МУК 4.1.1609-03

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
по спектрофотометрическому измерению
концентрации целлюлазы в воздухе рабочей зоны

Дата введения: с момента утверждения

     УТВЕРЖДЕНЫ Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 29 июня 2003 г.
     
     
     Ферментный препарат целлюлаза,
     
     (К 3.2.1.4 - -1,4-глюкан-4-глюканогидролаза).
     
     М.м. 65000.
     
     Целлюлаза - порошок сероватого цвета со слабым запахом дрожжей. Растворима в воде.
     
     Агрегатное состояние в воздухе - аэрозоль.
     
     Обладает общетоксическим действием. Мало токсична при различных путях воздействия на организм. При ингаляции пыль целлюлазы вызывает раздражение верхних дыхательных путей.
     
     ПДК в воздухе рабочей зоны - 2 мг/м (аэрозоль).
     
     

Характеристика метода

     Метод основан на количественном определении восстанавливающих эквивалентов, в основном целлобиозы, образующихся при гидролизе целлюлозы целлюлазой; используется способность калия железосинеродистого менять свой цвет при окислительно-восстановительной реакции с восстанавливающими эквивалентами. Измерение производят при длине волны 390-420 нм (оптимальная длина волны 405 нм). Субстратом для целлюлазы служит бумага для физико-химических анализов, представляющая собой практически чистую целлюлозу. Отбор проб проводят с концентрированием на фильтр АФА-ВП-10.
     
     Нижний предел измерения содержания целлюлазы в анализируемой пробе 3,2 мкг.
     
     Нижний предел измерения концентрации в воздухе (при отборе 16 л воздуха) - 1,0 мг/м.
     
     Диапазон измеряемых концентраций в воздухе - 1-10 мг/м.
     
     Суммарная погрешность измерения не превышает ±20%.
     
     Время выполнения измерения, включая отбор проб, не более 1,5 часов.
     
     Определению мешают хондрозин, мелибиоза, мальтоза, лактоза, ксилобиоза, гиалобиуроновая кислота, мурамовая кислота.
     
     

Приборы, аппаратура, посуда

      Колориметр фотоэлектрический лабораторный (фотоэлектроколориметр) по ГОСТ 12083, обеспечивающий измерения в интервалах длин волн 390-420 нм (оптимум 405 нм).
     
      Весы лабораторные ВЛР-200, ГОСТ 24104-88Е*.
______________
     * На территории Российской Федерации действует ГОСТ 24104-2001. - Примечание изготовителя базы данных.
     
      Аспирационное устройство, модель 822, ТУ 64-1-862-72.
     
     Фильтродержатель, ТУ 96-72-05-77.
     
      Фильтры АФА-ВП-10, ТУ 95-743-80.
     
      Баня водяная с температурой терморегулирования 100±0,5 °С.
     
      Термостат или ультратермостат, обеспечивающий температуру нагрева 37±0,2 °С.
     
      Секундомер, ГОСТ 5072-79.
     
      Стаканчики СВ-19/9 и 24/10, ГОСТ 25336-82Е.
     
      Стаканы вместимостью 25 мл, ГОСТ 25336-82E.
     
      Колбы 50, 100, 200, 500, 1000 мл, ГОСТ 1770-74Е.
     
      Пипетки 1 и 10 мл, ГОСТ 29227-91.
     
      Пробирки П1-14-120 ХС или П1-16-150, ГОСТ 25336-82Е.
     
     

Реактивы, растворы и материалы

      Целлюлоза, целлюлолитическая активность 1000 ед./г, ТУ 9231-008-05800805-93.
     
      Бумага для медицинских и физико-химических анализов в качестве субстрата, ТУ 13-7308001-778-89.
     
      D-глюкоза, ГОСТ 6086-79.
     
      Ацетатный буферный раствор, рН 4,7, готовый, ГОСТ 4919.2.
     
      Натрий углекислый, ГОСТ 83-79.
     
      Калий железосинеродистый, ГОСТ 4206-75.
     
      Вода дистиллированная, ГОСТ 6709.
     
     Все реактивы должны быть марки х.ч. или ч.д.а.
     
     

Подготовка к измерению

     1. Приготовление стандартного раствора целлюлазы, 16 мкг/мл.
     
     8,0 мг целлюлазы помещают в стеклянный стаканчик, тщательно растирают стеклянной палочкой с небольшим количеством дистиллированной воды и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл. Объем раствора доводят до метки дистиллированной водой. Окончательно полученный раствор разводят в 10 раз. Стандартный раствор готовят в день проведения анализа.
     
     2. Приготовление растворов целлюлазы для построения грауировочного графика.
     
     Для градуировочного графика растворы приготовляют согласно табл.
     
     

Таблица

     
     
     3. Приготовление раствора калия железосинеродистого, 0,60 мг/мл.
     
     6,00 г углекислого натрия растворяют в 200 мл дистиллированной воды и переносят в мерную колбу вместимостью 1000 мл.
     
     Затем в эту же колбу добавляют 0,60 г калия железосинеродистого. Объем доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.
     
     Раствор хранят при комнатной температуре в темном месте в течение 2-х месяцев.
     
     

Проведение измерений и построение градуировочного графика

     1. Гидролиз целлюлазы
     
     Полоску бумаги массой 100,0 мг складывают гармошкой, помещают в пробирку и заливают 2 мл готового ацетатного буферного раствора. Пробирку помещают на водяную баню с температурой 37±0,2 °С и прогревают в течение 10 мин. Затем в пробирку добавляют 2 мл пробы, содержащей известное количество целлюлазы (концентрации целлюлазы указаны в таблице), и гидролизуют в течение 15 минут (точно).
     
     Аналогично приготавливают холостую пробу, где вместо раствора, содержащего целлюлазу, добавляют 2 мл дистиллята.
     
     2. Проведение цветной реакции
     
     После этого из пробирок, содержащих опытную и холостую пробы, в другие пробирки отбирают по 0,2 мл реакционной смеси, приливают по 6 мл раствора калия железосинеродистого, смесь прогревают при температуре 100 °С в течение 10 мин на водяной бане, затем охлаждают до комнатной температуры.
     
     3. Проведение оптических измерений
     
     Оптическую плотность определяют на ФЭКе при длине волны 405 нм в кювете с толщиной поглощающего свет слоя 5,0 мм.
     
     Колориметрирование опытной и холостой проб ведут на фоне дистиллированной воды: определяют соответствующие оптические плотности -  и .
     
     4. Построение градуировочного графика для целлюлазы
     
     Строят график, где по оси абсцисс располагают содержание фермента в пробе (5-я графа таблицы), взятой для анализа, а по оси ординат - разность -; график строят по средним значениям разности оптической плотности для каждой концентрации. На каждую концентрацию производят по 5 параллельных определений.
     
     Проверку калибровочного графика проводят при смене реактивов, оборудования или приборов, и не реже, чем 1 раз в месяц.
     
     

Определение концентрации целлюлазы в воздухе рабочей зоны

     Отбор проб воздуха.
     
     Для определения 0,5 ПДК целлюлазы необходимо отобрать 16 л воздуха. Пробы воздуха с объемным расходом 5 л/мин отбирают на фильтры АФА-ВП-10. Срок хранения отобранных проб в холодильнике до 1 суток.
     
     Экстракция целлюлазы с фильтра.
     
     Фильтр с отобранной пробой, содержащей целлюлазу из воздуха рабочей зоны, помещают в стакан и приливают 5,0 мл дистиллированной воды. Периодически встряхивая, выдерживают раствор в течение 5 мин и сливают в пробирку. Аналогичным образом проводят повторную экстракцию с фильтра и объединяют растворы. Общий объем элюата составляет 10,0 мл.
     
     Измерения проводят точно так же, как и при установлении градуировочного графика, отбирая для анализа 2 мл из общего объема элюата. Находят -, соответствующие данному образцу воздуха.
     
     Если значения оптической плотности выходят за пределы рабочей зоны градуировочного графика целлюлозы (0,060..0,600), то опыт необходимо повторить с раствором, имеющим большее или меньшее содержание ферментного препарата.
     
     

Обработка результатов

     Определение содержания целлюлазы в анализируемой пробе.
     
     Количественное определение содержания целлюлазы в объеме пробы, взятой для анализа (2 мл), проводят по предварительно построенному калибровочному графику, определяя соответствие полученной разности - содержанию целлюлазы в пробе (5-я графа таблицы).     
     
     Вычисление концентрации целлюлазы в воздухе рабочей зоны.
     
     Концентрацию целлюлазы в воздухе () вычисляют по формуле:
     

, (мг/м),

где  - содержание целлюлазы в объеме пробы, взятом для анализа (мкг);
     
      - объем анализируемой пробы (мл);
     
      - общий объем элюата с воздушного фильтра (мл);
     
      - объем воздуха (л), отобранный для анализа и приведенный к стандартным условиям (см. Приложение 1).