МУК 4.1.1247-03

     
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ


4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

     
Определение остаточных количеств бентазона в семенах и масле сои методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии

     
     
Дата введения 2003-07-01

     
     
     УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 16 марта 2003 г.
     
     

1. Вводная часть

     
     Фирма-производитель: Август.
     
     Торговое наименование: Корсар.
     
     Действующее вещество: бентазон.
     
     Структурная формула:
     

     
     3-изопропил-1Н-2,1,3-бензотиадиазин-4(3Н)-он 2,2-диоксид (IUPAC)
     
     3-(1-метилэтил)-1Н-2,1,3-бензотиадиазин-4(3Н)-он 2,2-диоксид (С.А.)
     
     Брутто формула: CHNOS.
     
     Молекулярная масса: 240,3.
     
     Бесцветное кристаллическое вещество.
     
     Температура плавления: 139,4-141 °С.
     
     Давление паров при 20 °С: 0,17 мПа.
     
     Коэффициент распределения н-октанол/вода: 0,77 (рН 5), - 0,46 (рН 7), - 0,55 (рН 9).
     
     Константа Генри 7,16710 Па·м·моль (расчетное значение).
     
     Растворимость (г/л) при 20 °С: ацетон - 1387, дихлорметан - 206, метанол - 1061, этилацетат - 582, н-гептан - 0,510 мг/л. Растворимость в воде (мг/л, 20 °С): 570 (рН 7).
     
     Вещество очень устойчиво к гидролизу, как в кислой, так и в щелочной средах, рКа 3,3 (24 °С). Разлагается на свету.
     
     Гигиенические нормативы. ВМДУ бентазона в сое (семена и масло) - 0,1 мг/кг.
     
     Область применения препарата: Корсар - селективный контактный гербицид. Адсорбируется главным образом листвой. Используется для защиты зимних и весенних зерновых, бобовых и других культур.
     
     

2. Методика определения бентазона в семенах и масле сои методом ВЭЖХ

     
2.1. Основные положения

     
2.1.1. Принцип метода

     
     Методика основана на определении бентазона методом ВЭЖХ с использованием УФ детектора после его извлечения из образцов этилацетатом или водно-ацетоновой смесью и очистке путем перераспределения между двумя жидкими фазами, а также на колонке с силикагелем.
     

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

     
     Метрологическая характеристика метода представлена в табл.1.
     
     

Таблица 1

     
Метрологическая характеристика метода

     
     
2.1.3. Избирательность метода

     
     Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.
     
     

2.2. Реактивы и материалы

     
     
2.3. Приборы и посуда

     
     
2.4. Отбор проб

     
     Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Пробы семян хранятся до анализа в морозильной камере при температуре -18 °С, перед проведением анализа их измельчают на лабораторной зерновой мельнице.
     
     

2.5. Подготовка к определению

     
2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

     
     Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан и хлористый метилен встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют. Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташем (на 1 л ацетона 10 г KМnО и 2 г KСО). Ацетонитрил сушат над пентоксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием. Этилацетат промывают равным объемом 5%-ного раствора двууглекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.
     

2.5.2. Кондиционирование колонки

     
     Перед началом анализа колонку Symmetry-C18 кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 мл/мин) до стабилизации нулевой линии в течение 1-2 ч.
     

2.5.3. Приготовление растворов

     
     Для приготовления 0,005М раствора ортофосфорной кислоты 2 г 98% (или 2,24 г 87%) кристаллической НРО помещают в мерную колбу объемом 1 л, растворяют в 600 мл дистиллированной воды и доводят объем до метки дистиллированной водой. Для приготовления 0,5 М раствора KНРО 114 г кристаллического KНРО3НО помещают в мерную колбу на 1 л, растворяют при перемешивании в 600 мл дистиллированной воды и доводят объем раствора до метки, 0,25 М раствор KНРО готовят разбавлением в 2 раза 0,5 М раствора. Для получения 50%-го водного ацетона в колбе емкостью 1 л смешивают 500 мл ацетона с 500 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры. Для приготовления подвижной фазы смешивают 400 мл ацетонитрила с 600 мл 0,02 М ортофосфорной кислоты в колбе на 1000 мл, смесь фильтруют, при необходимости дегазируют. Для приготовления элюента N 1 в колбе на 1000 мл смешивают 500 мл н-гексана и 500 мл этилацетата. Для приготовления элюента N 2 в колбе на 1000 мл смешивают 200 мл н-гексана и 800 мл этилацетата.
     

2.5.4. Приготовление стандартного и градуировочных растворов

     
     Берут точную навеску бентазона (50 мг), переносят в мерную колбу на 50 мл, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки (стандартный раствор с концентрацией 1,0 мг/мл). Градуировочные растворы с концентрациями 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 и 2,0 мкг/мл готовят методом последовательного разбавления, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрил-0,02 М ортофосфорная кислота [40:60, по объему]). Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0-4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.
     
     Внимание! Бентазон в растворах достаточно быстро разлагается под воздействием света, поэтому следует избегать длительного нахождения проб и стандартных растворов на свету.
     
     При определении полноты извлечения для внесения в образец используют растворы бентазона, приготовленные из стандартного раствора последовательным разбавлением ацетонитрилом.
     

2.5.5. Построение градуировочного графика

     
     Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация бентазона в растворе) в хроматограф вводят по 50 мкл градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации бентазона в градуировочном растворе (мкг/мл).
     

2.5.6. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

     
     В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г силикагеля в 20 мл смеси гексан-этилацетат (50:50, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку последовательно промывают 50 мл смеси гексан-этилацетат (20:80, по объему) и 30 мл смеси гексан-этилацетат (50:50, по объему) со скоростью 1-2 капли в секунду, после чего она готова к работе.
     

2.5.7. Проверка хроматографического поведения бентазона на колонке с силикагелем

     
     В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора бентазона с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 5 мл элюента N 1 и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 мл элюента N 1 и также вносят на колонку. Промывают колонку 50 мл элюента N 1, затем 50 мл элюента N 2 со скоростью 1-2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п.2.5.3) и анализируют на содержание бентазона по п.2.6.4.
     
     Фракции, содержащие бентазон, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п.2.6.4. Рассчитывают содержание бентазона в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для этого объем элюента.
     
     Примечание: параметры удерживания бентазона и сопутствующих экстрактивных веществ могут меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.
     
     

2.5.8. Подготовка приборов и средств измерения

     
     Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями стандартов и технической документации.
     
     

2.6. Проведение определения

     
2.6.1. Определение бентазона в семенах сои

     
     Навеску измельченных на лабораторной мельнице семян сои, массой 20 г помещают в коническую колбу емкостью 250 мл с притертой пробкой, добавляют 40 мл этилацетата и экстрагируют в течение 15 мин на ультразвуковой бане. Суспензию фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют дважды с 30 мл этилацетата. Объединенный экстракт концентрируют на вакуумном ротационном испарителе до объема 25-30 мл при температуре не выше 40 °С, переносят в делительную воронку объемом 100 мл, бентазон экстрагируют трижды 0,25 М раствором KНРО, порциями по 40 мл*. Экстракт промывают дважды 50 мл гексана (верхний органический слой отбрасывают) и дважды 50 мл хлористого метилена (нижний органический слой отбрасывают), встряхивая делительную воронку каждый раз по 2-3 мин. Водный раствор подкисляют 2М НРО (~30 мл) до рН 3 (контроль осуществляют рН-метром) и экстрагируют хлористым метиленом трижды по 25 мл. Объединенный экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия (3 г), осушитель промывают 10-15 мл хлористого метилена. Полученный раствор упаривают на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.3**.
___________________
     * В процессе экстракции бентазона из этилацетатного раствора возможно изменение рН водного экстракта вследствие частичного гидролиза этилацетата. Во избежание потерь определяемого компонента следует после экстракции довести рН раствора до 9 путем добавления 0,5 М раствора KНРО (контроль осуществлять рН-метром).
     
     ** В случаях, когда очистка экстрактов контрольных проб (п.2.6.3) дает удовлетворительные результаты дополнительную очистку на колонке с силикагелем можно исключить.
     

2.6.2. Определение бентазона в масле сои

     
     Навеску масла, массой 10 г растворяют в 60 мл гексана и экстрагируют бентазон 50 мл системы ацетон-вода (в соотношении 1:1) в делительной воронке объемом 100 мл. Смесь встряхивают в течение 2 мин, нижний водно-ацетоновый слой отделяют*. Экстракцию повторяют. Объединенный экстракт помещают в морозильную камеру с температурой -18 °С на 1 час, после чего фильтруют через бумажный фильтр (красная лента) и упаривают на вакуумном ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С до полного удаления ацетона (объем ~50 мл). Водный остаток переносят в делительную воронку объемом 250 мл, дважды промывают гексаном, порциями по 50 мл, встряхивая смесь в течение 2 мин и отбрасывая верхний органический слой. Добавляют к водному раствору 50 мл 0,5 М раствора KНРО. Экстракт промывают дважды в делительной воронке хлористым метиленом, порциями по 50 мл, встряхивая смесь в течение 2 минут и отбрасывая нижний органический слой. Водный раствор подкисляют 2 М НРО (~30 мл) до рН 3 (контроль осуществляют рН-метром) и экстрагируют хлористым метиленом трижды по 25 мл. Объединенный экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия (3 г), осушитель промывают 10-15 мл хлористого метилена. Полученный раствор упаривают на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п.2.6.3.
________________
     * В случае образования сравнительно стойких эмульсий на стадии экстракции бентазона водным ацетоном для сокращения времени расслоения можно добавить в делительную воронку небольшое количество (до 5 мл) этилового спирта.
     

2.6.3. Очистка на колонке с силикагелем

     
     Сухой остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п.п.2.6.1 и 2.6.2 экстрактов семян или масла сои, количественно переносят двумя 5-мл порциями смеси гексан-этилацетат (50:50, по объему) в кондиционированную хроматографическую колонку (п.2.5.6). Промывают колонку 50 мл элюента N 1, которые отбрасывают. Бентазон элюируют 60 мл элюента N 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор упаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 50 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.
     

2.6.4. Условия хроматографирования

     
     Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки или другой с аналогичными характеристиками.
     
     Колонка Symmetry - С18 (2504,6) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA) или аналогичная.
     
     Температура колонки 30±1 °С.
     
     Предколонка Waters Symmetry С-18 для защиты аналитической колонки.
     
     Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,02М ортофосфорная кислота в соотношении 40:60 (по объему).
     
     Скорость потока элюента: 1 мл/мин
     
     Рабочая длина волны 214 нм
     
     Объем вводимой пробы 50 мкл
     
     Время удерживания бентазона 12,2±0,2 мин
     
     Линейный диапазон детектирования 0,1-2,00 мкг/мл
     

2.6.5. Обработка результатов анализа

     
     Количественное определение проводят методом абсолютной градуировки, содержание бентазона в образце семян или масла сои (, мг/кг) вычисляют по формуле:
     

, где

     
      - площадь пика бентазона в стандартном растворе, ед.адсс;
     
      - площадь пика бентазона в анализируемой пробе, ед.адсс;
     
      - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, мл;
     
      - навеска анализируемого образца, г;
     
      - концентрация стандартного раствора бентазона, мкг/мл.
     
     Содержание остаточных количеств бентазона в анализируемом образце вычисляют как среднее из 3-х параллельных определений.
     
     Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор бентазона 2 мкг/мл, разбавляют.
     
     

3. Требования техники безопасности

     
     При проведении работы необходимо соблюдать требования инструкции "Основные правила безопасной работы в химической лаборатории", общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, а также инструкции по эксплуатации жидкостного хроматографа и электрооборудования.
     
     

4. Контроль погрешности измерений

     
     Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа.
     
     

5. Разработчики

     
     Долженко В.И., Цибульская И.А., Юзихин О.С., Короткова Н.В.
     
     Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений.
     
     
     
Текст документа сверен по:
официальное издание
Определение остаточных количеств пестицидов
в пищевых продуктах, сельскохозяйственном сырье
и объектах окружающей среды: Сб. методических указаний.
Выпуск 2. Часть 9. МУК 4.1.1244-03, МУК 4.1.1246-03,
МУК 4.1.1247-03. -
М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии
Роспотребнадзора, 2005