Адрес документа: http://law.rufox.ru/view/25/1200046735.htm


ГОСТ Р 51600-2000

Группа Н19

     
     
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОЛОКО

Методы определения антибиотиков

Milk.
Methods for determination of the antibiotics

     
     
ОКС 67.100.10
ОКСТУ 9209

Дата введения 2001-07-01

     
     
Предисловие

     
     1 РАЗРАБОТАН Государственным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (ГУ ВНИИВСГЭ), Институтом питания РАМН и Государственным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом молочной промышленности (ГУ ВНИМИ)
     
     ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 186 "Молоко и молочные продукты"
     
     2 ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 26 апреля 2000 года N 127-ст
     
     3 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
     
     4 ПЕРЕИЗДАНИЕ
     
     

     1 Область применения

     
     Настоящий стандарт распространяется на сырое, пастеризованное, стерилизованное и предварительно восстановленное сухое молоко (далее - молоко) и устанавливает микробиологические методы определения наличия антибиотиков.
     
     

     2 Нормативные ссылки

     
     В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:
     
     ГОСТ 427-75 Линейки измерительные металлические. Технические условия
     
     ГОСТ 2493-75 Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный. Технические условия
     
     ГОСТ 3145-84 Часы механические с сигнальным устройством. Общие технические условия
     
     ГОСТ 9225-84 Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа
     
     ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия
     
     ГОСТ 23454-79 Молоко. Методы определения ингибирующих веществ
     
     ГОСТ 24065-80 Молоко. Методы определения соды
     
     ГОСТ 24066-80 Молоко. Методы определения аммиака
     
     ГОСТ 24067-80 Молоко. Метод определения перекиси водорода
     
     ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
     
     ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
     
     

     3 Чашечный метод с Вас. stearothermophilus
     

     3.1 Сущность метода

     
     Метод основан на способности антибиотиков, содержащихся в молоке, диффундировать в агаровую среду со спорами тест-микроба и препятствовать его росту, что приводит к образованию прозрачных зон ингибиции. Наличие любого антибиотика в молоке устанавливают по диаметру зоны ингибиции.
     

     3.2 Аппаратура, реактивы и материалы

     
     3.2.1 Аппаратура, реактивы и материалы по ГОСТ 9225 и указанные в 3.2.2-3.2.16.
     
     3.2.2 Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.
     
     3.2.3 Центрифуга частотой вращения 3000 мин и разделяющим фактором 750 м/с.
     
     3.2.4 Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.
     
     3.2.5 Колба коническая по ГОСТ 25336, вместимостью 250 см.
     
     3.2.6 Линейка по ГОСТ 427, пределом измерения 150 мм или аппарат Микрофот 5ПО-1.
     
     3.2.7 Пробойник диаметром 10 мм или сверло пробочное N 4.
     
     3.2.8 Пипетка градуированная по ГОСТ 29227, 2-го класса точности, вместимостью 25 см.
     
     3.2.9 Гидролизат кормовых дрожжей.
     
     3.2.10 Диски со стрептомицином.
     
     3.2.11 Оптический стандарт мутности ОСО 42-28-29-86.
     
     3.2.12 Препарат СКИВ.
     
     3.2.13 Стандарт стрептомицина РСО 9347-194-00494189-99.
     
     3.2.14 Тест-микроб Вас. stearothermophilus BKMB-510, выпускаемый Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.
     
     3.2.15 Фуксин основной, спиртовой раствор концентрации 50 г/дм.
     
     3.2.16 Экстракт дрожжевой.
     
     Допускается применять другие средства измерений с метрологическими характеристиками и оборудование с техническими характеристиками не хуже, а также реактивы по качеству не ниже указанных.
     

     3.3 Отбор проб

     
     3.3.1 Отбор проб - по ГОСТ 9225.
     
     3.3.2 Пробы молока до испытания допускается хранить в холодильнике при температуре (5±1) °С не более 24 ч.
     
     3.3.3 Анализу подлежат пробы молока, давшие положительный результат по ГОСТ 23454 и отрицательный - по ГОСТ 24065, ГОСТ 24066 и ГОСТ 24067.
     

     3.4 Подготовка к анализу

     
     3.4.1 Подготовка посуды и материалов
     
     3.4.1.1 Всю новую посуду, предназначенную для микробиологических исследований, кипятят в подкисленной воде (раствор соляной кислоты объемной доли 1-2%) в течение 15 мин, затем ополаскивают дистиллированной водой.
     
     Вымытую посуду стерилизуют в сушильном шкафу при температуре (160±5) °С в течение 2 ч или в автоклаве при (121±2) °С в течение (30±1) мин с последующим подсушиванием.
     
     Чашки Петри, пипетки и цилиндры стерилизуют завернутыми в бумагу или в металлических пеналах. В конец пипетки предварительно вкладывают кусочек ваты. Пробирки и колбы закрывают ватно-марлевыми пробками и обертывают бумагой. Стерильную посуду хранят в плотно закрывающихся шкафах или ящиках с крышками.
     
     3.4.2 Приготовление питательных сред
     
     3.4.2.1 Для получения спор Вас. stearothermophilus BKMB-510 используют питательную среду следующего состава: дрожжевой экстракт - 10,0 г, пептон - 20,0 г, глюкоза - 0,5 г, дистиллированная вода - до 1000,0 см.
     
     В мерную колбу вместимостью 1000 см помещают все компоненты питательной среды, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, доводят объем раствора водой до метки и устанавливают рН среды по рН-метру, равный (7,1±0,1). Разливают раствор в колбы по 200,0 см и стерилизуют его при температуре (121±2) °С в течение (15±1) мин.
     
     3.4.2.2 Для проведения анализа готовят агаровую среду следующего состава: гидролизат кормовых дрожжей - 1,0 г, пептон - 0,4 г, хлористый натрий - 0,1 г, агар - 1,6 г, дистиллированная вода - до 100,0 см.
     
     В колбу вместимостью 200 см вносят 100 см дистиллированной воды и все компоненты среды, перемешивают до полного растворения и нагревают до кипения. Затем охлаждают до температуры (55±5) °С, устанавливают рН среды по рН-метру, равный (7,3±0,1), и стерилизуют при температуре (121±2) °С в течение (15±1) мин.
     
     3.4.2.3 Для проведения анализа допускается применять питательные среды указанного в 3.4.2.1 и 3.4.2.2 состава промышленного изготовления.
     
     3.4.3 Получение спор тест-микроба
     
     3.4.3.1 Среду по 3.4.2.1 засевают 2-3 см 18-20-часовой тест-культуры Вас. stearothermophilus BKMB-510, выращенной в пробирках с этой же средой, тщательно перемешивают и помещают в термостат температурой (55±1) °С на 3 сут.
     
     После окончания инкубации из посевов делают мазки, окрашивают их спиртовым раствором основного фуксина 50 г/дм и микроскопируют.
     
     При наличии в поле зрения 90-95% свободных сформировавшихся спор колбы с посевами помещают на 16-18 ч в холодильник для осаждения. Надосадочную жидкость из колбы сливают, а осадок разливают по стерильным центрифужным пробиркам и прогревают в водяной бане при температуре внутри пробирок (67±2) °С в течение (30±1) мин. Пробирки центрифугируют 20-30 мин. Осадок отмывают стерильной дистиллированной водой (не менее трех раз) до получения прозрачной жидкости над ним.
     
     Взвесь спор вторично прогревают при температуре (67±2) °С в течение (30-1)* мин. Полученную взвесь переносят в бактериологические пробирки и хранят в холодильнике не более 2 мес.
________________
     * Соответствует оригиналу. - Примечание .     
     
     3.4.4 Приготовление засеянной агаровой среды
     
     3.4.4.1 В пробирки отбирают взвесь спор тест-микроба по 3.4.3.1 и разводят стерильной дистиллированной водой до получения суспензии спор, визуально соответствующей 10 единицам по оптическому стандарту мутности.
     
     3.4.4.2 К 100 см расплавленной и охлажденной до (60±2) °С среды по 3.4.2.2 добавляют 2,5 см водного раствора глюкозы массовой долей 40% и 4 см суспензии спор по 3.4.4.1. Смесь среды и спор тщательно перемешивают и разливают градуированной пипеткой по (11±1) см в чашки Петри, установленные на строго горизонтальной поверхности стола.
     
     3.4.4.3 Чашки засевают непосредственно перед употреблением.
     
     В некоторых случаях чашки хранят в холодильнике при температуре (5±1) °С не более 2 сут. Перед использованием их прогревают в термостате при (55±1) °С в течение (20±1) мин.
     
     3.4.5 Приготовление обезжиренного стерильного молока
     
     3.4.5.1 Обезжиренное стерильное молоко получают из цельного молока кислотностью 16-18 °Т, предварительно проверенного на отсутствие ингибирующих веществ по ГОСТ 23454. В пробирки разливают обезжиренное молоко по 10 см и стерилизуют при 105 Па (1 атм) в течение (10±1) мин.
     
     Допускается использовать препарат СКИВ.
     
     3.4.6 Приготовление контрольного разведения стрептомицина активностью 2,5 мкг/см (Ед/г)
     
     3.4.6.1 Контрольное разведение стрептомицина используют для проверки активности роста тест-микроба.
     
     3.4.6.2 Контрольное разведение стрептомицина готовят в фосфатных буферных растворах.
     
     Состав раствора 1: двузамещенный фосфорнокислый калий по ГОСТ 2493 - 2,0 г, однозамещенный фосфорнокислый калий - 8,0 г, дистиллированная вода - до 1000,0 см.
     
     В мерной колбе вместимостью 1000 см растворяют компоненты в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем водой до метки. Устанавливают рН раствора по рН-метру, равный (6,1±0,1), и стерилизуют при температуре (112±2) °С в течение (30±1) мин. Срок хранения раствора - не более 30 сут при температуре (5±1) °С.
     
     Состав раствора 2: двузамещенный фосфорнокислый калий - 16,73 г, однозамещенный фосфорнокислый калий - 0,523 г, дистиллированная вода - до 1000,0 см.
     
     В мерной колбе вместимостью 1000 см растворяют компоненты в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем водой до метки. Устанавливают рН раствора по рН-метру, равный (7,9±0,1), и стерилизуют при температуре (112±2) °С в течение (30±1) мин. Срок хранения раствора - не более 30 сут при температуре (5±1) °С.
     
     3.4.6.3 Контрольное разведение готовят из основного раствора стрептомицина активностью 500 мкг/см, который получают растворением 5 мг стандарта антибиотика, взвешенного с отсчетом показания весов до 0,1 мг, в буферном растворе 1 по 3.4.6.2. Объем буферного раствора составляет 0,01 активности антибиотика.
     
     Пример: При активности стандарта стрептомицина 760 мкг/мг навеску антибиотика (5 мг) растворяют в 7,6 см буферного раствора 1 и получают основной раствор активностью 500 мкг/см.
     
     Основной раствор антибиотика хранят в посуде из темного стекла с притертой пробкой не более 30 сут при температуре (5±1) °С.
     
     Из основного раствора в трех пробирках готовят серию разведений антибиотика. В первую пробирку наливают 1 см буферного раствора 2 по 3.4.6.2 и 1 см основного раствора, во вторую - 9 см буферного раствора 2 и 1 см раствора из первой пробирки, в третью - 9 см стерильного обезжиренного молока по 3.4.5 и 1 см раствора из второй пробирки. Активность антибиотика в разведениях составляет соответственно 250; 25 и 2,5 мкг/см. Разведение антибиотика в молоке активностью 2,5 мкг/см является контрольным.
     
     Контрольное разведение стрептомицина используют в течение рабочего дня.
     
     3.4.6.4 Взамен контрольного разведения стрептомицина для проверки активности роста тест-микроба могут быть использованы диски со стрептомицином по 3.2.10.
     
     3.4.7 Подготовка проб молока к анализу
     
     Каждую пробу молока наливают по 5-10 см в чистую стерильную пробирку, прогревают в течение (10±1) мин на водяной бане при температуре внутри пробирки (87±2) °С и охлаждают в холодной воде до температуры 18-25 °С.
     

     3.5 Проведение анализа

     
     3.5.1 Непосредственно перед исследованием молока на поверхности агаровой среды, разлитой в чашки Петри по 3.4.4, пробойником или пробочным сверлом вырезают семь лунок диаметром 10 мм. Шесть лунок располагают по окружности чашки на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии 28 мм их центров от центра чашки. Седьмую лунку вырезают в центре чашки (рисунок 1) только в случае использования контрольного разведения антибиотика.
     
     


Рисунок 1 - Схема вырезания лунок в агаровой среде

     
     
     3.5.2 В центральную лунку вносят 0,05 см контрольного разведения антибиотика по 3.4.6.3 или в центре чашки на поверхность засеянной агаровой среды помещают диск со стрептомицином по 3.2.10. В лунки, расположенные по окружности чашки, вносят по 0,05 см исследуемых проб молока по 3.4.7.
     
     3.5.3 Чашки Петри выдерживают при комнатной температуре в течение (20±1) мин, затем их помещают в термостат крышками вверх и инкубируют при температуре (55±1) °С в течение 4 ч. Чашки в термостате размещают в один ряд.
     

     3.6 Обработка результатов

     
     3.6.1 Результаты анализа оценивают непосредственно после инкубирования. Чашки просматривают в проходящем свете от любого источника света.
     
     Диаметры зон ингибиции роста тест-культуры, образуемых испытуемым образцом молока и контрольным разведением антибиотика, измеряют линейкой или на аппарате Микрофот 5ПО-1 по краям окружностей зон.
     
     3.6.2 При отсутствии зон ингибиции контрольного разведения стрептомицина исследования повторяют с использованием вновь приготовленных засеянных чашек по 3.4.4 и контрольного разведения антибиотика по 3.4.6.
     
     3.6.3 При отсутствии антибиотиков в молоке диаметр зоны ингибиции должен быть менее 12 мм, а при их наличии - 12 мм и более.
     

     3.7 Метрологические характеристики

     
     3.7.1 Наименьшие пределы определения антибиотиков представлены в таблице 1.
     
     
Таблица 1
     

Наименование антибиотика

Наименьший предел определения, Ед/г (мкг/г)*

Бензилпенициллин

0,005

Стрептомицин

0,5-1,0

Тетрациклин

0,1

Окситетрациклин

0,1

Хлортетрациклин

0,05

Эритромицин

0,05

Неомицин

0,25

Мономицин

0,25

Левомицетин

2,5

Олеандомицин

2,5

________________
     * 1 мкг активного вещества равен 1 Ед активности.

     
     
     4 Метод с индикатором бромкрезолпурпуром
     

     4.1 Сущность метода

     
     Метод основан на изменении окраски агаровой среды со спорами Вас. stearothermophilus var. calidolactis C953 от фиолетовой до желтой при отсутствии в исследуемом молоке антибиотиков и других ингибирующих веществ и сохранении окраски - при их наличии.
     
     4.2 Аппаратура, материалы и реактивы
     
     4.2.1 Термостат, позволяющий поддерживать температуру от 30 до 70 °С с допускаемыми отклонениями ±0,5 °С от заданной.
     
     4.2.2 Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.
     
     4.2.3 Среда агаровая "Delvotest" со спорами Вас. stearothermophilus и индикатором бромкрезол пурпуром, фасованная в герметично укупоренные ампулы вместимостью 1,0 см, собранные в блоки.
     
     4.2.4 Среда питательная таблетированная "Delvotest", фасованная в бутылочки из темного стекла с навинчивающимся колпачком.
     
     4.2.5 Шприц-дозатор автоматический вместимостью 1,0 см, настроенный на объем пробы 0,1 см.
     
     4.2.6 Наконечники пластмассовые одноразовые, вместимостью 0,1 см.
     
     4.2.7 Пинцет.
     
     4.2.8 Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.
     
     Допускается применять другие средства измерений с метрологическими характеристиками и оборудование с техническими характеристиками не хуже указанных.
     

     4.3 Отбор проб

     
     4.3.1 Отбор проб и подготовка их к анализу - по ГОСТ 9225.
     
     4.3.2 Допускается хранить пробы в холодильнике в течение 24 ч при температуре (6±2) °С.
     

     4.4 Подготовка к анализу

     
     4.4.1 Стеклянную бутылочку с питательными таблетками вынимают из холодильника и выдерживают в течение 20 мин при температуре от 15 до 25 °С.
     
     4.4.2 Осторожно, не повреждая упаковки, отрезают от блока необходимое количество ампул (с учетом контрольной пробы) и маркируют. Оставшиеся ампулы хранят в холодильнике.
     
     4.4.3 Отвинчивают колпачок бутылочки и помещают его на стол вниз донышком. Пинцетом вынимают капсулу с силикагелем и поролоновый уплотнитель. Насыпают в колпачок необходимое количество таблеток питательной среды. Поролоновый уплотнитель и капсулу с силикагелем помещают в бутылочку.
     

     4.5 Проведение анализа

     
     4.5.1 Соединительной частью шприца прокалывают укупорку ампул.
     
     4.5.2 В каждую ампулу пинцетом помещают по одной таблетке питательной среды "Delvotest". Бутылочку со средой плотно закрывают колпачком и сохраняют в дальнейшем при комнатной температуре.
     
     4.5.3 Шприцем отбирают 0,1 см пробы молока и вносят в ампулу. Для каждой пробы молока используют новый наконечник. Оставшееся молоко сохраняют до конца анализа в холодильнике при температуре (6±2) °С.
     
     4.5.4 Ампулы "Delvotest" помещают в термостат и выдерживают при температуре (64,0±0,5) °С в течение 3 ч.
     
     4.5.5 Контрольное определение проводят в соответствии с 4.5.1; 4.5.2 и 4.5.4. В ампулу вносят 0,1 см предварительно восстановленного по ГОСТ 23454 препарата СКИВ.
     
     4.6 Обработка результатов
     
     4.6.1 Ампулы извлекают из термостата и определяют цвет содержимого.
     
     4.6.2 Желтый цвет содержимого ампул с контрольным и анализируемыми образцами молока свидетельствует об отсутствии в молоке ингибирующих веществ. Фиолетовое кольцо на поверхности содержимого ампулы (размером не более 1 мм) не учитывают.
     
     4.6.3 Фиолетовый цвет содержимого ампул с анализируемым образцом молока свидетельствует о наличии в молоке ингибирующих веществ.
     
     4.6.4 Вывод о наличии в молоке антибиотиков делают после дополнительных исследований молока по ГОСТ 24065-ГОСТ 24067 и при получении отрицательных результатов.
     

     4.7 Метрологические характеристики

     
     4.7.1 Наименьшие пределы определения антибиотиков представлены в таблице 2.
     
     
Таблица 2
     

Наименование антибиотика

Наименьший предел определения, Ед/г (мкг/г)

Бензилпенициллин

0,0025

Клоксациллин

0,020

Диклоксациллин

0,010

Оксациллин

0,010

Нафциллин

0,010

Ампициллин

0,003

Амоксициллин

0,003

Цефапирин

0,005

Цефалониум

0,015

Цефалексин

0,060

Цефацетрил

0,020

Цефаперазон

0,060

Тетрациклин

0,300

Окситетрациклин

0,400

Хлортетрациклин

0,300

Тилозин

0,100

Эритромицин

0,250

Линкомицин

0,300

Гентамицин

0,400

Неомицин

0,400

Дигидрострептомицин

2,500

Левомицетин/хлорам-феникол/

7,500

     
     
     5 Требования безопасности

     
     Работу со споровой культурой тест-микроба в лаборатории проводят в соответствии с санитарными правилами по [1].
     
     

ПРИЛОЖЕНИЕ А
(справочное)

      
Библиография

     
     [1] СП 1.2.731-99 Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами
     
     
     
Текст документа сверен по:
официальное издание
Молоко и молочные продукты.
Общие методы анализа: Сб. ГОСТов. -
М.: ИПК Издательство стандартов, 2004