ГОСТ Р 52147-2003

Группа С19

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

БЕЛКОВО-ВИТАМИННО-МИНЕРАЛЬНЫЕ И АМИДО-ВИТАМИННО-МИНЕРАЛЬНЫЕ ДОБАВКИ

Методы определения содержания ретинола-ацетата (витамина А),
эргокальциферола (холекальциферола) (витамина D),
токоферола-ацетата (витамина Е)

Protein-vitamin-mineral and amide-vitamin-mineral additives.
Methods for the determination of retinol-acetate (vitamin A), argocalciferol
(holecalciferol) (vitamin D), tokoferol-acetate (vitamin E)

     
     
ОКС 65.120
ОКСТУ 9209

Дата введения 2005-01-01

Предисловие

     
     1 РАЗРАБОТАН Открытым акционерным обществом "Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности" (ОАО "ВНИИКП");
     
     Всероссийским научно-исследовательским и технологическим институтом птицеводства (ВНИТИП);
     
     Всероссийским научно-исследовательским институтом кормов им. В.Р.Вильямса (ВНИИК)
     
     ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 4 "Комбикорма, белково-витаминные добавки, премиксы"
     
     2 ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 3 декабря 2003 г. N 342-ст
     
     3 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
     
     

     1 Область применения

     
     Настоящий стандарт распространяется на белково-витаминно-минеральные и амидо-витаминно-минеральные добавки и устанавливает хроматографические методы определения ретинола-ацетата (витамина А), эргокальциферола (холекальциферола) (витамина D), токоферола-ацетата (витамина Е)
     
     

     2 Нормативные ссылки

     
     В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:
     
     ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
     
     ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
     
     ГОСТ 12.1.018-93 Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования
     
     ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура средств защиты
     
     ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
     
     ГОСТ 4147-74 Железо (III) хлорид 6-водный. Технические условия
     
     ГОСТ 4166-76 Натрий сернокислый. Технические условия
     
     ГОСТ 4517-87 Реактивы. Методы приготовления вспомогательных реактивов и растворов, применяемых при анализе
     
     ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
     
     ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование фарфоровые. Технические условия
     
     ГОСТ 9736-91 Приборы электрические прямого преобразования для измерения неэлектрических величин. Общие технические требования и методы испытаний
     
     ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
     
     ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб
     
     ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия
     
     ГОСТ 19627-74 Гидрохинон (парадиоксибензол). Технические условия
     
     ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования
     
     ГОСТ 24363-80 Калия гидроокись. Технические условия
     
     ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
     
     ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний
     
     ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой
     
     ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
     
     ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия
     
     

     3 Определения

     
     В настоящем стандарте применяют следующие термины с соответствующими определениями.
     
     3.1 Содержание витамина А: Содержание ретинола-ацетата, определенное в соответствии с настоящим стандартом и выраженное в международных единицах в 1 кг испытуемой пробы (МЕ/кг). 1 ME витамина А соответствует 0,344 мкг ретинола-ацетата.
     
     3.2 Содержание витамина Е: Содержание токоферола-ацетата, определенное в соответствии с настоящим стандартом и выраженное в миллиграммах в 1 кг (мг/кг) испытуемой пробы.
     
     3.3 Содержание витамина D: Содержание эргокальциферола (витамина ) или холекальциферола (витамина ), определенное в соответствии с настоящим стандартом и выраженное в международных единицах в 1 кг испытуемой пробы (МЕ/кг). 1 ME витамина D соответствует 0,025 мкг эргокальциферола (холекальциферола).
     
     

     4 Диапазоны измерений содержания витаминов и характеристики погрешности измерений

     
     Диапазоны измерений содержания витаминов и характеристики погрешности измерений приведены в таблице 1.
     
     
Таблица 1
     

 5 Требования техники безопасности

     
     5.1 При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и ГОСТ 12.1.018 и электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на фотоэлектроколориметр, спектрофотометр и хроматограф.
     
     5.2 Помещение, в котором проводят измерения, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией. Работу необходимо проводить в вытяжном шкафу.
     
     5.3 При работе с газовыми баллонами необходимо руководствоваться НД [1].
     
     

     6 Подготовка проб к испытанию

     
     6.1 Отбор проб - по ГОСТ 13496.0.
     
     6.2 Измельчение пробы
     
     6.2.1 Оборудование:
     
     мельница лабораторная электрическая, обеспечивающая измельчение пробы до прохода остатка через сито с отверстиями диаметром 1 мм;
     
     сито с отверстиями диаметром 1 мм.
     
     6.2.2 Из средней пробы исследуемого продукта методом квартования выделяют часть пробы массой не менее 100 г и измельчают на лабораторной мельнице до такого состояния, чтобы весь продукт проходил через сито с отверстиями диаметром 1 мм без остатка. Размолотую пробу тщательно перемешивают.
     
     

     7 Определение содержания ретинола-ацетата (витамина А) и токоферола-ацетата (витамина Е) фотометрическим методом

     
     Сущность метода заключается в омылении образца водно-спиртовым раствором гидроокиси калия, экстракции витаминов диэтиловым эфиром, разделении витаминов хроматографией на колонке с окисью алюминия и количественном определении витаминов фотометрическим методом.
     
     7.1 Аппаратура, материалы и реактивы
     
     Весы лабораторные высокого класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.
     
     Спектрофотометр типа СФ-26, СФ-46 со спектральным диапазоном работы 186-1100 нм, основной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1%, градуировкой длин волн в ультрафиолетовой (УФ) области - не более 0,1 нм.
     
     Фотоэлектроколориметр с пределом измерений оптической плотности от 0 до 2, основной погрешностью измерений не более 1% и светофильтром длиной волны =(520±25) нм.
     
     Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.
     
     Баллон с азотом рабочим давлением от 40 до 60 кг/см (от 4 до 6 МПа) [1].
     
     Испаритель ротационный диапазоном измерения рабочего давления от 7 до 760 мм рт.ст. (от 9·10 до 10·10 Па) или насос водоструйный по ГОСТ 25336.
     
     Баня водяная с регулятором нагрева.
     
     Термометр жидкостный по ГОСТ 28498.
     
     Печь муфельная электрическая, обеспечивающая поддержание температуры от 0 до 800 °С с погрешностью ±10 °С по ГОСТ 9736.
     
     Секундомер [2].
     
     Чашки выпарительные фарфоровые диаметром 123 мм по ГОСТ 9147.
     
     Щипцы для тиглей муфельные.
     
     Лампа ультрафиолетовая со светофильтрами =260-350 нм.
     
     Шкаф сушильный, обеспечивающий поддержание температуры от 0 °С до 110 °С с погрешностью ±2 °С [3].
     
     Холодильники стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336.
     
     Колбы конические со шлифом -1-100(250)-24/29 по ГОСТ 25336.
     
     Колбы мерные 1(2)-50(100, 200)-2 по ГОСТ 1770.
     
     Воронки делительные вместимостью 250, 500 см по ГОСТ 25336.
     
     Цилиндры мерные 1(2, 2а, 3, 4, 4а)-25(100, 250)-2 по ГОСТ 1770.
     
     Воронки для фильтрования ВФ-1-56(75)ХС по ГОСТ 25336.
     
     Пипетки с одной отметкой 1-2-0,5(1,2) по ГОСТ 29169.
     
     Пипетки градуированные 1(2, 3, 5)-1(1а, 2, 2а)-2-0,5(1, 2, 5) по ГОСТ 29227.
     
     Пробирки мерные с притертыми пробками П-1(2)-5(10)-0,1(0,2)ХС по ГОСТ 1770.
     
     Склянки из темного стекла.
     
     Колбы с тубусом вместимостью 250 см по ГОСТ 25336.
     
     Колбы круглодонные К-1-100(250)-14/23(19/26) по ГОСТ 25336.
     
     Колонки стеклянные для хроматографии размером 10х200 мм.
     
     Эксикатор по ГОСТ 25336, заправленный хлористым кальцием, прокаленным при температуре 250-300 °С в течение 2 ч.
     
     Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026 или фильтры [4].
     
     Вата обезжиренная, готовят по ГОСТ 4517.
     
     Палочки деревянные.
     
     Витамин Е фармакопейный [5].
     
     Спирт этиловый абсолютированный [6] или приготовленный по ГОСТ 4517.
     
     Железо хлорное, раствор массовой долей около 0,2% в абсолютированном этиловом спирте.
     
     Калия гидроокись по ГОСТ 24363, раствор массовой долей 50%.
     
     Натрий сернокислый по ГОСТ 4166, безводный.
     
     Алюминия окись, безводная [7].
     
     Эфир петролейный, фракция (40-70) °С, не содержащая ненасыщенные и ароматические углеводороды.
     
     Эфир диэтиловый фармакопейный, не содержащий пероксидные соединения (испытание на отсутствие пероксидных соединений - по ГОСТ 4517).
     
     Пирогаллол или гидрохинон по ГОСТ 19627.
     
     Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652.
     
     -фенантролин или , -дипиридил, раствор массовой долей около 0,5% в абсолютированном этиловом спирте.
     
     Кислота аскорбиновая [8].
     
     Фенолфталеин [9], спиртовый раствор массовой долей 1%.
     
     Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
     
     Примечания
     1 Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками, а также материалов и реактивов по качеству не ниже вышеуказанных.
     
     2 Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.
     
     
     7.2 Подготовка к испытанию
     
     7.2.1 Приготовление раствора хлорного железа массовой долей около 0,2% в абсолютированном спирте.
     
     Навеску реактива массой 0,2 г растворяют в 99,8 см абсолютированного этилового спирта.
     
     Раствор хранят в холодильнике в склянке из темного стекла не более 7 сут.
     

     7.2.2 Приготовление раствора -фенантролина или , -дипиридила массовой долей около 0,5% в абсолютированном этиловом спирте

     
     Навеску реактива массой 0,500 г растворяют в 99,5 см абсолютированного этилового спирта.
     
     Раствор хранят в холодильнике в склянке из темного стекла не более 7 сут.
     
     7.2.3 Приготовление безводного сернокислого натрия
     
     Реактив высушивают в сушильном шкафу при температуре (105±2) °С в течение 3 ч, хранят в склянке с притертой пробкой.
     
     7.2.4 Приготовление окиси алюминия
     
     Реактив прокаливают в муфельной печи при температуре (400±10) °С в течение 4 ч, охлаждают до комнатной температуры в эксикаторе. К 97 г реактива добавляют 3 см дистиллированной воды и тщательно перемешивают.
     
     После отстаивания в течение не менее 3 ч реактив годен к использованию.
     
     Реактив хранят в склянке с притертой пробкой.
     
     7.2.5 Приготовление раствора -токоферола массовой концентрации 1 мг/см

     Навеску токоферола-ацетата массой 0,1120 г в расчете на содержание чистого вещества помещают в круглодонную колбу со шлифом вместимостью 250 см добавляют от 100 до 200 мг аскорбиновой кислоты, 50 см этилового спирта и 10 см раствора гидроокиси калия массовой долей 50%. Колбу соединяют с обратным холодильником и нагревают в водяной бане при температуре (85±2) °С в течение 25 мин. Затем содержимое колбы быстро охлаждают под струей водопроводной воды до комнатной температуры, переносят в делительную воронку вместимостью 250 см, приливают по 50 см дистиллированной воды и диэтилового эфира, встряхивают и отстаивают до разделения слоев.
     
     После расслаивания нижний водно-спиртовый слой сливают в коническую колбу, а эфирный слой оставляют в делительной воронке. В коническую колбу приливают 50 см диэтилового эфира, встряхивают, отстаивают и после расслаивания верхний эфирный слой присоединяют к эфирному экстракту в делительной воронке, а к водно-спиртовому слою в конической колбе снова приливают 50 см диэтилового эфира и проводят экстракцию, как было указано выше. После расслаивания эфирный слой из конической колбы снова присоединяют к экстракту в делительной воронке.
     
     Объединенные эфирные экстракты промывают дистиллированной водой порциями по 30 см до исчезновения розовой окраски промывных вод по реакции с фенолфталеином. Промытый экстракт переносят в коническую колбу вместимостью 250 см, пропуская его через бумажный фильтр и слой безводного сернокислого натрия (10-15 г). После окончания фильтрации сернокислый натрий три раза промывают порциями (по 20-30 см) диэтилового эфира. Эфир отгоняют в водяной бане при температуре не выше 50 °С в токе азота или под вакуумом, используя водоструйный насос или роторный испаритель.
     
     К сухому остатку приливают 10-15 см абсолютированного этилового спирта, количественно переносят раствор в мерную колбу вместимостью 100 см, доводят объем в колбе до метки этим же спиртом и тщательно перемешивают.
     
     7.2.6 Приготовление раствора -токоферола массовой концентрации 20 мкг/см
     
     1 см раствора -токоферола массовой концентрации 1 мг/см переносят в мерную колбу вместимостью 50 см, доводят объем в колбе абсолютированным спиртом до метки и тщательно перемешивают.
     
     В полученном растворе проверяют массовую концентрацию -токоферола и его чистоту, снимая спектр в пределах 260-310 нм на спектрофотометре в кювете толщиной поглощающего свет слоя 1 см относительно абсолютированного этилового спирта. Чистый -токоферол имеет симметричный пик максимумом поглощения при длине волны 292 нм.
     
     Массовую концентрацию -токоферола в растворе , мкг/см, вычисляют по формуле
     

,                                                                   (1)

где  - оптическая плотность раствора при длине волны 292 нм;
     
      - коэффициент пересчета граммов в микрограммы;
     
      - оптическая плотность раствора -токоферола в абсолютированном этиловом спирте массовой концентрации 1 г в 100 см при длине волны 292 нм и толщине поглощающего свет слоя 1 см (для -токоферола =75).
     
     7.2.7 Построение градуировочного графика для определения токоферола-ацетата (витамина Е)
     
     В пять мерных пробирок вместимостью по 5 см приливают 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 и 4,0 см раствора -токоферола массовой концентрации 20 мкг/см. В первые четыре пробирки добавляют 3,5; 3,0; 2,0 и 1,0 см абсолютированного этилового спирта. Затем в пробирки добавляют по 0,5 см раствора -фенантролина и по 0,5 см раствора хлорного железа, перемешивают. Ставят опытную пробу в темное место на 5 мин для развития окраски. По истечении времени измеряют оптические плотности испытуемых растворов в порядке возрастания их концентрации на фотоэлектроколориметре в кювете толщиной поглощающего свет слоя 10 мм при длине волны (520±25) нм относительно абсолютированного этилового спирта. Одновременно проводят контрольное испытание на реактивы без внесения -токоферола.
     
     По полученным данным строят градуировочный график, откладывая на оси ординат значения разности оптической плотности испытуемых растворов и контрольного раствора, на оси абсцисс - содержание -токоферола, мкг/5 см (10, 20, 40, 60 и 80 мкг/5 см)
     
     7.2.8 Приготовление элюирующих растворов
     
     7.2.8.1 Приготовление раствора I
     
     В мерную колбу вместимостью 100 см вносят 6 см диэтилового эфира и объем жидкости в колбе доводят до метки петролейным эфиром, перемешивают.
     
     7.2.8.2 Приготовление раствора II
     В мерную колбу вместимостью 100 см вносят 12 см диэтилового эфира и объем жидкости в колбе доводят до метки петролейным эфиром, перемешивают.
     
     7.2.8.3 Приготовление раствора III
     
     В мерную колбу вместимостью 100 см вносят 30 см диэтилового эфира и объем жидкости в колбе доводят до метки петролейным эфиром, перемешивают.
     
     7.3 Проведение испытаний
     

     Из-за высокой чувствительности витаминов к ультрафиолетовому свету и воздуху все процедуры, связанные с анализом, следует завершить в течение одного рабочего дня, избегая воздействия натурального и интенсивного флуоресцентного света.
     
     7.3.1 Омыление и экстракция
     
     Навеску исследуемого продукта массой 4,00-5,00 г помещают в круглодонную колбу со шлифом вместимостью 250 см, приливают 50 см этилового спирта, 10 см раствора гидроокиси калия массовой долей 50% и добавляют 40-50 мг пирогаллола или гидрохинона (на кончике скальпеля).
     
     Колбу соединяют с обратным холодильником, помещают в водяную баню и нагревают при температуре (85±2) °С в течение 25 мин, периодически перемешивая содержимое колбы. После этого содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры.
     
     Затем в колбу приливают 20-25 см дистиллированной воды, 50 см диэтилового эфира, перемешивают, жидкую часть сливают в делительную воронку вместимостью 500 см, сохраняя осадок в колбе. Экстракцию витаминов диэтиловым эфиром проводят трижды по 7.2.5.
     
     При образовании устойчивой эмульсии в делительную воронку добавляют 20 см этилового спирта.
     
     В объединенный эфирный экстракт добавляют несколько кристаллов бутилокситолуола и промывают его дистиллированной водой порциями по 100 см до исчезновения розовой окраски промывных вод по реакции с фенолфталеином. Затем экстракт переносят в круглодонную колбу, пропуская его через бумажный фильтр со слоем безводного сернокислого натрия (30-50 г). Делительную воронку и фильтрующий материал промывают 40 см диэтилового эфира. Эфир выпаривают досуха в водяной бане при температуре не выше 50 °С в токе азота или под вакуумом на ротационном испарителе. Сухой остаток растворяют в 4 см петролейного эфира.
     
     Примечание - Допускается для экстракции применять петролейный эфир.
     
     
     7.3.2 Подготовка хроматографической колонки
     
     В нижнюю часть колонки помещают кусочек ваты, затем активированную окись алюминия, уплотняя ее постукиванием по колонке деревянной палочкой до высоты сорбента 7 см. Сверху помещают слой безводного сернокислого натрия высотой 1 см.
     
     В колбу с тубусом вставляют резиновую пробку, через сквозное отверстие которой проходит утонченный конец хроматографической колонки. Через колонку при вакууме, создаваемом с помощью водоструйного насоса пропускают петролейный эфир до полного смачивания слоя окиси алюминия (около 15 см).
     
     Промывание колонки проводят со скоростью одна капля в секунду, не допуская при этом высыхания верха колонки и просасывания воздуха.
     
     7.3.3 Хроматографическое разделение ретинола и -токоферола
     
     4 см раствора экстракта испытуемого продукта, полученного по 7.3.1, помещают в колонку, подготовленную по 7.3.2, не допуская высыхания верха колонки. Промывают колонку 15 см элюирующего раствора I. Эту фракцию отбрасывают.
     
     -токоферол элюируют от 15 до 25 см раствора II, контролируя продвижение витамина в УФ свете (-токоферол имеет голубоватое свечение).
     
     Элюат количественно переносят в коническую колбу вместимостью 50 см.
     
     К колонке присоединяют другую колбу с тубусом и элюируют ретинол 30-35 см раствора III, также контролируя продвижение витамина в УФ-свете (ретинол имеет желто-зеленое свечение). Элюат количественно переносят в коническую колбу вместимостью 50 см и выпаривают досуха в водяной бане при температуре не выше 50 °С в токе азота или под вакуумом.
     
     Сухой остаток растворяют в 5-50 см абсолютированного этилового спирта в зависимости от предполагаемого содержания витамина А.
     
     7.3.4 Оптическую плотность полученного раствора ретинола измеряют на спектрофотометре при длине волны 326 нм в кювете толщиной поглощающего свет слоя 10 мм относительно абсолютированного этилового спирта.
     
     7.3.5 Проведение цветной реакции с раствором -токоферола
     
     Собранный и перенесенный в коническую колбу элюат -токоферола выпаривают досуха на водяной бане при температуре не выше 50 °С в токе азота или под вакуумом. Остаток растворяют в 10 см абсолютированного этилового спирта. Ориентируясь на рецептуру добавки, берут 0,2-3,5 см раствора и переносят в кювету толщиной поглощающего свет слоя 10 мм или в мерную пробирку вместимостью 5 см, добавляют соответственно от 3,8 до 0,5 см абсолютированного этилового спирта, 0,5 см раствора -фенантролина и 0,5 см раствора хлорного железа. Опытную пробу ставят в темное место на 5 мин для развития окраски. По истечении времени измеряют оптическую плотность испытуемого раствора на фотоэлектроколориметре при длине волны (520±25) нм относительно абсолютированного этилового спирта.
     
     Одновременно проводят контрольное испытание на реактивы без внесения -токоферола.
     
     7.4 Обработка и оформление результатов
     
     7.4.1 Содержание ретинола-ацетата , МЕ/кг, в испытуемой пробе вычисляют по формуле
     

,                                                                     (2)

     
где 18,3 - массовая концентрация раствора ретинола в абсолютированном этиловом спирте, имеющего оптическую плотность, равную 1, при длине волны 326 нм и толщине поглощающего свет слоя 1 см, МЕ/см;
     
     - объем элюата (5-50), см;
     
      - оптическая плотность раствора;
     
     10 - коэффициент пересчета граммов в килограммы;
     
      - масса навески, г;
     
     1,15 - коэффициент пересчета ретинола в ретинол-ацетат.
     
     7.4.2 Содержание токоферола-ацетата , мг/кг, в испытуемой пробе вычисляют по формуле
     

,                                                                          (3)

     
где  - масса -токоферола, найденная по градуировочному графику, мкг;
     
      - объем раствора элюата (10), см;
     
     10 - коэффициенты пересчета микрограммов в миллиграммы и граммов в килограммы;
     
     1,1 - коэффициент пересчета -токоферола в ацетатную форму;
     
      - масса навески, г;
     
      - объем раствора, взятый для проведения цветной реакции (0,2-3,5), см.
     
     7.4.3 Результат вычисляют до третьей значащей цифры и округляют до двух значащих цифр.
     
     7.4.4 При анализе каждой пробы выполняют два параллельных определения, начиная со взятия навески испытуемой пробы. Если расхождение между результатами параллельных определений не превышает допустимое , где ,  и  - результат первого и второго параллельных определений и их среднеарифметическое значение соответственно, то среднеарифметическое значение принимают за результат анализа. В противном случае анализ повторяют.
     
     Если расхождения между параллельными определениями вновь превышают регламентируемые допуски, выясняют и устраняют причины плохой сходимости результатов анализа.
     
     Значения  приведены в таблице 2.
     
     
Таблица 2
     

     
     
     По полученному результату анализа и значению относительной погрешности (таблица 1) рассчитывают абсолютную погрешность  по формуле
     

.

     Результат анализа представляют в виде  МЕ/кг или  мг/кг при =0,95.
     
     

     8 Определение содержания ретинола-ацетата (витамина А), эргокальциферола (холекальциферола) (витамина D), токоферола-ацетата (витамина Е) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

     
     Сущность метода заключается в омылении образца водно-спиртовым раствором гидроокиси калия, экстракции витаминов диэтиловым эфиром с последующим определением витаминов на жидкостном хроматографе.
     
     При содержании витамина D в испытуемом продукте менее 10 МЕ/г перед проведением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) необходима очистка экстракта на колонке с окисью алюминия по 8.3.2. Анализ проводят из отдельно взятой навески массой 10 г.
     
     8.1 Аппаратура, материалы и реактивы
     
     Аппаратура, материалы и реактивы по 7.1 со следующим дополнением.
     
     Хроматограф жидкостный "Милихром" с УФ-детектором со спектральным диапазоном 190-360 нм, обеспечивающий одновременное измерение на не менее 3 длинах волн с уровнем шумов не более 10 единиц оптической плотности (е.о.п.).
     
     Колонка аналитическая хроматографическая для ВЭЖХ, размером 80 (64, 120)х2 мм, заполненная сорбентом Силасорб 600 (размер частиц 5 мкм) с эффективностью не ниже 5000 теоретических тарелок.
     
     Прибор для перегонки при атмосферном давлении [10].
     
     Ретинол-ацетат (витамин А) фармакопейный [11].
     
     Эргокальциферол кристаллический (витамин ) [12] или холекальциферол кристаллический (витамин ) [13].
     
     Спирт изопропиловый [14].
     
     Гексан [15].
     
     Алюминия окись для хроматографии [16].
     
     2,6-Ди-трет-бутил-п-крезол (бутиолокситолуол) [17].
     
     Примечание - Допускается применение других типов хроматографов, сорбентов и соответствующих им растворителей, обеспечивающих эффективное разделение исследуемых компонентов. При этом условия разделения витаминов подбираются самостоятельно каждым пользователем.
     
     
     8.2 Подготовка к испытанию
     
     8.2.1 Приготовление элюирующего раствора
     
     Готовят смесь гексана с изопропиловым спиртом в объемном соотношении 98,5:1,5 (98:2)
     
     8.2.2 Очистка изопропилового спирта
     
     Изопропиловый спирт перегоняют над гидроокисью калия или натрия (10 г гидроокиси требуется для перегонки 1 дм спирта).
     
     Реактив должен иметь оптическую плотность не более 0,1 е.о.п. при =320-350 нм относительно дистиллированной воды.
     
     8.2.3 Приготовление окиси алюминия
     
     Реактив прокаливают в муфельной печи при температуре (750±10) °С в течение 4 ч, охлаждают до комнатной температуры в эксикаторе. К 91 г реактива добавляют 9 см дистиллированной воды, тщательно перемешивают и хранят в посуде с притертой пробкой.
     
     Годен для использования после отстаивания в течение 3 ч.
     
     8.2.4 Приготовление безводного сернокислого натрия по 7.2.3
     
     8.2.5 Приготовление растворов ретинола
     
     8.2.5.1 Приготовление раствора ретинола массовой концентрации 1000 МЕ/см.
     
     Навеску ретинола-ацетата, соответствующую 50000 ME препарата, помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 см, добавляют около 200 мг пирогаллола или гидрохинона (на кончике скальпеля), 30 см этилового спирта и 5 см раствора гидроокиси калия массовой долей 50%. Колбу соединяют с обратным холодильником и проводят омыление в водяной бане при температуре (85±2) °С в течение 30 мин, охлаждают до комнатной температуры под струей водопроводной воды и добавляют 15 см дистиллированной воды. Затем содержимое колбы переносят в делительную воронку вместимостью 250 см, промывают колбу 20 см этилового спирта, который тоже переносят в делительную воронку. Добавляют 30 см смеси диэтилового эфира и гексана в объемном соотношении 1:1, полученную смесь тщательно перемешивают. После расслаивания нижний слой (водно-спиртовый) сливают в коническую колбу, а гексано-эфирный оставляют в делительной воронке. Эту операцию экстракции ретинола гексано-эфирной смесью из водно-спиртового слоя в конической колбе проводят еще дважды по 7.2.5, каждый раз сливая в делительную воронку гексано-эфирный слой. Объединенный экстракт в делительной воронке промывают дистиллированной водой порциями по 30 см до исчезновения розовой окраски промывных вод по реакции с раствором фенолфталеина. Промытый экстракт переносят в коническую колбу вместимостью 250 см, пропуская его через бумажный фильтр и слой безводного сернокислого натрия (40-50 г). Делительную воронку и фильтрующий материал промывают дважды порциями гексано-эфирной смеси (20-30 см). Экстракт выпаривают досуха в водяной бане при температуре не выше 60 °С в токе азота или под вакуумом на ротационном испарителе. Сухой остаток растворяют в гексане, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см, добавляют 100 мг бутилокситолуола, перемешивают, объем раствора в колбе доводят гексаном до метки и снова тщательно перемешивают.
     
     8.2.5.2 Приготовление градуировочных растворов ретинола массовой концентрации 20, 100 и 500 МЕ/см
     
     В три мерные колбы вместимостью по 50 см помещают 1; 5 и 25 см раствора ретинола массовой концентрации 1000 МЕ/см, доводят объемы растворов в колбах до метки гексаном и тщательно перемешивают.
     
     Оптическую плотность растворов измеряют на спектрофотометре при длине волны 326 нм в кювете толщиной поглощающего свет слоя 1 см относительно гексана.
     
     Массовую концентрацию ретинола в растворе , МЕ/см вычисляют по формуле
     

,                                                                     (4)

     
где  - оптическая плотность раствора ретинола;
     
      - коэффициент пересчета граммов в микрограммы;
     
      - оптическая плотность раствора ретинола в гексане массовой концентрации 1 г в 100 см при длине волны 326 нм и толщине поглощающего свет слоя 1 см (для ретинола =1830);
     
     0,3 - коэффициент пересчета массы ретинола в ME, мкг/МЕ.
     
     8.2.6 Приготовление растворов -токоферола
     
     8.2.6.1 Приготовление раствора -токоферола массовой концентрации 1000 мкг/см

     Навеску витамина Е массой 0,1120 г в расчете на содержание чистого вещества помещают в круглодонную колбу со шлифом вместимостью 250 см и проводят омыление, экстракцию и обезвоживание по 7.2.5.
     
     После выпаривания сухой остаток растворяют в 100 см гексана.
     
     8.2.6.2 Приготовление градуировочных растворов -токоферола массовой концентрации 20, 100 и 500 мкг/см
     
     В три мерные колбы вместимостью 50 см помещают 1; 5 и 25 см раствора -токоферола массовой концентрации 1000 мкг/см, доводят объем раствора в колбах до метки гексаном и тщательно перемешивают.
     
     Массовые концентрации -токоферола в растворах проверяют спектрофотометрически по 7.2.6 и вычисляют по формуле 1.
     
     8.2.7 Приготовление растворов витамина D
     
     8.2.7.1 Приготовление раствора витамина D массовой концентрации 20000 МЕ/см

     Навеску кристаллического эргокальциферола (холекальциферола) массой 0,100 г помещают в мерную колбу вместимостью 200 см, растворяют в гексане, объем раствора в колбе доводят до метки гексаном и тщательно перемешивают.
     
     8.2.7.2 Приготовление градуировочных растворов витамина D массовой концентрации 50 и 100 МЕ/см
     
     В две мерные колбы вместимостью 200 см помещают 0,5 и 1,0 см раствора витамина D массовой концентрации 20000 МЕ/см. Объемы растворов в колбах доводят до метки гексаном и тщательно перемешивают.
     
     Оптическую плотность растворов измеряют на спектрофотометре при длине волны 265 нм в кювете толщиной поглощающего свет слоя 1 см относительно гексана.
     
     Массовую концентрацию витамина D в растворе , МЕ/см, вычисляют по формуле
     

,                                                                  (5)

где  - оптическая плотность раствора витамина D;
     
      - коэффициент пересчета граммов в микрограммы;
     
      - оптическая плотность раствора витамина D в гексане массовой концентрации 1 г в 100 см раствора при длине волны 265 нм и толщине поглощающего свет слоя 1 см (для витамина  =465; для витамина  =500);
     
     0,025 - коэффициент пересчета массы витамина D в ME, мкг/МЕ.
     
     8.2.8 В растворы витаминов добавляют несколько кристаллов 2,6-ди-трет-бутил-п-крезола (бутиолокситолуола) и хранят в холодильнике не более 1 мес.
     
     8.3 Проведение испытания
     
     8.3.1 Омыление и экстракция
     
     Навеску исследуемого продукта массой 5,00-10,00 г помещают в круглодонную колбу со шлифом вместимостью 250 см, добавляют 100-150 мг пирогаллола или гидрохинона (на кончике скальпеля) и соответственно 50-70 см этилового спирта и 10-15 см раствора гидроокиси калия массовой долей 50%. Дальнейшую процедуру омыления и экстракции проводят по 7.3.1. Сухой остаток витаминов растворяют в 4 см гексана.
     
     Примечание - Допускается для экстракции применять петролейный эфир.
     
     
     8.3.2 Очистка раствора, полученного по 8.3.1, на колонке с окисью алюминия
     
     8.3.2.1 Подготовка хроматографической колонки - по 7.3.2.
     
     8.3.2.2 Элюирование витамина D
     
     В колонку (8.3.2.1), не допуская высыхания верха колонки, вносят 4 см раствора (8.3.1) и промывают ее 20 см петролейного эфира и 4 см смеси петролейного и диэтилового эфира в объемном соотношении 1:1. Эту фракцию отбрасывают.
     
     Витамин D элюируют 20 см смеси петролейного и диэтилового эфира в объемном соотношении 1:1. Элюат количественно переносят в коническую колбу вместимостью 50 см и выпаривают досуха в водяной бане под током азота при температуре (60±2) °С.
     
     Сухой остаток растворяют в 1 см гексана.
     
     Полученный раствор (далее испытуемый раствор) используют для ВЭЖХ.
     
     8.3.3 Подготовка жидкостного хроматографа к работе
     
     Подготовку прибора осуществляют в соответствии с инструкцией по эксплуатации.
     
     Перед началом работы колонку промывают элюентом при скорости его подачи 100-200 мкдм/мин в течение 5-10 мин.
     
     8.3.4 Выполнение измерений на хроматографе "Милихром"
     
     8.3.4.1 Условия проведения измерений
     
     Измерения проводят в следующих условиях:
     
     а) разделение компонентов проводят на колонке размером 64 (80, 120)х2 мм;
     
     б) сорбент - Силосорб 600;
     
     в) элюент - гексан-изопропиловый спирт в объемном соотношении 98,5:1,5 (98:2);
     
     г) рабочие длины волн УФ-детектора - 264, 292 и 324 нм (соответственно для витаминов D, Е, А);
     
     д) скорость элюирования - 150-200 мкдм/мин;
     
     е) объем анализируемого раствора - 10-40 мкдм для витамина D и 4-5 мкдм для витаминов А, Е.
     
     8.3.4.2 Проведение измерений испытуемого раствора
     
     Для измерений используют метод внешнего стандарта. В колонку хроматографа последовательно вводят равные объемы испытуемого и градуировочного растворов.
     
     В качестве градуировочного выбирают раствор, высота пика которого наименее отличается от высоты пика испытуемого раствора.
     
     Концентрация градуировочных растворов должна уточняться в день их использования по 8.2.5.2, 8.2.6.2 и 8.2.7.2.
     
     Пик витамина на хроматограмме испытуемого раствора идентифицируют по времени удерживания.
     
     Примеры хроматограмм экстрактов витаминов A, D, Е из белково-витаминно-минеральных добавок представлены в приложении А.
     
     8.4 Обработка результатов
     
     8.4.1 Содержание витаминов , витамина А - МЕ/кг, витамина Е - мг/кг, в испытуемой пробе вычисляют по формуле
     

,                                                                   (6)

где  - концентрация используемых градуировочных растворов, МЕ/см (ретинол), мг/см (-токоферол);
     
      - среднеарифметическое значение результатов измерений высоты (площади) пика испытуемого раствора для двух параллельных определений анализируемого компонента, мм или е.о.п.,
      - объем разведения, см (4 см);
     
     10 - коэффициент пересчета граммов в килограммы;
     
      - коэффициент пересчета в ацетатную форму (для витамина А =1,15, для витамина Е =1,1);
     
      - среднеарифметическое значение результатов измерений высоты (площади) пика градуировочного раствора для двух параллельных определений анализируемого компонента, мм или е.о.п.,
     
      - масса навески испытуемой пробы, г.
     
     Примечание - При расчете содержания витамина А высоты (площади) пиков испытуемого и градуировочного растворов рассчитывают как сумму высот (площадей) цис- и транс-формы ретинола.
     
     8.4.2 Содержание витамина D , МЕ/кг, в испытуемой пробе вычисляют по формуле
     

,                                                        (7)

     
где  - концентрация используемого градуировочного раствора, МЕ/см;
     
      - среднеарифметическое значение результатов измерений высоты (площади) пика испытуемого раствора для двух параллельных анализов, мм или е.о.п.;
     
      - объем разведения, см (4 см);
     
     10 - коэффициент пересчета граммов в килограммы;
     
     1,15 - коэффициент, учитывающий превращение витамина D в провитамин;
     
      - среднеарифметическое значение результатов измерений высоты (площади) пика градуировочного раствора для двух параллельных анализов, мм или е.о.п;
     
      - масса навески испытуемой пробы, г.
     
     При определении витамина D, если в качестве градуировочного вещества используют эргокальциферол (витамин ), то числитель в формуле дополнительно умножают на коэффициент 0,97.
     
     8.4.3 Результаты вычисляют до третьей значащей цифры и округляют до двух значащих цифр.
     
     8.4.4 Контроль сходимости результатов параллельных определений и представление результатов по 7.4.4.
     
     

     9 Контроль точности испытаний

     
     9.1 Контроль сходимости результатов параллельных определений - по 7.4.4.
     
     9.2 Для контроля воспроизводимости используют рабочие пробы. Каждую пробу делят на две равные части и анализируют в соответствии с методикой настоящего стандарта, получают два результата испытаний в разных лабораториях или в одной, но выполненные разными исполнителями на разном оборудовании с использованием реактивов разных партий в разное время. Воспроизводимость считают удовлетворительной, если , где ,  и  - результаты испытаний одной и той же пробы, полученные в двух разных лабораториях или в разных условиях в одной лаборатории, и их среднеарифметическое значение. Значение  приведено в таблице 2.
     
     9.3 Контроль точности выполняют методом добавок. Рабочую пробу делят на две равные части, первую из которых анализируют в соответствии с методикой, а во вторую вводят известную добавку витамина и затем анализируют в соответствии с методикой настоящего стандарта. Значение добавки должно составлять 50%-150% содержания витамина в испытуемой пробе. Точность контрольных испытаний признают удовлетворительной, если , где ,  и  - результаты контрольных испытаний пробы с добавкой, без добавки и значение добавки. Значение норматива  для вероятности =0,90 вычисляют по формуле
     

,                                                                         (8)

     
где  и  - значения погрешности результатов анализа пробы без добавки и пробы с добавкой, вычисленные по 7.4.4.
     
     Пример - Проведен анализ пробы с добавкой (=40 МЕ/кг) и без добавки (=30 МЕ/кг) на содержание витамина А. Значение добавки составляет =20 МЕ/кг, значение относительной погрешности =25%. Результат контрольного анализа равен:
     

.

     
     Норматив контроля точности находят по формуле
     

     
     Анализ выполнен с достаточной точностью, так как результат контрольного анализа меньше норматива контроля точности (10<10,5).
     
     

ПРИЛОЖЕНИЕ А
(справочное)

Хроматограммы экстрактов витаминов A, D, Е

      
Рисунок А.1 - Хроматограмма экстракта витамина А:
1 - цис-форма, 2 - транс-форма

Рисунок А.2 - Хроматограмма экстракта витамина D

Рисунок А.3 - Хроматограмма экстракта витамина Е

ПРИЛОЖЕНИЕ Б
(справочное)

     
Библиография

     
     [1] ПБ 10-115-96 Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением
     
     [2] ТУ 25-1819.0021-90 Секундомеры механические "Слава"
     
     [3] ТУ 64-1.1411-76 Шкаф сушильный
     
     [4] ТУ 6-09-1678-86 Фильтры обеззоленные (белая, красная, синяя ленты)
     
     [5] ГФ СССР-X ст.695 Токоферола-ацетат
     
     [6] ТУ 84-11-99-89 Этиловый абсолютированный спирт
     
     [7] МРТУ 6-09-426-70 Алюминия окись безводная
     
     [8] ГФ СССР-X ст.6 Кислота аскорбиновая
     
     [9] ТУ 6-09-53-60-87 Фенолфталеин (индикатор)
     
     [10] Воскресенский П.И. Техника лабораторных работ. Химия М., 1969, стр.490
     
     [11] ГФ СССР-X ст.579 Раствор ретинола-ацетата в масле 3,44%
     
     [12] ФС 42-1764-96 Эргокальциферол кристаллический
     
     [13] ФС 421046299 Витамин  1000000 МЕ/г субстанция (производитель "Хоффманн-Ля Рош", Швейцария)
     
     [14] ТУ 6.09-402-87 2-пропанол (изопропиловый спирт химически чистый)
     
     [15] ТУ 6-09-3375-78 Гексан
     
     [16] ТУ 6-09-3916-85 Окись алюминия для хроматографии
     
     [17] ТУ 6.09-10-9954-74 2,6-Ди-трет-бутил-п-крезол
          
     
     
Текст документа сверен по:
официальное издание
М.: ИПК Издательство стандартов, 2004