ГОСТ Р 50929-96

Группа С19

     
     
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

     
     
ПРЕМИКСЫ

     
Методы определения витаминов группы В

     
Premixes. Methods for determination of vitamin В complex

     
     
ОКС 65.120.19*
ОКСТУ 9209
_______________
     * В указателе "Национальные стандарты" 2007 год ОКС 65.120. -
Примечание изготовителя базы данных.

Дата введения 1997-01-01

     
     
Предисловие

     
     1 РАЗРАБОТАН Акционерным обществом открытого типа "Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности" (АООТ "ВНИИКП")
     
     Нижегородским государственным техническим университетом
     
     ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 4 "Комбикорма, БВД, премиксы"
     
     2 ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 29 июля 1996 г. N 488
     
     3 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
     
     

     1 ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

     
     Настоящий стандарт распространяется на премиксы и устанавливает методы определения витаминов В, В, холинхлорида, В химическими методами и высокоэффективной жидкостной хроматографией.
     
     

     2 НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ

     
     В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:
     
     ГОСТ 61-75 Кислота уксусная. Технические условия
     
     ГОСТ 246-76 Гидросульфит натрия технический. Технические условия
     
     ГОСТ 427-75 Линейки измерительные металлические. Технические условия
     
     ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия
     
     ГОСТ 2603-79 Ацетон. Технические условия
     
     ГОСТ 3118-77 Кислота соляная. Технические условия
     
     ГОСТ 4109-79 Бром. Технические условия
     
     ГОСТ 4139-75 Калий роданистый. Технические условия
     
     ГОСТ 4166-76 Натрий серно-кислый. Технические условия
     
     ГОСТ 4174-77 Цинк сернокислый 7-водный. Технические условия
     
     ГОСТ 4201-79 Натрий углекислый кислый. Технические условия
     
     ГОСТ 4204-77 Кислота серная. Технические условия
     
     ГОСТ 4206-75 Калий железосинеродистый. Технические условия
     
     ГОСТ 4234-77 Калий хлористый. Технические условия
     
     ГОСТ 4328-77 Натрия гидроокись. Технические условия
     
     ГОСТ 4530-76 Кальций углекислый. Технические условия
     
     ГОСТ 6016-77 Спирт изобутиловый. Технические условия
     
     ГОСТ 6217-74 Уголь активный древесный дробленый. Технические условия
     
     ГОСТ 6552-80 Кислота ортофосфорная. Технические условия
     
     ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
     
     ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия
     
     ГОСТ 9337-79 Натрий фосфорнокислый 12-водный. Технические условия
     
     ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
     
     ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб
     
     ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия
     
     ГОСТ 19908-90 Тигли, чаши, стаканы, колбы, воронки, пробирки и наконечники из прозрачного кварцевого стекла. Общие технические условия
     
     ГОСТ 24104-88* Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия
_______________
     * На территории Российской Федерации действует ГОСТ 24104-2001, здесь и далее по тексту. - Примечание изготовителя базы данных.
          
     ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
     

     ГОСТ 25664-83 Метол (4-метиламинофенол сульфат). Технические условия
     
     ГОСТ 26573.0-85. Премиксы. Технические условия
     
     ГОСТ 27067-86 Аммоний роданистый. Технические условия
     
     ГОСТ 29227-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
     
     ГОСТ 29228-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 2. Пипетки градуированные без установленного времени ожидания
     
     ГОСТ 29251-91 Посуда лабораторная стеклянная. Бюретки. Часть 1. Общие требования
     
     ГОСТ 29252-91 Посуда лабораторная стеклянная. Бюретки. Часть 2. Бюретки без времени ожидания
     
     

     3 ОТБОР ПРОБ

     
     Отбор проб по ГОСТ 13496.0
     
     

     4 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА B

     
     Сущность метода заключается в извлечении витамина В (тиамина) из навески анализируемого продукта раствором серной кислоты, окислении его раствором железосинеродистого калия в тиохром, экстракции окисленной формы из водной фазы изобутиловым спиртом и измерении интенсивности флуоресценции.
     
     4.1 Аппаратура, материалы и реактивы
     
     Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104*.

     
     Флуорометр Квант-7, ФАНК-1
     
     Аппарат для встряхивания жидкости типа АВУ-1
     
     Колбы мерные 2-50(100)-1(2) по ГОСТ 1770.
     
     Воронки стеклянные типа В по ГОСТ 25336.
     
     Пробирки П-1(2)-25-0,2 по ГОСТ 1770.
     
     Шкаф сушильный с терморегулятором, обеспечивающий постоянство температуры (105±2) °С.
     
     Воронки делительные типа ВД вместимостью 100 см по ГОСТ 25336.
     
     Стаканы В-1-100ТХС по ГОСТ 25336.
     
     Пипетки градуированные 4(5)-1(2)-1(2), 6(7)-1(2)-5(10) по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.
     
     Цилиндры 1(2, 3, 4)-25(50, 100) по ГОСТ 1770.
     
     Фильтры обеззоленные (красная лента) по нормативному документу [3].
     
     Кислота серная по ГОСТ 4204, раствор молярной концентрации (HSO)=0,1 моль/дм.
     
     Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор в соотношении 1:1 (по объему) и раствор молярной концентрации (НСl)=0,01 моль/дм.
     
     Калий хлористый по ГОСТ 4234.
     
     Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, раствор с массовой долей 10%.
     
     Спирт изобутиловый по ГОСТ 6016.
     
     Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166.
     
     Калий железосинеродистый (красная кровяная соль) по ГОСТ 4206, раствор с массовой долей 1%.
     
     Хининсульфат или хининхлорид по нормативным документам [9, 10].
     
     Тиминбромид или тиаминхлорид по нормативным документам [16, 17].
     
     Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
     
     Примечания
     
     1 Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.
     
     2 Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.
     

     
     4.2 Подготовка к испытанию
     
     4.2.1 Приготовление окислительной смеси
     
     1 см свежеприготовленного раствора железосинеродистого калия смешивают с 49 см раствора гидроокиси натрия.
     
     Смесь готовят в день проведения анализа.
     
     4.2.2 Приготовление основного стандартного раствора из хининсульфата
     
     10 мг хининсульфата растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см в растворе серной кислоты и доводят этой кислотой объем до метки. Раствор хранится не более 1 года в склянке из темного стекла.
     
     4.2.3 Приготовление рабочего стандартного раствора хининсульфата
     
     Рабочий стандартный раствор готовят непосредственно перед анализом. Для этого 1 см основного стандартного раствора (4.2.2) переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят до метки раствором серной кислоты.
     
     Концентрация хининсульфата - 1 мкг/см.
     
     4.2.4 Приготовление основного стандартного раствора из тиамин-бромида
     
     Взвешивают 10 мг кристаллического тиаминбромида, предварительно высушенного в сушильном шкафу в течение 2-3 ч при температуре 100-105 °С, растворяют его в мерной колбе вместимостью 100 см в растворе соляной кислоты молярной концентрации (НСl)=0,01 моль/дм и доводят этой кислотой объем до метки. Раствор содержит 100 мг тиамина в 1 см.
     
     Раствор хранят не более 1 мес в склянке из темного стекла в прохладном месте.
     
     4.2.5 Приготовление рабочего стандартного раствора тиаминбромида
     
     Рабочий стандартный раствор готовят непосредственно перед анализом.
     
     1 см основного стандартного раствора тиаминбромида (4.2.4) переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят до метки дистиллированной водой.
     
     Концентрация рабочего стандартного раствора тиаминбромида - 1 мкг/см.
     
     4.2.6 Контроль за содержанием витамина В в стандартном растворе проводят по 6.2.4.
     
     4.3 Проведение испытания
     
     Навеску премикса массой 5 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, помещают в мерную колбу вместимостью 100 см, добавляют 5 г хлористого калия и приливают 70 см серной кислоты. Затем колбу с реактивами встряхивают на аппарате в течение 10 мин, доводят объем в колбе до метки раствором серной кислоты, перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр, отбросив первую порцию фильтрата. Переносят 2 см фильтрата в мерную колбу вместимостью 50 см и доводят до метки раствором серной кислоты. Отбирают 20 см разбавленного фильтрата и переносят в делительную воронку, куда приливают 20 см изобутилового спирта, тщательно перемешивают в течение 2 мин. После расслоения верхний слой сливают, а нижний - переносят в градуированную пробирку и доводят до объема 20 см раствором серной кислоты, перемешивают.
     
     Из пробирки берут 8 см раствора в делительную воронку, приливают 6 см окислительной смеси (4.2.1), перемешивают, добавляют 20 см изобутилового спирта и встряхивают 2 мин. После расслоения нижний водный слой отбрасывают, а верхний (спиртовый) - фильтруют через обеззоленный фильтр (красная лента), пропуская через слой безводного сернокислого натрия (4-5 г) в флуорометрическую пробирку и флуорометрируют.
     
     Для окисления стандартного раствора берут 8 см рабочего стандартного раствора тиамина и проводят дальнейшую его обработку, как с испытуемой пробой.
     
     Для гашения флуоресценции в испытуемом и стандартном растворах к ним добавляют по 1-2 капли раствора соляной кислоты в соотношении 1:1 (по объему), перемешивают и измеряют остаточную флуоресценцию.
     
     Если в качестве стандартного раствора используют раствор хининсульфата (или хининхлорида), то его не окисляют и не гасят, так как он имеет одно и то же значение по флуорометру, равное 72.
     
     По стандартному раствору хининхлорида (хининсульфата) настраивают (по инструкции) прибор на деление прибора 80.
     
     4.4. Обработка результатов испытания
     
     Содержание витамина В в премиксе, г/т, вычисляют по формуле
     

,

     
где  - показание флуорометра для испытуемого раствора до гашения;
     
      - показание флуорометра для испытуемого раствора после гашения;
     
      - первоначальный объем раствора, см;
     
     ,  - разведения, см;
     
      - масса витамина в стандартном растворе, мкг;
     
      - показания флуорометра для стандартного раствора до гашения;
     
      - показания флуорометра для стандартного раствора после гашения;
     
      - масса навески, г;
     
      - объем испытуемого раствора, взятый на испытание, см.
     
     Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.
     
     За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности =0,95 не должны быть более 10% относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях при доверительной вероятности =0,95 расхождения не должны превышать 15%.
     
     Примечание - При использовании в качестве стандартного раствора хининсульфата (хининхлорида) в расчетную формулу вместо выражения () подставляют цифру 72.
     
     

     5 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА В

     
     Сущность метода заключается в извлечении витамина В (рибофлавина) из навески путем кислотного гидролиза и измерении интенсивности флуоресценции.
     
     5.1 Аппаратура, материалы и реактивы
     
     Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.
     
     Флуорометр Квант-7, ФАНК-1.
     
     рН-метр по нормативному документу [8].
     
     Баня водяная.
     
     Центрифуга ОПН-8.
     
     Фильтры обеззоленные (синяя лента) по нормативному документу [3].
     
     Колбы мерные 2-50(100, 1000)-1(2) по ГОСТ 1770.
     
     Пипетки градуированные 4(5)-1(2)-1, 6(7)-1(2)-25 по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.
     
     Цилиндры 1(2, 3, 4)-100 по ГОСТ 1770.
     
     Кислота уксусная по ГОСТ 61.
     
     Витамин В по нормативному документу [11].
     
     Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор с массовой долей 5% и раствор молярной концентрации (НСl)=0,1 моль/дм.
     
     Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, раствор с массовой долей 15%.
     
     Натрий двууглекислый по ГОСТ 4201.
     
     Натрия гидросульфит по ГОСТ 246.
     
     Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
     
     Примечания
     
     1 Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.
     
     2 Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.
     
     
     5.2 Подготовка к испытанию
     
     5.2.1 Приготовление основного стандартного раствора витамина В
     
     40 мг витамина В растворяют в дистиллированной воде, подкисленной 10 см ледяной уксусной кислоты, при нагревании до 50 °С в мерной колбе вместимостью 1000 см. Доводят объем до метки дистиллированной водой. В 1 см раствора содержится 40 мкг рибофлавина.
     
     Раствор хранят в прохладном, темном месте в склянке из темного стекла не более 2 мес.
     
     5.2.2 Приготовление рабочего стандартного раствора рибофлавина
     
     1 см основного стандартного раствора рибофлавина переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят до метки дистиллированной водой, подкисленной раствором соляной кислоты с массовой долей 5% до рН 5,5-6,0.
     
     В 1 см раствора содержится 0,4 мкг рибофлавина.
     
     Раствор готовят перед употреблением.
     
     5.2.3 Контроль за содержанием витамина В в стандартном растворе проводят по 6.2.4.
     
     5.3 Проведение испытания
     
     Навеску премикса массой 2-5 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, помещают в мерную колбу вместимостью 100 см, приливают 75 см раствора соляной кислоты молярной концентрации (НСl)=0,1 моль/дм, смывая частицы премикса со стенок колбы. Колбу помещают в кипящую водяную баню на 20 мин. Содержимое колбы периодически перемешивают.
     
     После охлаждения колбы рН раствора доводят до значения 5,5-6,0 раствором гидроокиси натрия. Затем объем в колбе доводят дистиллированной водой до метки, хорошо перемешивают и центрифугируют в течение 15 мин при 8000 об/мин.
     
     Из полученного фильтрата готовят раствор с нужным разведением (например, 1 см фильтрата разводят в мерной колбе вместимостью 50 см) и определяют интенсивность флуоресценции, помещая в одну флуорометрическую пробирку 12-15 см испытуемого раствора, в другую - такое же количество рабочего стандартного раствора. Затем в эти же пробирки добавляют 2-3 раза по 0,1 г двууглекислого натрия и по 0,1 г гидросульфита натрия или 4-6 капель раствора гидроокиси натрия. Содержимое пробирок осторожно перемешивают, фильтруют, если раствор мутный, и снова измеряют интенсивность флуоресценции на приборе.
     
     5.4 Обработка результатов испытания
     
     Содержание витамина В в премиксе, г/т, вычисляют по формуле
     

,

     
где  - показания флуорометра для испытуемого раствора до гашения флуоресценции;
     
      - показания флуорометра для испытуемого раствора после гашения флуоресценции;
     
      - содержание витамина В в рабочем стандартном растворе, мкг/см;
     
      - первоначальный объем раствора, см;
     
      - окончательный объем разведения, см;
     
      - показания флуорометра для стандартного раствора до гашения флуоресценции;
     
      - показания флуорометра для стандартного раствора после гашения флуоресценции;
     
      - масса навески, г,
     
      - объем раствора, взятый для разведения, см.
     
     Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.
     
     За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности =0,95 не должны быть более 10% относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях при доверительной вероятности =0,95 расхождения не должны превышать 15%.
     
     

     6 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНОВ В И В ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ

     
     Сущность метода заключается в экстракции витаминов В (тиамина) и В (рибофлавина) из навески раствором соляной кислоты и определении их на жидкостном хроматографе со спектрофотометрическим детектором с использованием обращенно-фазного режима элюирования.
     
     Метод применим в диапазоне содержания витамина В от 0,05 до 0,5 г/кг в премиксе, витамина В - от 0,1 до 2 г/кг в премиксе.
     
     6.1 Аппаратура, материалы и реактивы
     
     Хроматограф жидкостный с фотометрическим детектором и систематической погрешностью измерений не выше 10%. Допускается использовать хроматографы "Цвет-306", "Цвет-3006 со спектрофотометрическим детектором" и "Милихром".
     
     Колонка хроматографическая стальная или стеклянная высотой 150 мм и диаметром 4 мм с числом теоретических тарелок не менее 2000, заполненная сорбентом "Силасорб С-18" или "Сепарон С-18".
     
     Спектрофотометр СФ-26 или СФ-46 (спектральный диапазон 186-1100 нм).
     
     Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.
     
     Линейка измерительная металлическая по ГОСТ 427.
     
     Секундомер механический по нормативному документу [15].
     
     Сорбент "Силасорб С-18" зернением 7 мкм.
     
     рН-метр по нормативному документу [8].
     
     Мешалка магнитная ММ-5.
     
     Центрифуга лабораторная ЦЭ-2 с числом оборотов 6000 в мин.
     
     Иономер ЭБ-74 со стеклянным электродом ЭСЛ-62-07.
     
     Микрошприц МШ-10 или микропипетка МП-2.
     
     Колбы конические со шлифом вместимостью 100 см по ГОСТ 25336.
     
     Колбы мерные 2-25(50, 100, 200)-1(2) по ГОСТ 1770.
     
     Воронка ВФ-1-56(75)ХС или ВФ-2-75(110)ХС со стеклянным фильтром ПОР 100 по ГОСТ 25336.
     
     Пипетки градуированные 6(7)-1(2)-10 по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.
     
     Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.
     
     Ацетонитрил по нормативному документу [7].
     
     Натрия октилсульфонат, хроматографически чистый (изготовление Германия, фирма Pylver).
     
     Триэтиламин, перегнанный по нормативному документу [4].
     
     Кислота ортофосфорная по ГОСТ 6552.
     
     Кислота соляная по ГОСТ 3118, концентрированная и раствор молярной концентрации (НСl)=0,01 моль/дм.
     
     Витамин В по нормативному документу [11].
     
     Витамин В по нормативным документам [16, 17].
     
     Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
     
     Примечания
     
     1 Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.
     
     2 Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.
     
     
     6.2 Подготовка к испытанию
     
     6.2.1 Приготовление элюента
     
     Для приготовления 1 дм элюента смешивают 120 см ацетонитрила с 880 см дистиллированной воды, добавляют 2,5 см триэтиламина, 0,5 г октилсульфоната натрия и приливают ортофосфорную кислоту до рН 7,6 по рН-метру. Полученную смесь фильтруют через стеклянный фильтр для удаления механических примесей.
     
     Срок хранения элюента - не более 1 мес.
     
     6.2.2 Приготовление раствора-экстрагента
     
     К 1 дм дистиллированной воды прибавляют 0,8 см концентрированной (37%-ной) соляной кислоты, рН раствора 2±0,2.
     
     6.2.3 Приготовление основных стандартных растворов витаминов В и В
     
     Для приготовления основных стандартных растворов витаминов В и В берут навески 0,1 г тиаминхлорида и 0,01 г рибофлавина. Навеску тиаминхлорида растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 100 см, а рибофлавина - в мерной колбе вместимостью 200 см, при нагревании до температуры 70-80 °С и доводят дистиллированной водой до метки. Полученные растворы содержат в 1 см 1 мг витамина В и 0,05 мг витамина В соответственно.
     
     Срок хранения основных стандартных растворов витаминов В и В - не более 2 недель в холодильнике.
     
     6.2.4 Контроль за содержанием витаминов В и В в основных стандартных растворах
     
     Контроль за содержанием витаминов в основных стандартных растворах осуществляют спектрофотометрически по значениям молярных коэффициентов светопоглощения.
     
     Для этого основные стандартные растворы разбавляют дистиллированной водой в 50 раз и измеряют оптическую плотность растворов на спектрофотометре в кювете толщиной поглощающего свет слоя 1 см.
     
     Массовую концентрацию витаминов В и В рассчитывают по формуле
     

,

     
где  - оптическая плотность;
     
      - молярный коэффициент;
     
      - толщина слоя раствора, 1 см.
     
     Массовую концентрацию витаминов В и В, мг/см, рассчитывают соответственно по формулам:
     

;

,

     
где 205 - молярный коэффициент светопоглощения тиаминхлорида при рабочей длине волны 268 нм;
     
     324 - молярный коэффициент светопоглощения рибофлавина при рабочей длине волны 445 нм.
     
     6.2.5 Приготовление рабочего стандартного раствора витаминов В и В
     
     Из основных стандартных растворов готовят рабочие стандартные растворы с содержанием витаминов В - 0,02 мг и В - 0,025 мг в 1 см.
     
     Для этого в мерную колбу вместимостью 50 см помещают 1 см основного стандартного раствора тиаминхлорида (6.2.3) и 25 см основного стандартного раствора рибофлавина (6.2.3), доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают.
     
     Рабочий стандартный раствор готовят в день испытаний.
     
     6.3 Проведение испытания
     
     6.3.1 Экстракция витаминов В и В
     
     Навеску премикса массой 1 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 100 см и приливают 10 см раствора соляной кислоты молярной концентрации (НСl)=0,01 моль/дм. Колбу ставят на магнитную мешалку с включением нагрева. Перемешивание и нагрев осуществляют в течение 10 мин. Полученную суспензию переливают в центрифужную пробирку и центрифугируют при 5000-6000 об/мин в течение 3 мин. Центрифугат сливают в мерную колбу вместимостью 25 см. Коническую колбу с остатком раствора смывают небольшим количеством (около 5 см) раствора соляной кислоты молярной концентрации (НСl)=0,01 моль/дм, сливают раствор в центрифужную пробирку и снова центрифугируют. Центрифугат соединяют с первым в той же мерной колбе. Промывание центрифугированием повторяют 3-4 раза, каждый раз сливая промывные воды в ту же колбу. После этого раствор в мерной колбе доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Полученный раствор фильтруют или дополнительно центрифугируют для очищения от механических примесей и взвешенных частиц. Приготовленный раствор используют для хроматографического анализа.
     
     6.3.2 Хроматографирование
     
     Хроматографирование осуществляют в следующих условиях. Разделение проводят на колонке 4х150 мм, заполненной сорбентом (6.2.4).
     
     Подвижная фаза - элюент (6.2.1).
     
     Рабочая длина волны спектрофотометрического детектора хроматографа 254 нм. Скорость элюирования - 1,2 см/мин. Время удерживания для витамина В составляет 6 мин, а для витамина В - 8 мин. Объем загрузки анализируемого раствора - 10 мкдм. Для насыщения колонки в начале работы производится 3-5 загрузок, отмечая высоты пиков. При достижении постоянной высоты можно приступить к испытаниям. Анализируемые растворы хроматографируют каждый по три раза в одинаковых условиях. В этих же условиях хроматографируют рабочие стандартные растворы витаминов В и В.
     
     Измеряют высоты пиков, как расстояние от вершины пика до линии, проведенной в основании пика (приложение А, рисунок А.1 и приложение Б, рисунок Б.1).
     
     6.4 Обработка результатов испытания
     
     Содержание витаминов В и В и  в премиксе, г/т, вычисляют по формуле
     

,

     
где  - высота пика витамина на хроматограммах экстракта из премикса, мм;
     
      - массовая концентрация витамина в рабочем стандартном растворе, мг/см;
     
      - объем премикса с экстрактом, см;
     
      - высота пика витамина на хроматограммах рабочего стандартного раствора, мм;
     
      - масса навески премикса, г.
     
     Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.
     
     За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности =0,95 не должны быть более 10% относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях, при доверительной вероятности =0,95 расхождения не должны превышать 15%.
     
     

     7 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХОЛИНХЛОРИДА

     
     Сущность метода заключается в экстракции холинхлорида дистиллированной водой, образовании в присутствии трехзамещенного фосфата натрия комплекса рейнеката холинхлорида и измерении интенсивности окраски его ацетоновых растворов спектрофотометрически.
     
     7.1 Аппаратура, материалы и реактивы
     
     Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.
     
     Фотоэлектроколориметр - ФЭК-56М, КФК или спектрофотометр типа СФ-26.
     
     Насос вакуумный по ГОСТ 25336.
     
     Центрифуга ОПН-8.
     
     Колбы конические вместимостью 50-100 см по ГОСТ 25336.
     
     Эксикатор вакуумный по ГОСТ 25336.
     
     Стаканы химические вместимостью 200-250 см по ГОСТ 25336.
     
     Баня водяная.
     
     Колбы конические с притертой пробкой вместимостью 100 и 250 см по ГОСТ 25336.
     
     Воронка ВФО-40-ПОР-16 (Шотта N 2) по ГОСТ 25336.
     
     Аппарат для встряхивания жидкости типа АВУ-1.
     
     Колбы мерные 2-25(100)-1(2) по ГОСТ 1770.
     
     Пипетки градуированные 4(5)-1(2)-2, 6(7)-1(2)-5(10, 25) по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.
     
     Цилиндр мерный 1(2, 3, 4)-100 по ГОСТ 1770.
     
     Фильтры обеззоленные (синяя лента) по нормативному документу [3].
     
     Холинхлорид кристаллический по нормативному документу [18].
     
     Спирт этиловый по ГОСТ 18300.
     
     Натрий фосфорнокислый 12-водный по ГОСТ 9337, раствор с массовой долей 0,1%.
     
     Ацетон по ГОСТ 2603.
     
     Спирт изопропиловый по нормативному документу [1].
     
     Рейнекат аммония по нормативному документу [5].
     
     Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
     
     Примечания
     
     1 Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.
     
     2 Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.
     
     
     7.2 Подготовка к испытанию
     
     7.2.1 Приготовление осаждающего реактива
     
     2 г рейнеката аммония растворяют в 100 см этилового спирта в конической колбе при нагревании на водяной бане при температуре (40±2) °С в течение 20 мин. После охлаждения раствор фильтруют через обеззоленный складчатый фильтр. Раствор готовят в день определения.
     
     7.2.2 Приготовление стандартного раствора холинхлорида
     
     0,1 г кристаллического холинхлорида высушивают до постоянной массы в вакуум-эксикаторе и растворяют его в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 100 см. Доводят до метки дистиллированной водой. Стандартный раствор содержит 1 мг холинхлорида в 1 см.
     
     Допускается приготовление стандартного раствора из 70%-ного раствора холинхлорида с пересчетом на 100%-ную активность.
     
     7.2.3 Построение градуировочного графика
     
     В 5 конических колб вместимостью 50 см помещают 1, 2, 5, 7, 10 см стандартного раствора холинхлорида, соответственно добавляют 10 см раствора фосфата натрия и 5 см раствора рейнеката аммония и далее проводят все испытания по 7.2.4. Интенсивность окрашенных растворов измеряют на фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром или спектрофотометре при длине волны 526 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм относительно ацетона и на основании его показаний строят градуировочный график.
     
     7.2.4 Проведение испытания
     
     Навеску премикса массой 1-5 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, вносят в мерную колбу вместимостью 100 см, приливают 50 см дистиллированной воды, нагревают до 80 °С и встряхивают на аппарате 15 мин. Охлаждают колбу, объем доводят до метки дистиллированной водой и фильтруют через обеззоленный складчатый фильтр в стакан. Отбирают 5-20 см фильтрата в колбу с притертой пробкой, приливают 10 см раствора фосфорнокислого натрия и 5 см раствора рейнеката аммония. Колбу с содержимым встряхивают и оставляют на 2 ч при температуре 4 °С. После выпадения кристаллов холинхлорида раствор фильтруют на воронке Шотта N 2 с асбестовым слоем, используя вакуумный насос. Кристаллы, оставшиеся на фильтре, промывают 4-5 порциями (по 5 см) охлажденного изопропилового спирта (спирт хранится в холодильнике до полного использования). Меняют колбу и растворяют кристаллы ацетоном, приливая его в три приема по 7 см, каждый раз осторожно размешивая верхний асбестовый слой с осадком.
     
     Содержимое колбы фильтруют в мерную колбу вместимостью 25 см. Объем доводят в колбе ацетоном до метки. Интенсивность окрашенных растворов измеряют на фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром или спектрофотометре при длине волны 526 нм в кюветах толщиной поглощающего свет слоя 10 мм относительно ацетона.
     
     7.3 Обработка результатов испытания
     
     Содержание 70%-ного холинхлорида  в премиксе, г/т, рассчитывают по формуле
     

,

     
где  - масса холинхлорида, найденная по градуировочному графику, мм;
     
     1,43 - коэффициент пересчета на 70%-ный раствор холинхлорида;
     
      - общий объем экстракта, см;
     
      - масса навески, г;
     
      - объем раствора, взятый на проведение анализа, см.
     
     Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.
     
     За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности =0,95 не должны быть более 10% относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях при доверительной вероятности =0,95, расхождения не должны превышать 15%.
     
     

     8 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА В

     
     Сущность метода заключается в кислотном гидролизе связанных форм витамина В (никотиновой кислоты), очистке гидролизата, получении окрашенного раствора и колориметрическом определении в сравнении со стандартным раствором.
     
     8.1 Аппаратура, материалы и реактивы
     
     Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.
     
     Фотоэлектроколориметр типа ФЭК-56, КФК или спектрофотометр типа СФ-26 или аналогичные с диапазоном длин волн 400-440 нм.
     
     Баня водяная.
     
     Баня ледяная.
     
     Воронка Бюхнера N 3 или N 4 по ГОСТ 9147.
     
     Палочки стеклянные.
     
     Стакан химический вместимостью 1 и 2 дм по ГОСТ 25336.
     
     Склянки из темного стекла.
     
     Колбы конические вместимостью 250 дм по ГОСТ 25336.
     
     Бюретка 1-2-25 по ГОСТ 29251 и ГОСТ 29252.
     
     Фильтры обеззоленные (красная и синяя ленты) по нормативному документу [3].
     
     Колбы мерные 2-100(500, 1000)-1(2) по ГОСТ 1770.
     
     Воронки стеклянные по ГОСТ 25336.
     
     Пипетки 1(2, 4, 5)-1(2)-1(2), 6(7)-1(2)-5(10, 25) по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.
     
     Пробирки с притертой пробкой вместимостью 15 см по ГОСТ 1770.
     
     Цилиндры мерные 1(2, 3, 4)-50(100, 500) по ГОСТ 1770.
     
     Бром по ГОСТ 4109.
     
     Калий роданистый по ГОСТ 4139 или аммоний роданистый по ГОСТ 27067, растворы с массовыми долями 1 и 10%.
     
     Кальций углекислый по ГОСТ 4530.
     
     Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор молярной концентрации (НСl)=0,5 моль/дм (0,5 н.).
     
     Кислота серная по ГОСТ 4204, растворы с молярными концентрациями (HSO)=2 моль/дм и (HSO)=10 моль/дм.
     
     Витамин В по нормативному документу [12].
     
     Метол по ГОСТ 25664, раствор с массовой долей 6%.
     
     Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, растворы молярных концентраций (NaOH)=4 моль/дм и (NaOH)=10 моль/дм.
     
     Спирт этиловый по ГОСТ 18300.
     
     Уголь активный по ГОСТ 6217.
     
     Фенолфталеин по нормативному документу [6].
     
     Цинк сернокислый по ГОСТ 4174, раствор с массовой долей 80%.
     
     Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
     
     Примечания
     
     1 Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.
     
     2 Все реактивы должны быть квалификации х.ч. и ч.д.а.
     
     
     8.2 Подготовка к испытанию
     
     8.2.1 Перекристаллизация метола
     
     500 см раствора серной кислоты молярной концентрации (HSO)=0,1 моль/дм нагревают до кипения, добавляют 100 г метола и снова доводят до кипения. Если раствор сильно окрашен, к нему добавляют 10 г активного угля. Кипящий раствор быстро фильтруют через предварительно нагретую (кипящей водой) воронку Бюхнера, фильтрат переносят в большой химический стакан, приливают 0,7 дм этилового спирта (96°), размешивают, помещают в ледяную баню и оставляют на несколько часов в темном месте.
     
     Выпавшие в осадок кристаллы отфильтровывают на воронке Бюхнера, промывают на фильтре 2-3 раза этиловым спиртом, порциями по 30-40 см и высушивают на воздухе в темном месте.
     
     Подготовленный метол хранят в склянке из темного стекла в холодильнике до полного использования.
     
     8.2.2 Приготовление раствора метола
     
     Навеску перекристаллизированного метола массой (8±0,002) г вносят в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят объем до метки раствором соляной кислоты молярной концентрации (НСl)=0,5 моль/дм. Раствор готовят перед употреблением.
     
     8.2.3 Приготовление бромной воды
     
     В темную склянку с притертой пробкой 100 см дистиллированной воды, добавляют в вытяжном шкафу 4-5 см брома, хорошо встряхивают и оставляют на 1-3 сут для лучшего насыщения воды бромом. Бромную воду охлаждают в емкости со льдом в течение 30 мин.
     
     8.2.4 Приготовление роданбромидного раствора
     
     К 30 см охлажденной бромной воды по каплям прибавляют раствор роданистого калия или роданистого аммония с массовой долей 10% до светло-желтого окрашивания. Затем по каплям прибавляют эти же растворы с массовой долей 1% до полного обесцвечивания бромной воды. К обесцвеченному раствору постепенно, небольшими порциями, по 20-50 мг, добавляют углекислый кальций до прекращения выделения пузырьков газа.
     
     Раствор фильтруют от осадка через обеззоленный фильтр с синей лентой в склянку из темного стекла с притертой пробкой и хранят на холоде. Раствор готовят непосредственно перед употреблением.
     
     8.2.5 Приготовление основного стандартного раствора витамина В
     
     (500±0,002) мг витамина В помещают в мерную колбу вместимостью 500 см, добавляют 200 см дистиллированной воды, 5 см раствора серной кислоты молярной концентрации (HSO)=10 моль/дм и после растворения кристаллов доводят объем дистиллированной водой до метки.
     
     В 1 см раствора содержится 1000 мкг витамина В.
     
     Раствор годен к употреблению в течение 6 мес при хранении в холодильнике.
     
     8.2.6 Приготовление рабочего стандартного раствора витамина В
     
     5 см основного стандартного раствора витамина В разводят дистиллированной водой в колбе вместимостью 1 дм, доводят до метки этой же водой и тщательно перемешивают. В 1 см раствора содержится 5 мкг витамина В. Раствор готовят в день проведения анализа.
     
     8.3 Проведение испытания
     
     Навеску массой 5 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см, смывая горлышко колбы 60-65 см раствора серной кислоты молярной концентрации (HSO)=2 моль/дм. Содержимое перемешивают и колбу помещают в кипящую водяную баню на 40 мин, периодически перемешивая содержимое. По окончании гидролиза колбу охлаждают до комнатной температуры, доводят объем дистиллированной водой до метки, перемешивают и фильтруют через бумажный складчатый фильтр, отбрасывая первые 5-10 см фильтрата.
     
     Отбирают 10-20 см фильтрата в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят объем до метки дистиллированной водой. Затем 25 см полученного раствора помещают в цилиндр вместимостью 50 см, добавляют 1-2 капли раствора фенолфталеина и нейтрализуют, внося по каплям раствор гидроокиси натрия молярной концентрации (NaOH)=10 моль/дм до получения слабо-розового окрашивания. Избыток щелочи нейтрализуют раствором серной кислоты молярной концентрации (HSO)=2 моль/дм, добавляя по каплям до исчезновения розового окрашивания. Раствор охлаждают, добавляют 2 см раствора сернокислого цинка и 1-2 капли этилового спирта (для устранения пены).
     
     Из пипетки по каплям добавляют раствор гидроокиси натрия молярной концентрацией (NaOH)=4 моль/дм, одновременно перемешивая палочкой до образования осадка и появления бледно-розового окрашивания раствора. Избыток щелочи нейтрализуют раствором серной кислоты молярной концентрации (HSO)=2 моль/дм (до исчезновения розового окрашивания) и оставляют стоять в течение 10 мин, периодически перемешивая. Палочку вынимают, обмывают над цилиндром дистиллированной водой и доводят объем до 50 см, перемешивают и фильтруют через бумажный складчатый фильтр.
     
     Цветную реакцию проводят в восьми пробирках с притертыми пробками: в одну пробирку вносят 5 см дистиллированной воды (контроль на реактивы, В); в три пробирки вносят по 5 см рабочего стандартного раствора, В; в четыре пробирки вносят по 5 см полученного фильтрата, из них 2 пробирки, с испытуемым раствором А; две - поправка на аминореагирующие вещества, А.
     
     Все пробирки, кроме А, помещают на 5 мин в водяную баню при температуре (50±2) °С. После этого в 2 пробирки (А) вносят по 2 см дистиллированной воды, а во все остальные пробирки - по 2 см роданбромидного раствора из бюретки в вытяжном шкафу. Пробирки закрывают пробками, перемешивают и помещают в баню при той же температуре на 10 мин. По истечении этого времени пробирки вынимают, охлаждают водой до комнатной температуры и ставят на 10 мин в темное место. Затем в каждую пробирку приливают по 3 см раствора метола, перемешивают и оставляют на 1 ч в темном месте при комнатной температуре. По истечении этого времени растворы фильтруют через бумажный складчатый фильтр, если они мутные, и колориметрируют на фотоэлектроколориметре (синий светофильтр) или спектрофотометре при длине волны 400-440 нм в кювете толщиной поглощающего свет слоя 10 мм относительно дистиллированной воды.
     
     8.4 Обработка результатов испытания
     
     Содержание витамина В в премиксе, г/т, рассчитывают по формуле
     

,

     
где  - оптическая плотность испытуемого раствора (среднее из двух параллельных определений);
     
      - оптическая плотность раствора - поправки на аминореагирующие вещества (среднее из двух параллельных определений);
     
      - объем гидролизата, см;
     
      - объем разведения, см;
     
      - объем раствора после обработки сернокислым цинком, см;
     
      - масса витамина В в измеряемом стандартном растворе, мкг;
     
      - оптическая плотность стандартного раствора (среднее из трех параллельных определений);
     
      - оптическая плотность раствора - контроль на реактивы;
     
      - масса навески премикса, г;
     
      - объем, взятый на дополнительное разведение, см;
     
      - объем гидролизата, взятый на обработку сернокислым цинком, см;
     
      - объем раствора, взятый для проведения цветной реакции, см.
     
     Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.
     
     За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности =0,95 не должны быть более 10% относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях, при доверительной вероятности =0,95 расхождения не должны превышать 15%.
     
     

     9 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА В ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ

     
     9.1 Определение витамина В с применением жидкостного микроколоночного хроматографа отечественного производства марки "Милихром".
     
     Сущность метода заключается в экстракции витамина В (никотиновой кислоты) из навески премикса раствором соляной кислоты и последующем определении его содержания в испытуемом растворе с помощью хроматографа "Милихром".
     
     9.1.1 Аппаратура, материалы и реактивы
     
     Хроматограф жидкостный микроколоночный "Милихром" со спектрофотометрическим детектором (спектральный диапазон от 190 до 360 нм).
     
     Колонка хроматографическая размером 2х120 мм с числом теоретических тарелок не менее 4000, заполненная одним из следующих сорбентов: Силасорб С18, Силасорб SPHC 18, Сепарон С18.
     
     Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.
     
     Колбы конические КН-100, КН-200 по ГОСТ 19908.
     
     Баня водяная с терморегулятором.
     
     Пипетки 2-1(2)-1, 2-1(2)-5, 2-1(2)-10 по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.
     
     Колбы мерные 2-50-1(2), 2-100-1(2), 2-200-1(2) по ГОСТ 1770.
     
     Воронка ВФ-1-40-ПОР 16-ХС по ГОСТ 25336.
     
     Воронка 71 по ГОСТ 19908.
     
     Стакан ВН-50, ВН-200 по ГОСТ 19908.
     
     рН-метр по нормативному документу [8].
     
     Цилиндр мерный 2-50, 2-100 по ГОСТ 1770.
     
     Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, раствор с массовой долей 40%.
     
     Кислота серная по ГОСТ 4204, раствор молярной концентрации (HSO)=5 моль/дм.
     
     Кислота уксусная по ГОСТ 61, с массовой долей 95%.
     
     Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор молярной концентрации (НСl)=0,1 моль/дм.
     
     Витамин В по нормативному документу [12].
     
     Фенолфталеин по нормативному документу [6].
     
     Триметиламин по нормативному документу [2].
     
     Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.
     
     Примечания
     
     1 Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.
     
     2 Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.
     
     
     9.1.2 Подготовка к испытанию
     
     9.1.2.1 Приготовление элюента для хроматографии
     
     Трехкомпонентный элюент готовят смешиванием уксусной кислоты, дистиллированной воды и триметиламина в объемном соотношении 3:95:2. Для этого в мерную колбу вместимостью 500 см вносят пипеткой 15 см концентрированной уксусной кислоты, затем цилиндром вносят 100 см дистиллированной воды и перемешивают. Добавляют 10 см триметиламина, перемешивают, доводят до метки дистиллированной водой и снова тщательно перемешивают. Приготовленный раствор фильтруют через стеклянный фильтр ПОР 16 и помещают в стеклянный сосуд с притертой пробкой. Полученный элюент хранят не более 1 мес в холодильнике.
     
     9.1.2.2 Подготовка хроматографической колонки
     
     Через колонку пропускают элюент в количестве 20-30 свободных объемов колонки, т.е. два полных шприца насоса хроматографа при расходе элюента сначала 50 мкдм/мин, а затем 100 мкдм/мин. Промывку колонки заканчивают при получении стабильной нулевой линии.
     
     После стабилизации колонки проводят ее насыщение витамином В. Для этого выполняют 7-10 анализов более концентрированного градуировочного раствора витамина В. Насыщение колонки прекращают, когда расхождение между последовательными определениями не превышает 3,0%.
     
     9.1.2.3 Приготовление раствора серной кислоты молярной концентрации (HSO)=5 моль/дм.
     
     В мерную колбу вместимостью 100 см помещают 30-40 см дистиллированной воды и добавляют 14,2 см концентрированной серной кислоты. Осторожно перемешивают и добавляют еще 35-40 см дистиллированной воды. Когда раствор остынет до комнатной температуры, осторожно доводят объем дистиллированной водой до метки.
     
     9.1.2.4 Построение градуировочного графика
     
     В мерную колбу вместимостью 100 см помещают 0,1 г витамина В и приливают 70 см раствора соляной кислоты молярной концентрации (НСl)=0,1 моль/дм. Колбу помещают в водяную баню и нагревают в течение 10 мин при температуре 75 °С. Затем охлаждают и содержимое количественно переносят в химический стакан вместимостью 200 см. Добавляют 1-2 капли 1%-ного спиртового раствора фенолфталеина, раствор гидроокиси натрия с массовой долей 40% до образования розового окрашивания, избыток щелочи нейтрализуют раствором серной кислоты молярной концентрации (HSO)=5 моль/дм. Раствор фильтруют через бумажный фильтр с синей полосой в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят объем до метки дистиллированной водой. Получают основной стандартный раствор витамина В массовой концентрации 1 мг/см. Из этого раствора готовят рабочие растворы, содержащие 0,4; 0,8; 1,0; 1,5; 2,0; 3,0 мг витамина В в 50 см. Для этого соответственно 0,4; 0,8; 1,0; 1,5; 2,0 и 3,0 см основного раствора помещают в 6 мерных колб вместимостью 50 см и доводят до метки дистиллированной водой.
     
     Рабочие растворы анализируют на жидкостном хроматографе при следующих условиях:
     
     хроматографическая колонка 2х120 мм;
     
     сорбент - Силасорб С 18, Силасорб SPH С 18, Сепарон С 18;
     
     трехкомпонентный элюент на основе уксусной кислоты;
     
     объем пробы - 6 мкдм;
     
     длина волны - 260 нм;
     
     скорость подачи элюента - 80-100 мкдм/мин;
     
     постоянная времени - 0,2 с.
     
     Удерживаемый объем пика витамина В - 560-580 мкдм (может меняться в зависимости от длины колонки и плотности ее заполнения). Каждый раствор хроматографируют 2 раза. После выхода пики колонку промывают, прокачивая через нее 150-200 мкдм элюента до выхода на нулевую линию.
     
     Значение средних высот хроматографических пиков (в единицах оптической плотности е.о.п.) откладывают по оси ординат градуировочного графика, а по оси абсцисс - количество витамина в 50 см раствора.
     
     Градуировочный график строят так же, откладывая по оси ординат средние высоты хроматографических пиков, выраженные в единицах длины (миллиметрах).
     
     Построение градуировочного графика можно заменить расчетом коэффициентов наклона , мг/е.о.п., по формуле
     

,

     
где  - коэффициент наклона градуировочного графика для -го градуировочного раствора, мг/е.о.п.;
     
      - количество точек, по которым строится градуировочный график.
     
     Значение коэффициента наклона градуировочного графика , мг/е.о.п. или мг/мм, вычисляют по формуле
     

,

     
где  - содержание витамина в соответствующем -м градуировочном растворе,
     
      - высота -го хроматографического пика, е.о.п. или мм.
     
     9.1.2.5 Проверка градуировочного графика
     
     Градуировочный график контролируют не реже 1 раза в неделю. Для этого 1-2 рабочих раствора витамина следует анализировать, как указано в 9.1.2.4.
     
     Отклонение полученных результатов от измеренных в момент построения градуировочного графика , %, определяют по формуле
     

,

     
где ,  - высота хроматографического пика, определенная при построении градуировочного графика и в момент проверки соответственно, е.о.п. или мм.
     
     При отклонении результатов более чем на 5% строят новый градуировочный график.
     
     Градуировочные растворы хранят в холодильнике в стеклянной посуде с притертой пробкой. Срок годности растворов не более 1 мес.
     
     9.1.3 Проведение кислотного гидролиза
     
     Навеску премикса массой 1-5 г, взятую с погрешностью не более 0,001 г, помещают в коническую колбу вместимостью 100 см и добавляют 3 см раствора соляной кислоты молярной концентрации (НСl)=0,1 моль/дм. Колбу нагревают на водяной бане при температуре (75±1) °С в течение 10 мин, охлаждают, содержимое колбы количественно переносят в химический стакан вместимостью 200 см. Добавляют 1-2 капли спиртового раствора фенолфталеина с массовой долей 1% и раствор гидроокиси натрия с массовой долей 40% до образования розового окрашивания. Избыток щелочи нейтрализуют раствором серной кислоты молярной концентрации (HSO)=5 моль/дм. После 10-минутного выдерживания раствор фильтруют через обеззоленный фильтр с синей лентой в мерную колбу вместимостью 50 см и доводят объем до метки дистиллированной водой.
     
     9.1.4 Хроматографирование
     
     Полученный экстракт хроматографируют, как в 9.1.2.4. Для определения содержания витамина В в премиксах проводят 2 параллельных анализа, начиная со взятия навески. Каждый экстракт хроматографируют два раза, находят среднеарифметическое значение высоты пиков в единицах оптической плотности или миллиметрах и по градуировочному графику определяют содержание витамина в миллиграммах, приложение В, рисунок B.1.
     
     9.1.5 Обработка результатов испытания
     
     Содержание витамина В в премиксе, мг/кг, вычисляют по формуле
     

,

     
где  - содержание витамина, найденное по градуировочному графику, мг;
     
      - навеска премикса, г.
     
     При использовании коэффициента наклона  вместо градуировочного графика содержание витамина В в премиксе, мг/г, вычисляют по формуле
     

,

     
где  - коэффициент наклона градуировочного графика, мг/е.о.п.;
     
      - высота хроматографического пика, е.о.п.;
     
      - масса навески премикса, г.
     
     Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.
     
     За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности =0,95 не должны быть более 10% относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях, при доверительной вероятности =0,95 расхождения не должны превышать 15%.
     
     9.2 Определение витамина В с применением жидкостных хроматографов импортного производства
     
     Сущность метода заключается в экстракции витамина В из навески премикса раствором соляной кислоты молярной концентрации (НСl)=0,01 моль/дм и хроматографическом анализе его содержания в испытуемом растворе с использованием жидкостного хроматографа со спектрофотометрическим детектором.
     
     Метод применим в диапазоне содержания витамина В от 0,2 до 4 г/кг премикса.
     
     9.2.1 Аппаратура, материалы и реактивы
     
     Хроматограф жидкостный с фотометрическим детектором при спектральном диапазоне от 200 до 300 нм. Возможно использование детектора при постоянной длине волны 254 нм.
     
     Колонка хроматографическая стальная или стеклянная высотой 150-200 мм и диаметром 2,6-4,6 мм с числом теоретических тарелок не менее 3000 на 1 м, заполненная сорбентом "Силосорб С-18" или "Сепарон С-18" с зернением 7,5 мкм.
     
     Весы лабораторные не ниже 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.
     
     Центрифуга лабораторная ЦЭ-2 с числом оборотов 6000 в минуту.
     
     Колбы мерные 2-50(100)-1(2) по ГОСТ 1770.
     
     Иономер ЭВ-74 со стеклянным электродом ЭСЛ-63-07.
     
     Пипетка 4-1(2)-1 по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29228.
     
     Ацетонитрил по нормативному документу [7].
     
     Тетрабутиламмоний хлористый по нормативному документу [14].
     
     Тетрабутиламмоний бромистый по нормативному документу [13].
     
     Витамин В по нормативному документу [12].
     
     Кислота соляная по ГОСТ 3118, раствор молярной концентрации (НСl)=0,01 моль/дм.
     
     Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
     
     Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.
     
     Примечания
     
     1 Допускается использование другой аппаратуры, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не ниже указанных.
     
     2 Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.
     
     
     9.2.2 Подготовка к испытанию
     
     9.2.2.1 Приготовление элюента для хроматографии
     
     В колбе вместимостью 1 дм смешивают 120 см ацетонитрила с 880 см дистиллированной воды, добавляют (2±0,002) г хлористого (бромистого) тетрабутиламмония. Полученную смесь фильтруют через бумажный фильтр для удаления механических примесей и помещают в стеклянный сосуд с притертой пробкой.
     
     Полученный раствор можно хранить в течение 1 мес.
     
     9.2.2.2 Приготовление раствора экстрагента
     
     Для экстракции витамина В используют раствор соляной кислоты молярной концентрации (НСl)=0,01 моль/дм, который готовят прибавлением к 1 дм дистиллированной воды 0,6 см концентрированной 37%-ной соляной кислоты. Значение рН должно быть 2±0,2.
     
     9.2.2.3 Приготовление основного стандартного раствора витамина В
     
     Навеску витамина В массой 0,1 г взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 100 см и доводят до метки этой же водой. Полученный раствор содержит 1 мг витамина В в 1 см.
     
     Раствор хранят в холодильнике до полного использования.
     
     9.2.2.4 Приготовление рабочего стандартного раствора витамина В
     
     Рабочий стандартный раствор никотиновой кислоты готовят в зависимости от предполагаемого содержания ее в премиксе по таблице 1. Рабочий стандартный раствор готовят в день проведения контроля.
     
     
Таблица 1

     
     
     9.2.3 Проведение испытания
     
     9.2.3.1 Экстрагирование
     
     Навеску премикса массой 1 г, взвешенную с погрешностью не более 0,002 г, помещают в мерную колбу вместимостью 50 см, приливают 2/3 объема раствора соляной кислоты молярной концентрации (НСl)=0,01 моль/дм, перемешивают и оставляют стоять в течение 20 мин, несколько раз при этом перемешивая, после чего доводят до метки тем же раствором. Полученную суспензию перемешивают и часть отливают в центрифужную пробирку, центрифугируют в течение 5 мин при 6000 об/мин. Полученный центрифугат используют для хроматографического анализа.
     
     9.2.3.2 Хроматографирование
     
     Хроматографирование осуществляют при следующих условиях: колонка, заполненная сорбентом, подвижная фаза - элюент по 9.2.2.1, рабочая длина волны спектрофотометрического детектора 262 нм (или 254 нм), скорость элюирования - 1,5 см/мин, температура - комнатная. При данных условиях проводят 3-5 загрузок стандартного раствора по 5 мкдм, отмечая время выхода пика витамина В в секундах и высоту пика относительно базисной линии. При достижении постоянной высоты можно приступать к контролю. Загружают по 3 раза в одинаковых условиях 5-10 мкдм стандартного раствора витамина массовой концентрации 0,01-0,04 мг в 1 см в зависимости от состава премикса (10 мкдм раствора массовой концентрации 0,01-0,02 мг/см или 5 мкдм раствора массовой концентрации 0,04 мг/см) и экстракт премикса после центрифугирования. По времени выхода определяют пик витамина В в экстракте и измеряют высоту пика, как расстояние от вершины пика до линии, проведенной в основании пика (приложение Г рисунок Г.1). Измеряя и сравнивая высоты пиков на хроматограммах, вычисляют содержание витамина В в премиксах.
     
     9.2.3.3 Обработка результатов испытания
     
     Содержание витамина В в премиксе, г/кг, вычисляют по формуле
     

,

     
где  - концентрация витамина В в рабочем стандартном растворе, мг/см;
     
      - высота пика витамина В на хроматограмме испытуемого раствора, мм;
     
      - общий объем экстракта, см;
     
      - высота пика витамина В на хроматограмме рабочего стандартного раствора, мм;
     
      - масса навески, г.
     
     Результат испытания вычисляют до первого десятичного знака и округляют до целого числа.
     
     За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми при доверительной вероятности =0,95 не должны быть более 10% относительно среднего арифметического значения, а между результатами, выполненными в двух разных лабораториях, при доверительной вероятности =0,95 расхождения не должны превышать 15%.
     
     

     10 ТРЕБОВАНИЯ ТЕХНИКИ БЕЗОПАСНОСТИ

     
     10.1 Работы с концентрированными кислотами, щелочами и др. летучими веществами должны проводиться в вытяжном шкафу.
     
     10.2 Необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с электроприборами.
     
     

ПРИЛОЖЕНИЕ А
(справочное)

ХРОМАТОГРАММА ЭКСТРАКТА ИЗ ПРЕМИКСА

Рисунок А.1 - Хроматограмма экстракта из премикса

     
     
ПРИЛОЖЕНИЕ Б
(справочное)

     
ХРОМАТОГРАММА СМЕСИ ВИТАМИНОВ В И В

Рисунок Б.1 - Хроматограмма смеси витаминов В и В

ПРИЛОЖЕНИЕ В
(справочное)

     
ХРОМАТОГРАММА ЭКСТРАКТА ВИТАМИНА В ИЗ ПРЕМИКСА

Рисунок B.1 - Хроматограмма экстракта витамина В из премикса

ПРИЛОЖЕНИЕ Г
(справочное)

ХРОМАТОГРАММЫ РАСТВОРОВ ВИТАМИНА В

Рисунок Г.1 - Хроматограммы:
а - стандартного раствора; б - экстракта из премикса

     
ПРИЛОЖЕНИЕ Д
(информационное)

     
БИБЛИОГРАФИЯ

     
     [1] ТУ 6-09-402-87 2 пропанол (изопропиловый спирт) химически чистый
     
     [2] ТУ 6-09-11-2021-87 Триметиламин
     
     [3] ТУ 6-09-1678-86 Фильтры обеззоленные (белая, красная, синяя ленты)
     
     [4] МРТУ 6-09-2437-65 Триэтиламин
     
     [5] ТУ 6-09-08-944-83 Рейнекат аммония
     
     [6] ТУ 6-09-53-60-87 Фенолфталеин (индикатор)
     
     [7] ТУ 6-09-06-1092-83 Ацетонитрил. Технические условия
     
     [8] ТУ 25-7416-0171-88 рН-метр типа рН-155
     
     [9] ГФ СССР-Х ст.149 Хининсульфат
     
     [10] ГФ СССР-Х ст.147 Хинингидрохлорид
     
     [11] ГФ СССР-Х ст.585 Рибофлавин (витамин В)
     
     [12] ГФ СССР-Х ст.19 Никотиновая кислота (витамин В)
     
     [13] МРТУ 6-09-105-62 Тетрабутиламмоний бромистый
     
     [14] МРТУ 6-09-5351-68 Тетрабутиламмоний хлористый
     
     [15] ТУ 25-1894.003-90 Секундомер СОС ПР-2А-3-000
     
     [16] ГФ СССР-Х ст.673 Тиаминбромид
     
     [17] ГФ СССР-Х ст.674 Тиаминхлорид
     
     [18] ГФ Х ст.42-1997-93 Холинхлорид