ГОСТ Р 51600-2000
Группа Н19
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
МОЛОКО
Методы определения антибиотиков
Milk.
Methods for determination of the antibiotics
ОКС 67.100.10
ОКСТУ 9209
Дата введения 2001-07-01
Предисловие
1 РАЗРАБОТАН Государственным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (ГУ ВНИИВСГЭ), Институтом питания РАМН и Государственным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом молочной промышленности (ГУ ВНИМИ)
ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 186 "Молоко и молочные продукты"
2 ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 26 апреля 2000 года N 127-ст
3 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
4 ПЕРЕИЗДАНИЕ
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на сырое, пастеризованное, стерилизованное и предварительно восстановленное сухое молоко (далее - молоко) и устанавливает микробиологические методы определения наличия антибиотиков.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 427-75 Линейки измерительные металлические. Технические условия
ГОСТ 2493-75 Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный. Технические условия
ГОСТ 3145-84 Часы механические с сигнальным устройством. Общие технические условия
ГОСТ 9225-84 Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа
ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 23454-79 Молоко. Методы определения ингибирующих веществ
ГОСТ 24065-80 Молоко. Методы определения соды
ГОСТ 24066-80 Молоко. Методы определения аммиака
ГОСТ 24067-80 Молоко. Метод определения перекиси водорода
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
3 Чашечный метод с Вас. stearothermophilus
3.1 Сущность метода
Метод основан на способности антибиотиков, содержащихся в молоке, диффундировать в агаровую среду со спорами тест-микроба и препятствовать его росту, что приводит к образованию прозрачных зон ингибиции. Наличие любого антибиотика в молоке устанавливают по диаметру зоны ингибиции.
3.2 Аппаратура, реактивы и материалы
3.2.1 Аппаратура, реактивы и материалы по ГОСТ 9225 и указанные в 3.2.2-3.2.16.
3.2.2 Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.
3.2.3 Центрифуга частотой вращения 3000 мин и разделяющим фактором 750 м/с.
3.2.4 Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.
3.2.5 Колба коническая по ГОСТ 25336, вместимостью 250 см.
3.2.6 Линейка по ГОСТ 427, пределом измерения 150 мм или аппарат Микрофот 5ПО-1.
3.2.7 Пробойник диаметром 10 мм или сверло пробочное N 4.
3.2.8 Пипетка градуированная по ГОСТ 29227, 2-го класса точности, вместимостью 25 см.
3.2.9 Гидролизат кормовых дрожжей.
3.2.10 Диски со стрептомицином.
3.2.11 Оптический стандарт мутности ОСО 42-28-29-86.
3.2.12 Препарат СКИВ.
3.2.13 Стандарт стрептомицина РСО 9347-194-00494189-99.
3.2.14 Тест-микроб Вас. stearothermophilus BKMB-510, выпускаемый Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.
3.2.15 Фуксин основной, спиртовой раствор концентрации 50 г/дм.
3.2.16 Экстракт дрожжевой.
Допускается применять другие средства измерений с метрологическими характеристиками и оборудование с техническими характеристиками не хуже, а также реактивы по качеству не ниже указанных.
3.3 Отбор проб
3.3.1 Отбор проб - по ГОСТ 9225.
3.3.2 Пробы молока до испытания допускается хранить в холодильнике при температуре (5±1) °С не более 24 ч.
3.3.3 Анализу подлежат пробы молока, давшие положительный результат по ГОСТ 23454 и отрицательный - по ГОСТ 24065, ГОСТ 24066 и ГОСТ 24067.
3.4 Подготовка к анализу
3.4.1 Подготовка посуды и материалов
3.4.1.1 Всю новую посуду, предназначенную для микробиологических исследований, кипятят в подкисленной воде (раствор соляной кислоты объемной доли 1-2%) в течение 15 мин, затем ополаскивают дистиллированной водой.
Вымытую посуду стерилизуют в сушильном шкафу при температуре (160±5) °С в течение 2 ч или в автоклаве при (121±2) °С в течение (30±1) мин с последующим подсушиванием.
Чашки Петри, пипетки и цилиндры стерилизуют завернутыми в бумагу или в металлических пеналах. В конец пипетки предварительно вкладывают кусочек ваты. Пробирки и колбы закрывают ватно-марлевыми пробками и обертывают бумагой. Стерильную посуду хранят в плотно закрывающихся шкафах или ящиках с крышками.
3.4.2 Приготовление питательных сред
3.4.2.1 Для получения спор Вас. stearothermophilus BKMB-510 используют питательную среду следующего состава: дрожжевой экстракт - 10,0 г, пептон - 20,0 г, глюкоза - 0,5 г, дистиллированная вода - до 1000,0 см.
В мерную колбу вместимостью 1000 см помещают все компоненты питательной среды, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, доводят объем раствора водой до метки и устанавливают рН среды по рН-метру, равный (7,1±0,1). Разливают раствор в колбы по 200,0 см и стерилизуют его при температуре (121±2) °С в течение (15±1) мин.
3.4.2.2 Для проведения анализа готовят агаровую среду следующего состава: гидролизат кормовых дрожжей - 1,0 г, пептон - 0,4 г, хлористый натрий - 0,1 г, агар - 1,6 г, дистиллированная вода - до 100,0 см.
В колбу вместимостью 200 см вносят 100 см дистиллированной воды и все компоненты среды, перемешивают до полного растворения и нагревают до кипения. Затем охлаждают до температуры (55±5) °С, устанавливают рН среды по рН-метру, равный (7,3±0,1), и стерилизуют при температуре (121±2) °С в течение (15±1) мин.
3.4.2.3 Для проведения анализа допускается применять питательные среды указанного в 3.4.2.1 и 3.4.2.2 состава промышленного изготовления.
3.4.3 Получение спор тест-микроба
3.4.3.1 Среду по 3.4.2.1 засевают 2-3 см 18-20-часовой тест-культуры Вас. stearothermophilus BKMB-510, выращенной в пробирках с этой же средой, тщательно перемешивают и помещают в термостат температурой (55±1) °С на 3 сут.
После окончания инкубации из посевов делают мазки, окрашивают их спиртовым раствором основного фуксина 50 г/дм и микроскопируют.
При наличии в поле зрения 90-95% свободных сформировавшихся спор колбы с посевами помещают на 16-18 ч в холодильник для осаждения. Надосадочную жидкость из колбы сливают, а осадок разливают по стерильным центрифужным пробиркам и прогревают в водяной бане при температуре внутри пробирок (67±2) °С в течение (30±1) мин. Пробирки центрифугируют 20-30 мин. Осадок отмывают стерильной дистиллированной водой (не менее трех раз) до получения прозрачной жидкости над ним.
Взвесь спор вторично прогревают при температуре (67±2) °С в течение (30-1)* мин. Полученную взвесь переносят в бактериологические пробирки и хранят в холодильнике не более 2 мес.
________________
* Соответствует оригиналу. - Примечание .
3.4.4 Приготовление засеянной агаровой среды
3.4.4.1 В пробирки отбирают взвесь спор тест-микроба по 3.4.3.1 и разводят стерильной дистиллированной водой до получения суспензии спор, визуально соответствующей 10 единицам по оптическому стандарту мутности.
3.4.4.2 К 100 см расплавленной и охлажденной до (60±2) °С среды по 3.4.2.2 добавляют 2,5 см водного раствора глюкозы массовой долей 40% и 4 см суспензии спор по 3.4.4.1. Смесь среды и спор тщательно перемешивают и разливают градуированной пипеткой по (11±1) см в чашки Петри, установленные на строго горизонтальной поверхности стола.
3.4.4.3 Чашки засевают непосредственно перед употреблением.
В некоторых случаях чашки хранят в холодильнике при температуре (5±1) °С не более 2 сут. Перед использованием их прогревают в термостате при (55±1) °С в течение (20±1) мин.
3.4.5 Приготовление обезжиренного стерильного молока
3.4.5.1 Обезжиренное стерильное молоко получают из цельного молока кислотностью 16-18 °Т, предварительно проверенного на отсутствие ингибирующих веществ по ГОСТ 23454. В пробирки разливают обезжиренное молоко по 10 см и стерилизуют при 105 Па (1 атм) в течение (10±1) мин.
Допускается использовать препарат СКИВ.
3.4.6 Приготовление контрольного разведения стрептомицина активностью 2,5 мкг/см (Ед/г)
3.4.6.1 Контрольное разведение стрептомицина используют для проверки активности роста тест-микроба.
3.4.6.2 Контрольное разведение стрептомицина готовят в фосфатных буферных растворах.
Состав раствора 1: двузамещенный фосфорнокислый калий по ГОСТ 2493 - 2,0 г, однозамещенный фосфорнокислый калий - 8,0 г, дистиллированная вода - до 1000,0 см.
В мерной колбе вместимостью 1000 см растворяют компоненты в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем водой до метки. Устанавливают рН раствора по рН-метру, равный (6,1±0,1), и стерилизуют при температуре (112±2) °С в течение (30±1) мин. Срок хранения раствора - не более 30 сут при температуре (5±1) °С.
Состав раствора 2: двузамещенный фосфорнокислый калий - 16,73 г, однозамещенный фосфорнокислый калий - 0,523 г, дистиллированная вода - до 1000,0 см.
В мерной колбе вместимостью 1000 см растворяют компоненты в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем водой до метки. Устанавливают рН раствора по рН-метру, равный (7,9±0,1), и стерилизуют при температуре (112±2) °С в течение (30±1) мин. Срок хранения раствора - не более 30 сут при температуре (5±1) °С.
3.4.6.3 Контрольное разведение готовят из основного раствора стрептомицина активностью 500 мкг/см, который получают растворением 5 мг стандарта антибиотика, взвешенного с отсчетом показания весов до 0,1 мг, в буферном растворе 1 по 3.4.6.2. Объем буферного раствора составляет 0,01 активности антибиотика.
Пример: При активности стандарта стрептомицина 760 мкг/мг навеску антибиотика (5 мг) растворяют в 7,6 см буферного раствора 1 и получают основной раствор активностью 500 мкг/см.
Основной раствор антибиотика хранят в посуде из темного стекла с притертой пробкой не более 30 сут при температуре (5±1) °С.
Из основного раствора в трех пробирках готовят серию разведений антибиотика. В первую пробирку наливают 1 см буферного раствора 2 по 3.4.6.2 и 1 см основного раствора, во вторую - 9 см буферного раствора 2 и 1 см раствора из первой пробирки, в третью - 9 см стерильного обезжиренного молока по 3.4.5 и 1 см раствора из второй пробирки. Активность антибиотика в разведениях составляет соответственно 250; 25 и 2,5 мкг/см. Разведение антибиотика в молоке активностью 2,5 мкг/см является контрольным.
Контрольное разведение стрептомицина используют в течение рабочего дня.
3.4.6.4 Взамен контрольного разведения стрептомицина для проверки активности роста тест-микроба могут быть использованы диски со стрептомицином по 3.2.10.
3.4.7 Подготовка проб молока к анализу
Каждую пробу молока наливают по 5-10 см в чистую стерильную пробирку, прогревают в течение (10±1) мин на водяной бане при температуре внутри пробирки (87±2) °С и охлаждают в холодной воде до температуры 18-25 °С.
3.5 Проведение анализа
3.5.1 Непосредственно перед исследованием молока на поверхности агаровой среды, разлитой в чашки Петри по 3.4.4, пробойником или пробочным сверлом вырезают семь лунок диаметром 10 мм. Шесть лунок располагают по окружности чашки на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии 28 мм их центров от центра чашки. Седьмую лунку вырезают в центре чашки (рисунок 1) только в случае использования контрольного разведения антибиотика.
Рисунок 1 - Схема вырезания лунок в агаровой среде
3.5.2 В центральную лунку вносят 0,05 см контрольного разведения антибиотика по 3.4.6.3 или в центре чашки на поверхность засеянной агаровой среды помещают диск со стрептомицином по 3.2.10. В лунки, расположенные по окружности чашки, вносят по 0,05 см исследуемых проб молока по 3.4.7.
3.5.3 Чашки Петри выдерживают при комнатной температуре в течение (20±1) мин, затем их помещают в термостат крышками вверх и инкубируют при температуре (55±1) °С в течение 4 ч. Чашки в термостате размещают в один ряд.
3.6 Обработка результатов
3.6.1 Результаты анализа оценивают непосредственно после инкубирования. Чашки просматривают в проходящем свете от любого источника света.
Диаметры зон ингибиции роста тест-культуры, образуемых испытуемым образцом молока и контрольным разведением антибиотика, измеряют линейкой или на аппарате Микрофот 5ПО-1 по краям окружностей зон.
3.6.2 При отсутствии зон ингибиции контрольного разведения стрептомицина исследования повторяют с использованием вновь приготовленных засеянных чашек по 3.4.4 и контрольного разведения антибиотика по 3.4.6.
3.6.3 При отсутствии антибиотиков в молоке диаметр зоны ингибиции должен быть менее 12 мм, а при их наличии - 12 мм и более.
3.7 Метрологические характеристики
3.7.1 Наименьшие пределы определения антибиотиков представлены в таблице 1.
Таблица 1
Наименование антибиотика |
Наименьший предел определения, Ед/г (мкг/г)* |
Бензилпенициллин |
0,005 |
Стрептомицин |
0,5-1,0 |
Тетрациклин |
0,1 |
Окситетрациклин |
0,1 |
Хлортетрациклин |
0,05 |
Эритромицин |
0,05 |
Неомицин |
0,25 |
Мономицин |
0,25 |
Левомицетин |
2,5 |
Олеандомицин |
2,5 |
________________ |
4 Метод с индикатором бромкрезолпурпуром
4.1 Сущность метода
Метод основан на изменении окраски агаровой среды со спорами Вас. stearothermophilus var. calidolactis C953 от фиолетовой до желтой при отсутствии в исследуемом молоке антибиотиков и других ингибирующих веществ и сохранении окраски - при их наличии.
4.2 Аппаратура, материалы и реактивы
4.2.1 Термостат, позволяющий поддерживать температуру от 30 до 70 °С с допускаемыми отклонениями ±0,5 °С от заданной.
4.2.2 Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.
4.2.3 Среда агаровая "Delvotest" со спорами Вас. stearothermophilus и индикатором бромкрезол пурпуром, фасованная в герметично укупоренные ампулы вместимостью 1,0 см, собранные в блоки.
4.2.4 Среда питательная таблетированная "Delvotest", фасованная в бутылочки из темного стекла с навинчивающимся колпачком.
4.2.5 Шприц-дозатор автоматический вместимостью 1,0 см, настроенный на объем пробы 0,1 см.
4.2.6 Наконечники пластмассовые одноразовые, вместимостью 0,1 см.
4.2.7 Пинцет.
4.2.8 Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.
Допускается применять другие средства измерений с метрологическими характеристиками и оборудование с техническими характеристиками не хуже указанных.
4.3 Отбор проб
4.3.1 Отбор проб и подготовка их к анализу - по ГОСТ 9225.
4.3.2 Допускается хранить пробы в холодильнике в течение 24 ч при температуре (6±2) °С.
4.4 Подготовка к анализу
4.4.1 Стеклянную бутылочку с питательными таблетками вынимают из холодильника и выдерживают в течение 20 мин при температуре от 15 до 25 °С.
4.4.2 Осторожно, не повреждая упаковки, отрезают от блока необходимое количество ампул (с учетом контрольной пробы) и маркируют. Оставшиеся ампулы хранят в холодильнике.
4.4.3 Отвинчивают колпачок бутылочки и помещают его на стол вниз донышком. Пинцетом вынимают капсулу с силикагелем и поролоновый уплотнитель. Насыпают в колпачок необходимое количество таблеток питательной среды. Поролоновый уплотнитель и капсулу с силикагелем помещают в бутылочку.
4.5 Проведение анализа
4.5.1 Соединительной частью шприца прокалывают укупорку ампул.
4.5.2 В каждую ампулу пинцетом помещают по одной таблетке питательной среды "Delvotest". Бутылочку со средой плотно закрывают колпачком и сохраняют в дальнейшем при комнатной температуре.
4.5.3 Шприцем отбирают 0,1 см пробы молока и вносят в ампулу. Для каждой пробы молока используют новый наконечник. Оставшееся молоко сохраняют до конца анализа в холодильнике при температуре (6±2) °С.
4.5.4 Ампулы "Delvotest" помещают в термостат и выдерживают при температуре (64,0±0,5) °С в течение 3 ч.
4.5.5 Контрольное определение проводят в соответствии с 4.5.1; 4.5.2 и 4.5.4. В ампулу вносят 0,1 см предварительно восстановленного по ГОСТ 23454 препарата СКИВ.
4.6 Обработка результатов
4.6.1 Ампулы извлекают из термостата и определяют цвет содержимого.
4.6.2 Желтый цвет содержимого ампул с контрольным и анализируемыми образцами молока свидетельствует об отсутствии в молоке ингибирующих веществ. Фиолетовое кольцо на поверхности содержимого ампулы (размером не более 1 мм) не учитывают.
4.6.3 Фиолетовый цвет содержимого ампул с анализируемым образцом молока свидетельствует о наличии в молоке ингибирующих веществ.
4.6.4 Вывод о наличии в молоке антибиотиков делают после дополнительных исследований молока по ГОСТ 24065-ГОСТ 24067 и при получении отрицательных результатов.
4.7 Метрологические характеристики
4.7.1 Наименьшие пределы определения антибиотиков представлены в таблице 2.
Таблица 2
Наименование антибиотика |
Наименьший предел определения, Ед/г (мкг/г) |
Бензилпенициллин |
0,0025 |
Клоксациллин |
0,020 |
Диклоксациллин |
0,010 |
Оксациллин |
0,010 |
Нафциллин |
0,010 |
Ампициллин |
0,003 |
Амоксициллин |
0,003 |
Цефапирин |
0,005 |
Цефалониум |
0,015 |
Цефалексин |
0,060 |
Цефацетрил |
0,020 |
Цефаперазон |
0,060 |
Тетрациклин |
0,300 |
Окситетрациклин |
0,400 |
Хлортетрациклин |
0,300 |
Тилозин |
0,100 |
Эритромицин |
0,250 |
Линкомицин |
0,300 |
Гентамицин |
0,400 |
Неомицин |
0,400 |
Дигидрострептомицин |
2,500 |
Левомицетин/хлорам-феникол/ |
7,500 |
5 Требования безопасности
Работу со споровой культурой тест-микроба в лаборатории проводят в соответствии с санитарными правилами по [1].
ПРИЛОЖЕНИЕ А
(справочное)
Библиография
[1] СП 1.2.731-99 Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами
Текст документа сверен по:
официальное издание
Молоко и молочные продукты.
Общие методы анализа: Сб. ГОСТов. -
М.: ИПК Издательство стандартов, 2004