
     4.1 Аппаратура, материалы и реактивы
     
     Хроматограф жидкостный с фотометрическим детектором и систематической погрешностью измерений не выше 10% отн.: Хром-900 (ЧСФР), Ликвохром (Венгрия), Цвет (РФ) и др. жидкостные хроматографы с аналогичными характеристиками.
     
     Колонка для хроматографии стеклянная или металлическая высотой 150 мм и диаметром 3 мм, заполненная сепароном S6X зернением 7 мкм.
     
     Спектрофотометр со спектральным диапазоном работы от 186 до 1100 нм.
     
     Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.
     
     Линейка измерительная металлическая.
     
     Секундомер механический.
     
     Испаритель ротационный ИР-1М на 2 дм или его аналоги.
     
     Баня водяная, обеспечивающая нагрев до 80-100 °С.
     
     Холодильники стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336.
     
     Колбы конические со шлифом вместимостью 250 см по ГОСТ 25336.
     
     Пипетки 1-1-1(2)-1 по ГОСТ 29169.
     
     Пипетки 1-1-1(2)-1(5) по ГОСТ 29227.
     
     Микрошприцы МШ-10М, МШ-50М по нормативному документу [5].
     
     Колбы мерные 2-25-1(2); 2-50-1(2); 2-100-1(2) по ГОСТ 1770.
     
     Воронки делительные вместимостью 200, 500 см по ГОСТ 25336.
     
     Цилиндры 1(2, 3, 4)-50; 1(2, 3, 4)-100; 1(2, 3, 4)-250; 1(2, 3, 4)-1000 по ГОСТ 1770.
     
     Пробирки с притертой пробкой 2-5-0,1(0,2); 2-10-0,1(0,2) по ГОСТ 1770.
     
     Воронки стеклянные диаметром 4-6 см по ГОСТ 25336.
     
     Склянки с притертой пробкой.
     
     Стеклянные палочки.
     
     Марля медицинская по ГОСТ 9412.
     
     Колонки стеклянные диаметром 2-4 см и высотой 80 см.
     
     Калия гидроокись по ГОСТ 24363.
     
     Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652 или ГОСТ 18300.
     
     Спирт этиловый абсолютированный для спектрофотометрии или по нормативному документу [6].
     
     Гексан по нормативному документу [7].
     
     Спирт изопропиловый (пропанол-2) по нормативному документу [2].
     
     Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166.
     
     Ретинол ацетат (витамин А) по нормативному документу [11].
     
     Эргокальциферол кристаллический (витамин D) по нормативному документу [13].
     
     -токоферолацетат (витамин Е) по нормативному документу [12].
     
     Алюминия окись для хроматографии, нейтральная по нормативному документу [8].
     
     Гидрохинон по ГОСТ 19627.
     
     Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
     
     Бумага универсальная индикаторная по нормативному документу [9].
     
     Фильтры обеззоленные (красная лента) по нормативному документу [10].
     
     Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.
     
     4.2 Порядок подготовки к проведению контроля
     
     4.2.1 Определение массовой концентрации масляного раствора витамина А по 3.2.5.
     
     4.2.2 Приготовление стандартного раствора витамина А
     
     Для приготовления стандартного раствора взвешивают (лучше на часовом стекле) навеску масляного препарата, необходимую для приготовления раствора с активностью витамина 10000 МЕ/см, переносят ее в мерную колбу вместимостью 25 см и растворяют в изопропиловом спирте. Раствор перемешивают и доводят до метки спиртом. Хранят холодильнике в емкости с притертой пробкой и используют в течение недели.
     
     4.2.3 Приготовление стандартного раствора витамина D
     
     Ампулу кристаллического эргокальциферола, содержащую 0,1000 г, помещают в мерную колбу вместимостью 100 см, доводят содержимое колбы до метки изопропиловым спиртом и перемешивают. Полученный раствор (1) содержит 40000 МЕ/см витамина D. Из него берут 1 см раствора, помещают в мерную колбу вместимостью 50 см, доводят до метки этим же спиртом и перемешивают. Полученный раствор (2) содержит 800 МЕ/см витамина D. Раствор хранят в плотно закрытой стеклянной посуде в холодильнике.
     
     4.2.4 Приготовление стандартного раствора витамина Е
     
     Навеску масляного препарата -токоферолацетата массой 0,0500 г переносят в мерную колбу вместимостью 25 см, растворяют в изопропиловом спирте, доводят им до метки и тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в емкости с притертой пробкой в течение одной недели.
     
     4.2.5 Подготовка растворителей
     
     Очистку растворителей, применяемых в хроматографии, проводят посредством перегонки, отбрасывая первую и последнюю фракции в количестве 1/10 от первоначального объема, или пропусканием через колонку, заполненную активированной окисью алюминия.
     
     Окись алюминия активируют при нагревании в течении 1 ч при температуре 400-450 °С. Колонку высотой 60-80 см и диаметром 2 см заполняют 80 г активированной окиси алюминия и пропускают через нее 700 см растворителя. Для проверки чистоты в колонку жидкостного хроматографа загружают 50 мкдм растворителя. В случае его загрязнения на хроматограмме появляются пики, соответствующие времени удерживания витаминов A, D, E.
     
     4.2.6 Приготовление водно-спиртового раствора гидроокиси калия с массовой долей 10%
     
     Растворяют 20 г гидроокиси калия в смеси из 20 см воды и 180 см этилового спирта. Раствор готовят непосредственно перед контролем.
     
     4.3 Порядок проведения контроля
     
     4.3.1 Омыление и подготовка к контролю стандартных растворов витаминов A, D, E
     
     В конические колбы вместимостью 250 см, снабженные обратным холодильником, помещают 1 см раствора [2] витамина D по 4.2.3, 0,25 см ретинолацетата и 0,2 см-токоферолацетата. Добавляют 0,1 г гидрохинона и 30 см 10%-ного водно-спиртового раствора гидроокиси калия. Подвергают омылению в течение 30 мин на водяной бане при температуре 85 °С. Содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры под струей холодной воды, добавляют 30 см дистиллированной воды и 30 см гексана. Полученную смесь тщательно перемешивают и сливают в делительную воронку вместимостью 200 см.
     
     После расслаивания нижний слой (водно-спиртовый) сливают в коническую колбу, а гексановый слой оставляют в делительной воронке. Эту операцию экстракции гексаном водно-спиртового слоя в конической колбе проводят еще дважды, каждый раз сливая в делительную воронку гексановый слой.
     
     Гексановые вытяжки объединяют и промывают в делительной воронке дистиллированной водой порциями по 30 см до нейтральной реакции среды (проверяют по индикаторной бумаге). Промытый экстракт переносят в сухую перегонную колбу, пропуская его через бумажный фильтр и слой безводного сульфата натрия (40-50 г). Делительную воронку и фильтрующий материал промывают свежими порциями гексана (20-30 см).
     
     Все гексановые растворы объединяют и помещают в колбу роторного испарителя. Температура водяной бани роторного испарителя 70 °С. После отгонки гексана сухой остаток растворяют в 3 см гексана и переносят в мерную предварительно откалиброванную пробирку с притертой пробкой. Раствор может храниться в темном месте при температуре 4-8 °С.
     
     4.3.2 Омыление и подготовка к хроматографированию образцов премиксов
     
     Навеску премикса массой 10 г взвешивают с погрешностью не более 0,0005 г, помещают в коническую колбу вместимостью 250 см, снабженную обратным холодильником. Добавляют антиоксидант (0,1 г гидрохинона), 50 см водно-спиртового раствора щелочи и подвергают омылению на водяной бане при температуре 82-85 °С в течение 30 мин.
     
     По окончании омыления содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры, добавляют 50 см дистиллированной воды и 50 см гексана, смесь тщательно перемешивают и дают отстояться. После расслаивания смеси гексановый слой осторожно сливают в делительную воронку вместимостью 500 см.
     
     Экстракцию гексаном повторяют дважды порциями по 50 см, последнюю фракцию переносят в делительную воронку, сливая содержимое колбы через воронку с марлевым слоем. Остаток на марле слегка отжимают стеклянной палочкой и выбрасывают. Воронку обмывают дистиллированной водой (около 50 см) в делительную воронку, в которой собраны гексановые вытяжки. Содержимое воронки промывают дистиллированной водой порциями по 50 см до нейтральной реакции среды (по индикаторной бумаге). Промытый экстракт переносят в сухую перегонную колбу, пропуская его через обеззоленный фильтр, заполненный безводным сульфатом натрия (около 50 г). Делительную воронку и фильтрующий материал промывают 40 см гексана. Отгоняют гексан на ротационном испарителе при температуре бани 70 °С. Сухой остаток растворяют в 3 см гексана, который добавляют порциями, чтобы перенести в предварительно откалиброванную пробирку с притертой пробкой.
     
     Полученный экстракт используют для хроматографического анализа.
     
     4.3.3 Подготовка жидкостного хроматографа к работе
     
     Подготовка хроматографа осуществляется в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора.
     
     Перед началом измерений хроматограф прогревают в течение 15 мин. Сначала проводят заполнение насоса элюентом. В качестве подвижной фазы используют смесь гексана с этанолом в объемном отношении 99,5:0,5. Устанавливают скорость элюирования, соответствующую эффективности колонки для конкретных премиксов от 0,5 до 2 см/мин. При определении витаминов А, Е устанавливают светофильтр длиной волны 289 нм, для определения витамина D - светофильтр длиной волны 254 нм. Скорость движения диаграммной ленты регистратора устанавливают равной 0,3-0,6 см/мин.
     
     После промывания колонки элюентом регистрирующий прибор должен показывать нулевую линию без дрейфа нуля. С целью повышения чувствительности и точности измерений для каждого хроматографа подбирают оптимальные условия хроматографирования.
     
     4.3.4 Проведение хроматографических измерений
     
     Для хроматографических измерений используют метод сравнения со стандартом. Сравнивают высоты хроматографических пиков для анализируемой пробы и пробы стандарта.
     
     В колонку последовательно вводят от 3 до 20 мкдм исследуемого раствора, стандартного раствора витамина А и стандартного раствора витамина Е. Получают соответствующие хроматограммы при длине волны фотометрического детектора 289 нм, приложение Б, рисунок Б.1. После этого меняют светофильтр, устанавливая рабочую длину волны 254 нм, и при этих условиях снимают хроматограммы для растворов анализируемой пробы и стандарта витамина D, приложение Б, рисунок Б.2.
     
     Высоты пиков, соответствующие времени удерживания витаминов A, D, E, измеряют металлической линейкой, как расстояние от вершины пика до линии, проведенной в основании пика. Значения высот пиков (в миллиметрах) используют для вычисления содержания витаминов A, D, Е в анализируемом образце.
     
     4.4 Обработка результатов контроля
     
     Содержание витамина А , МЕ/г, рассчитывают по формуле
     

,                                              (7)

     
где  - содержание витамина А в стандартном растворе, ME;
     
      - объем стандартного раствора витамина А, взятый на омыление, см;
     
      - объем мерной колбы с исходным стандартным раствором витамина А, см;
     
     ,  - объемы загрузки в колонку растворов пробы и стандарта, полученные после омыления, мкдм;
     
     ,  - объемы экстрактов пробы и стандарта после проведения подготовительных операций (омыление и т.д.), см;
     
      - высота пика витамина А на хроматограмме премикса, мм;
     
      - высота пика на хроматограмме для стандарта витамина А, мм;
     
      - масса навески премикса, г.
     
     Содержание витамина D, МЕ/г, рассчитывают по формуле
     

,                                             (8)

     
где  - содержание витамина D в стандартном препарате, ME;
     
      - объем стандартного раствора витамина D, взятый для последующего разбавления, см;
     
      - объем колбы со стандартным раствором витамина D, см;
     
      - объем стандартного раствора витамина D, взятый на омыление, см;
     
      - объем колбы со стандартным раствором витамина D после первого разведения, см;
     
     ,  - объемы загрузки в колонку омыленных растворов стандарта и пробы, мкдм;
     
     ,  - окончательные объемы растворов пробы и стандарта, подготовленные для хроматографии, см;
     
     ,  - соответствующие высоты пиков витамина D на хроматограммах стандарта и премикса, мм;
     
      - масса навески премикса, г.
     
     Примечание - При обогащении премиксов витамином D в числитель формулы следует вводить коэффициент 0,97 (отношение коэффициентов экстинций витамина D к D).
     
     
     Содержание витамина Е , мкг/г, рассчитывают по формуле
     

,                                          (9)

     
где  - масса навески -токоферола-стандарта, мкг;
     
      - объем стандартного раствора витамина Е, взятый на омыление, см;
     
      - объем мерной колбы со стандартным раствором витамина Е, см;
     
     ,  - объемы загрузки растворов пробы и стандарта в хроматографическую колонку, мкдм;
     
     ,  - окончательные объемы растворов пробы и стандарта, подготовленные для хроматографии, см;
     
     ,  - высоты пиков витамина Е на хроматограммах стандарта и премикса, мм;
     
      - масса навески премикса, г.
     
     Результат контроля вычисляют с точностью до первого десятичного знака и округляют до целого числа.
     
     За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение двух или более параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности =0,95 не должны превышать 10% относительно среднеарифметического значения.
     
     Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, при доверительной вероятности =0,95 не должно превышать 20% по отношению к среднеарифметическому значению результатов измерений.     
     
     

ПРИЛОЖЕНИЕ А
(справочное)

Хроматограммы экстрактов витаминов А, Е

 
Рисунок А.1 - Хроматограммы экстрактов витаминов А, Е из премикса

     

ПРИЛОЖЕНИЕ Б
(справочное)

Хроматограммы экстрактов витаминов A, D, Е

     
Рисунок Б.1 - Хроматограммы экстрактов витаминов А, Е из премикса при длине волны 289 нм

Рисунок Б.2 - Хроматограммы экстрактов стандарта витамина D из премикса при длине волны 254 нм

     
     
ПРИЛОЖЕНИЕ В
(справочное)

Библиография

     
     [1] ТУ 25-05.2830-83 Жидкостный хроматограф "Милихром"
     
     [2] ТУ 6.09-402-87 2-пропанол (изопропиловый спирт химически чистый)
     
     [3] ТУ 6-09-6628-70 Пропиловый спирт (пропанол-1)
     
     [4] ТУ 6-09-06-1092-83 Ацетонитрил. Технические условия
     
     [5] ТУ 2.833.104-85 Микрошприцы
     
     [6] ТУ 84-11-99-89 Этиловый абсолютированный спирт
     
     [7] ТУ 6-09-3375-78 Гексан
     
     [8] ТУ 6-09-3916-85 Окись алюминия для хроматографии
     
     [9] ТУ 6-09-1181-89 Бумага индикаторная универсальная для определения рН 1-10 и 7-14
     
     [10] ТУ 6-09-1678-86 Фильтры обеззоленные (белая, красная, синяя ленты)
     
     [11] ГФ СССР-X ст. 579 Раствор ретинола ацетата 3,44; 6,88 или 8,60% в масле
     
     [12] ГФ СССР-X ст. 695 Токоферола ацетат (витамина Е ацетат)
     
     [13] ГФ СССР-X ст. 627 Эргокальциферол кристаллический (витамин D)
     
     
     
Текст документа сверен по:
официальное издание
Комбикорма. Часть 5. Корма.
Комбикорма. Комбикормовое сырье.
Премиксы. Методы анализа: Сб. ГОСТов. -
М.: ИПК Издательство стандартов, 2002