ГОСТ Р 51198-98
(ИСО 4134-78)

Группа Н19

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МЯСО И МЯСНЫЕ ПРОДУКТЫ

Метод определения -(+)-глутаминовой кислоты

Meat and meat products.
Method for determination of  -(+)-glytamic acid content

     
     
ОКС 67.120.10
ОКСТУ 9209

Дата введения 2000-01-01

Предисловие

     
     1 РАЗРАБОТАН Московской государственной академией пищевых производств
     
     ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 "Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность"
     
     2 ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 28 августа 1998 г. N 336
     
     3 Настоящий стандарт представляет собой аутентичный текст международного стандарта ИСО 4134-78 "Мясо и мясные продукты. Определение содержания -(+)-глутаминовой кислоты" с дополнительными требованиями, отражающими потребности экономики страны (2, 4, 6.6, 6.8, 6.12, 6.13, 7.1 и 9.1)
     
     4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
     
     5 ПЕРЕИЗДАНИЕ
     
     

     1 Область применения

     
     Настоящий стандарт распространяется на мясо и мясные продукты и устанавливает метод определения -(+)-глутаминовой кислоты.
     
     

     2 Нормативные ссылки

     
     ГОСТ 9793-74 Продукты мясные. Методы определения влаги
     
     ГОСТ Р 51447-99 (ИСО 3100-1-91) Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб
     
     

     3 Определение

     
     Массовая доля -(+)-глутаминовой кислоты - массовая доля -(+)-глутаминовой кислоты, определенная в соответствии с настоящим стандартом и выраженная в процентах.
     
     

     4 Сущность метода

     
     -(+)-глутаминовую кислоту экстрагируют из пробы продукта, взятой на испытание, ледяным раствором хлорной кислоты. Смесь центрифугируют, фильтруют и доводят активную кислотность фильтрата до требуемого значения. Проводят ферментативное преобразование -(+)-глутамата в -кетоглутарат в ходе реакции с никотинамидадениндинуклеотидом (НАД) в присутствии глутаматдегидрогеназы (ГДГ):
     

-(+)-глутамат + НАД + НО  -кетоглутарат + НАДН + NН + Н.

     
     Затем окисляют эквивалентное количество восстановленной формы НАДН хлоридом йодонитротетразолия (ИНТ) в присутствии липоаминдегидрогеназы (ЛАДГ):
     

НАДН + ИНТ-хлорид + Н HAД + формазан.

     
     Измеряют массовую долю образовавшегося формазана на спектрофотометре при длине волны 492 нм.
     
     

     5 Реактивы

     
     Все реактивы должны быть аналитического качества (не ниже х.ч.). Все растворы, кроме растворов неорганических соединений (5.1 и 5.2), должны храниться в закрытой посуде из темного стекла, тщательно вымытой и пропаренной или стерилизованной.
     
     Вода, используемая для приготовления растворов ферментов, должна быть деминерализованной или бидистиллированной, полученной в стеклянном дистилляторе.
     
     Вода, используемая для приготовления растворов химических реагентов и подготовки проб, должна быть дистиллированной или деминерализованной.
     
     Примечание - Однократно дистиллированная вода может содержать ионы металлов, которые снижают активность ферментов, а деминерализованная вода может содержать микроорганизмы, увеличивающие неспецифическую фоновую ферментативную активность и искажающие результаты анализа.
     
     
     Препарат НАД должен содержать не менее 90% основного вещества.
     
     -(+)-глутаминовая кислота должна содержать не менее 98% основного вещества.
     
     Допускается использовать имеющиеся в продаже готовые наборы реактивов при условии соответствия качества реактивов требованиям настоящего стандарта.
     
     5.1 Раствор хлорной кислоты (HClO)=1,0 моль/дм
     
     8,6 см раствора хлорной кислоты массовой доли 70% и плотности 1,67 г/см помещают в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят объем раствора до метки водой.
     
     Примечание - При использовании хлорной кислоты меньшей массовой доли проводят перерасчет объема кислоты, используемой для осаждения белков.
     
     
     5.2 Раствор гидроксида калия  (KOH)=2 моль/дм
     
     Растворяют 56,1 г гидроксида калия (KOH) в воде, доводят объем раствора до 500 см.
     
     5.3 Буферный раствор активной кислотности 8,6 рН
     
     5.3.1 Растворяют 1,86 г гидрохлорида триэтаноламина в воде, доводят активную кислотность раствора до 8,6 рН раствором гидроксида калия (5.2), используя для измерений рН-метр. Затем добавляют 0,68 г октилфенолдекаэтиленгликолевого эфира (например, Тритон =100) и доводят объем раствора до 100 см водой.
     
     5.3.2 Растворяют 0,86 г двузамещенного фосфорнокислого калия (KНРO) и 0,007 г однозамещенного фосфорнокислого калия (KНРO) в воде и доводят объем раствора до 100 см.
     
     5.3.3 Смешивают 20 см раствора по 5.3.1 и 5 см раствора по 5.3.2.
     
     Раствор хранят при температуре 4 °С.
     
     5.4 Раствор НАД
     
     Навеску НАД массой 0,025 г растворяют в 5,0 см воды в небольшой колбе со шлифом, колбу закрывают пробкой.
     
     Раствор устойчив не менее 1 мес при температуре 4 °С.
     
     5.5 Раствор йодонитротетразолия [2-(р-йодофенил)-3-(р-нитрофенил)-5-фенилтетразолия] хлорида (ИНТ-хлорида)
     
     Растворяют 0,030 г ИНТ-хлорида в 50 см воды, колбу закрывают пробкой.
     
     Раствор устойчив не менее 2 мес при температуре 4 °С в темноте.
     
     5.6 Раствор ЛАДГ
     
     Растворяют 0,003 г лиофильно высушенной липоаминдегидрогеназы в 1 см воды.
     
     Раствор устойчив не менее трех недель при температуре 4 °С.
     
     5.7 Раствор ГДГ
     
     Используют раствор глютаматдегидрогеназы концентрации 10 мг/см, свободный от сульфата аммония, этилендиаминтетрауксусной кислоты и глутаминазы, поставляемый в готовом виде (например в расфасовке по 1,0 см), удельной активностью не менее 900 Е/см.
     
     Раствор устойчив не менее 12 мес при температуре 4 °С.
     
     5.8 Стандартный раствор -(+)-глутаминовой кислоты
     
     Растворяют 0,050 г -(+)-глутаминовой кислоты в 25 см воды. Активную кислотность раствора устанавливают 7,0 рН раствором гидроксида калия (5.2), после чего доводят объем раствора до 50 см.
     
     Раствор хранят при температуре 4 °С и непосредственно перед использованием разводят водой в соотношении объемов 1:49.
     
     

     6 Средства контроля и вспомогательные устройства

     
     Обычная лабораторная аппаратура, а также указанная в 6.1-6.11.
     
     6.1 Мясорубка механическая лабораторная, снабженная перфорированной пластинкой с отверстиями диаметром не более 4 мм.
     
     6.2 Миксер лабораторный.
     
     6.3 Центрифуга лабораторная с пробирками вместимостью 50 или 100 см.
     
     6.4 Иономер или рН-метр диапазоном измерений от 1 до 14 рН и допускаемой погрешностью ±0,05 рН.
     
     6.5 Фильтры бумажные гофрированные диаметром 15 см.
     
     6.6 Колбы мерные вместимостью 100 и 250 см и допускаемой относительной погрешностью ±0,2%.
     
     6.7 Дозаторы пипеточные объемами доз 25, 50 и 100 см и относительной погрешностью дозирования ±1%.
     
     6.8 Пипетки градуированные вместимостью 0,05; 0,2; 0,5 и 2,5 см и допускаемой относительной погрешностью ±1%.
     
     6.9 Шпатели пластиковые или палочки стеклянные для перемешивания содержимого кюветы при проведении фотометрических измерений.
     
     6.10 Спектрофотометр (фотометр) со следующими техническими характеристиками: спектральный интервал - не более 10 нм; интервал измерений оптической плотности - от 0,000 до 2,000; погрешность установки длины волны - ±3 нм; среднее квадратическое отклонение случайной составляющей погрешности измерений - не более 0,15%.
     
     6.11 Кюветы фотометрические толщиной поглощающего слоя 10 мм.
     
     6.12 Термометр жидкостный стеклянный с интервалом измерений от 0 до 100 °С, допускаемой погрешностью измерений ±2 °С.
     
     6.13 Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 200 г и допускаемой погрешностью ±0,001 г.
     
     

     7 Порядок подготовки к проведению измерений

     
     7.1 Отбор проб - по ГОСТ Р 51447.
     
     7.2 Пробу массой не менее 200 г, полученную из репрезентативной выборки, хранят в условиях, предотвращающих порчу и изменение состава.
     
     

     8 Порядок проведения измерений

     
     8.1 Подготовка пробы к проведению измерений
     
     Образец пробы гомогенизируют, дважды пропуская через мясорубку (6.1) и тщательно перемешивая.
     
     Образец хранят не более 24 ч в заполненном доверху и герметически закрытом контейнере таким образом, чтобы предотвратить порчу или изменение состава.
     
     8.2 Навеска для проведения анализа
     
     Взвешивают приблизительно 50 г исследуемого образца с точностью до 10 мг и помещают навеску образца в лабораторный миксер (6.2).
     
     8.3 Приготовление экстракта
     
     8.3.1 К навеске образца в лабораторном миксере добавляют 100 см охлажденного льдом раствора хлорной кислоты (5.1) и гомогенизируют.
     
     8.3.2 Часть гомогенизата помещают в центрифужную пробирку и центрифугируют 10 мин при угловой скорости 3000 мин, затем, осторожно отодвинув слой жира, отфильтровывают супернатант через гофрированный бумажный фильтр (6.5) в коническую колбу вместимостью 200 см. Первые 10 см фильтрата выбрасывают.
     
     8.3.3 50 см подготовленного раствора, который может быть слегка мутным, переносят в стаканчик вместимостью 100 см и доводят активную кислотность раствора до 10 рН раствором гидроксида калия (5.2).
     
     8.3.4 Количественно переносят содержимое стаканчика в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят объем раствора до метки водой.
     
     8.3.5 Раствор охлаждают в ледяной бане 20 мин и фильтруют через гофрированный бумажный фильтр (6.5), отбросив первые 10 см фильтрата.
     
     8.3.6 25 см фильтрата переносят в мерную колбу вместимостью 250 см и доводят объем фильтрата до метки водой.
     
     Примечание - Объем фильтрата выбирают так, чтобы концентрация -(+)-глутаминовой кислоты была приблизительно 0,030 г/дм.
     
     
     8.4 Определение
     
     8.4.1 Температуру растворов по 5.3 и 8.3.6 доводят до 20-25 °С. Для проведения ферментативной реакции берут две фотометрические кюветы (6.11), в каждую из которых пипеточным дозатором (6.5) добавляют:
     
     - 2,50 см буферного раствора (5.3);
     
     - 0,20 см раствора НАД (5.4);
     
     - 0,20 см раствора ИНТ (5.5) и
     
     - 0,05 см раствора линоаминдегидрогеназа (5.6).
     
     Затем в одну кювету вносят 0,50 см экстракта (8.3.6), получая исследуемый раствор, а во вторую - 0,50 см воды, получая контрольный раствор.
     
     Растворы в кюветах перемешивают пластиковыми шпателями или стеклянными палочками (6.9) и измеряют оптические плотности относительно воздуха при длине волны 492 нм:  - оптическая плотность исследуемого раствора,  - оптическая плотность контрольного раствора.
     
     Температура растворов должна быть от 20 до 25 °С.
     
     8.4.2 В каждую кювету вносят по 0,05 см раствора ГДГ (5.7) и тщательно смешивают с содержимым, используя шпатель или стеклянную палочку (6.9).
     
     Растворы выдерживают 15 мин. Затем измеряют оптические плотности при длине волны 492 нм, повторяя измерения через каждые 2 мин до достижения постоянных значений.
     
     Строят графики зависимости оптических плотностей растворов от времени и экстраполируют их на момент внесения фермента ГДГ (приложение А).
     
     Получают экстраполированные значения оптических плотностей исследуемого () и контрольного () растворов.
     
     8.4.3 Определяют микромолярный коэффициент оптической плотности формазана, повторяя операции по 8.4.1 и 8.4.2, но заменяя 0,5 см экстракта в первой фотометрической кювете на 0,5 см стандартного раствора -(+)-глутаминовой кислоты (5.8).
     
     Получают следующие значения оптических плотностей:
     
     -  - стандартного раствора -(+)-глутаминовой кислоты;
     
     -  - контрольного раствора;
     
     -  - стандартного раствора -(+)-глутаминовой кислоты;
     
     -  - контрольного раствора.
     
     8.5 Выполняют два параллельных определения в двух пробах из одного и того же образца (8.1).
     
     

     9 Правила обработки результатов измерений

     
     9.1 Метод расчета
     
     Массовую долю -(+)-глутаминовой кислоты в пробе , %, вычисляют по формуле     

     
где ;
     
      - молярная масса -(+)-глутаминовой кислоты;
     
      - массовая доля влаги в пробе, определенная по ГОСТ 9793;
     
      - масса навески (8.2), г;
     
      - объем фильтрата, взятый на определение (8.3.6), см;
     
      - микромолярный коэффициент оптической плотности формазана при длине волны 492 нм, см/мкмоль, рассчитанный по формуле
     

,

     
где .
     
     За результат измерений принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений при условии выполнения 9.2.
     
     Результат определяют с точностью 0,01%.
     
     9.2 Сходимость
     
     Относительное расхождение результатов двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, не должно превышать 10% среднеарифметического значения.
     
     

     10 Оформление результатов измерений

     
     В отчете об испытании должны быть указаны:
     
     - используемый метод;
     
     - полученные результаты;
     
     - любые условия проведения испытаний, не установленные данным стандартом и касающиеся подробностей, которые могут повлиять на конечный результат.
     
     В отчете должны быть все данные, необходимые для полной идентификации пробы.
     
     

ПРИЛОЖЕНИЕ А
(справочное)

Пример построения графика зависимости оптической плотности раствора
от времени

     
     
     
Текст документа сверен по:
официальное издание
Продукты мясные. Методы анализа: Сб. ГОСТов. -
М.: ИПК Издательство стандартов, 2003