МУК 4.1.1962-05

     

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение фумонизинов B и В в кукурузе (зерно, крупа, мука) методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии

     
     
Дата введения 2005-07-01

     
     
     1. РАЗРАБОТАНЫ: ГУ НИИ питания РАМН (академик РАМН, профессор В.А.Тутельян, д.х.н. К.И.Эллер, к.х.н. М.Г.Киселева, к.б.н. Л.П.Захарова, И.Б.Седова).
     
     2. УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Г.Г.Онищенко 21 апреля 2005 г.
     
     3. ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ с 1 июля 2005 г.
     
     4. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.
     
     

1. Назначение и область применения

     
     Настоящий документ устанавливает методику обнаружения, идентификации и количественного определения фумонизинов B и В в продовольственном сырье и пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Данная методика испытана и рекомендуется для количественного определения фумонизинов B и В (ФB и ФВ) в зерне кукурузы и продуктах переработки кукурузы.
     
     Методические указания предназначены для проведения лабораторных исследований безопасности пищевой продукции центрами гигиены и эпидемиологии, а также для предприятий и организаций, осуществляющих контроль качества и безопасности пищевых продуктов и аккредитованных в установленном порядке.
     
     Предел обнаружения метода: 0,01 мг/кг (для ФВ); 0,04 мг/кг (для ФВ).
     
     Общая погрешность измерений не превышает 31%.
     
     

2. Общие положения

     
     Фумонизины принадлежат к большой группе микотоксинов, продуцируемых микроскопическими грибами рода Fusarium. Наиболее часто в природных условиях встречается фумонизин В, значительно, реже и в меньших количествах - фумонизины В и В (ФВ, ФВ и ФВ). Подтверждено, что основными продуцентами этих токсинов являются F. moniliforme Sheldon (син. F. verticillioides (Sacc. Nirenberg). Имеются данные о высокой частоте обнаружения фумонизинов в зерне кукурузы и продуктах ее переработки в США, Австралии, в ряде стран Европы.
     
     Фумонизины представляют собой диэфиры пропан-1,2,3-трикарбоновой кислоты и 2-амино-12,16-диметилполигидроксиэйкозана, хорошо растворимы в воде и полярных растворителях. Фумонизины не обладают естественной флуоресценцией и не имеют специфических хромофоров, что обусловливает необходимость стадии дериватизации для проведения высокочувствительного определения.
     
     Фумонизины в экспериментах in vivo поражают печень, почки, поджелудочную железу и центральную нервную систему у разных видов животных, а также обладают канцерогенным действием. Международное Агентство по изучению рака классифицирует фумонизины, как соединения потенциально канцерогенные для человека (Группа 2В). Комитет экспертов ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам и контаминантам предложил установить величину допустимого суточного потребления (ДСП) ФВ+ФВ+ФВ с пищей на уровне 2 мкг/кг массы тела.
     
     

3. Принцип метода

     
     Метод включает следующие этапы.
     
     Экстракция ФВ и ФВ из проб зерна кукурузы, муки, крупы осуществляют смесью ацетонитрил-вода (50:50% об.). В пробах детского питания и многокомпонентных пищевых продуктах - смесью ацетонитрил-метанол-вода (25:25:50% об.):
     
      очистка и концентрирование пробы на патронах, заполненных силикагелем, химически связанным с октадецилселаном (ОДС-патроны). В пробах детского питания и многокомпонентных пищевых продуктах очистка проводится на иммунно-афинных колонках (ИА-колонки);
     
      дериватизация фумонизинов о-фталевым реагентом;
     
      определение ФВ и ФВ с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с флуориметрическим детектором при длине волны возбуждения () 335 нм и длине волны эмиссии () 440 нм.
     
     Предел обнаружения метода: 0,01 мг/кг (для ФВ); 0,04 мг/кг (для ФВ).
     
     Относительное стандартное отклонение измерения времени удерживания составляет - 0,02 (для ФВ) и 0,03 (для ФВ), высот хроматографических пиков - 0,05 (для ФВ) и 0,08 (для ФВ), площадей хроматографических пиков - 0,06 (для ФВ) и 0,08 (для ФВ).
     
     Степень извлечения добавленных в продукт фумонизинов составляет 89,8% для ФВ и 89,5% для ФВ.
     
     

4. Характеристика погрешностей измерения

     
     Данные методические указания обеспечивают выполнение измерений с погрешностью, не превышающей величин, приведенных в табл.1.
     
     

Таблица 1

     
Приписанные характеристики погрешностей результатов определения концентрации
ФВи ФВв продукте методом ВЭЖХ при доверительной вероятности Р=0,95

     
     
5. Средства измерений, вспомогательные устройства, посуда,
реактивы и материалы

5.1. Средства измерений

     
     Система ВЭЖХ, состоящая из насоса высокого давления, инжектора типа Rheodyne-7125 (США) с объемом петли-дозатора 20 мкл, спектрофлуориметрического детектора, обеспечивающего возбуждение флуоресценции в спектральной области 330-340 нм и регистрацию эмиссии флуоресценции при длине волны 440 нм и системы для сбора и обработки данных типа Мультихром (Амперсенд, Россия) или аналогичной, хроматографической колонки (250х4,6 мм), заполненной сорбентом Kromasil С18 (MetaChem Texnologies, США), размер частиц 5 мкм, или подобным сорбентом.
     

5.2. Вспомогательное оборудование

5.3. Реактивы и материалы

     

6. Подготовка к выполнению измерений

6.1. Приготовление стандартных и рабочих растворов ФВ и ФВ

     
     Для приготовления стандартных растворов микотоксинов рекомендуется использовать растворители, очищенные перегонкой.
     
     Для получения раствора хранения фумонизинов с концентрацией 50 мг/л в мерную колбу вместимостью 100 мл помещают навеску фумонизина (5 мг), взятую с точностью до 0,01 мг, приливают небольшое количество смеси ацетонитрил-вода (1:1) и тщательно перемешивают до полного растворения вещества, доводят смесь до метки.
     
     Для получения исходных рабочих растворов фумонизинов с концентрацией стандарта 10 мг/л следует в 5 раз разбавить раствор хранения фумонизинов.
     
     Из исходных рабочих растворов ФВ и ФВ с концентрациями 10 мг/л сначала готовится их смесь в соотношении (1:1), а затем путем последовательного разбавления этой смеси готовят рабочий стандартный раствор, для чего необходимую аликвоту смеси микотоксинов доводят до соответствующего объема смесью ацетонитрил-вода (1:1) согласно табл.2.
     
     

Таблица 2

     
Приготовление рабочих растворов ФВи ФВ

     
     
     Например: для приготовления смеси стандартных растворов ФВ и ФВ с концентрациями по 5 мг/л в вайл вносят по 1 мл исходных рабочих растворов ФВ и ФВ с концентрациями 10 мг/л.
     
     Для приготовления смеси рабочих стандартных растворов ФВ и ФВ с концентрацией:
     
      2,0 мг/л - в вайл вносят 800 мкл смеси ФВ и ФВ с концентрацией 5 мг/л и добавляют 1200 мкл смеси ацетонитрил-вода (1:1);
     
      1,0 мг/л - в вайл вносят 400 мкл смеси ФB и ФВ с концентрацией 5 мг/л и добавляют 1600 мкл смеси ацетонитрил-вода (1:1) или 1000 мкл смеси рабочих стандартных растворов ФВ и ФВ с концентрацией 2 мг/л добавляют 1000 мкл смеси ацетонитрил-вода (1:1);
     
      0,4 мг/л - в вайл вносят 800 мкл смеси  ФВ и ФВ с концентрацией 1 мг/л и добавляют 1200 мкл смеси ацетонитрил-вода (1:1);
     
      0,2 мг/л - в вайл вносят 1000 мкл смеси ФВ и ФВ с концентрацией 0,4 мг/л и добавляют 1000 мкл смеси ацетонитрил-вода (1:1). При необходимости по аналогии с вышеизложенным делается нужное разбавление.     
     

6.2. Хранение стандартных растворов фумонизинов

     
     Растворы хранения фумонизинов следует держать в стеклянной посуде с притертыми пробками в темном прохладном месте (при температуре около 0 °С) до одного года и использовать для приготовления рабочих стандартных растворов. Смеси рабочих стандартных растворов хранят в вайлах из темного стекла в темном прохладном месте (при температуре около 0 °С) в течение 1 недели.
     
     Перед использованием рабочих стандартных растворов их следует довести до комнатной температуры и только после этого следует открывать пробки.
          

6.3. Приготовление буферных растворов

     
6.3.1. Приготовление 0,1 М фосфатного буферного раствора, рН=3,0

     
     Навеску натрия фосфорно-кислого однозамещенного, 2-водного массой 7,8 г переносят в мерную колбу вместимостью 500 мл, добавляют 20-50 мл дистиллированной воды. Доводят объем раствора в колбе до метки и перемешивают. Срок хранения - 1 месяц в холодильнике.
     

6.3.2. Приготовление 0,08 М фосфатного буферного раствора, рН=4,5

     
     Навеску натрия фосфорно-кислого однозамещенного, 2-водного массой 6,24 г переносят в мерную колбу вместимостью 500 мл, добавляют 20-50 мл дистиллированной воды. Доводят объем раствора в колбе до метки и перемешивают. Срок хранения - 1 месяц в холодильнике.
     

6.3.3. Приготовление 0,025 М фосфатного буферного раствора, рН=7,0

     
     Навеску натрия фосфорно-кислого двузамещенного 12-водного массой 0,895 г переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляют 10-20 мл дистиллированной воды. Доводят объем раствора в колбе до метки и перемешивают. Срок хранения - 1 месяц в холодильнике.
     

6.3.4. Приготовление фосфатного буферного раствора, рН=7,4

     
     Навеску натрия фосфорно-кислого двузамещенного 12-водного массой 1,15 г, навеску натрия однозамещенного 2-водного массой 0,124 г и навеску натрия хлорида массой 1,74 г переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляют 10-20 мл дистиллированной воды. Доводят объем раствора в колбе до метки и перемешивают. Срок хранения - 1 месяц в холодильнике.
     
     

7. Отбор и подготовка проб для анализа

7.1. Отбор проб

     Для учета специфики отбора проб отдельных видов продуктов следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией:
     
      "Зерно. Правила приемки и методы отбора проб", ГОСТ 13586.3-83;
     
      "Крупа. Правила приемки и методы отбора проб", ГОСТ 27312-84;
     
      "Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб", ГОСТ 27668-88;
     
      "Продукты пищевые консервированные. Отбор проб и подготовка их к испытанию", ГОСТ 8756.0-70.
     
     Для получения среднего образца зерна, представительного по концентрации микотоксинов для всей партии, следует измельчить до гомогенизированного состояния двухкилограммовый исходный образец и выделить из этого размола средний образец зерна.
     
     Для однородных продуктов (мука, крупа, детское питание, хлопья и др.) пробы следует отбирать в количестве единиц упаковки, соответствующих величине среднего образца (100-200 г), при условии, что продукт происходит из одной партии.
          

7.2. Подготовка проб для анализа

     Отобранные пробы измельчают в течение 1-2 мин в лабораторной мельнице. При этом используют две параллельные пробы и одну - холостую.
     

7.2.1. Экстракция

     
     7.2.1.1. Для однокомпонентных пищевых продуктов: навеску 10 г измельченной пробы помещают в плоскодонную коническую колбу на 100 мл, добавляют 50 мл смеси ацетонитрил-вода (50:50% об.). Экстрагируют на аппарате для встряхивания проб в течение 90 мин. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр "синяя лента". Отбирают 5 мл фильтрата и добавляют 5 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора, рН=3,0. Полученный раствор центрифугируют в течение 15 мин при 2,5 тыс. об./мин.
     
     7.2.1.2. Для проб детского питания и многокомпонентных пищевых продуктов экстракцию ФВ и ФВ из 10 г измельченной пробы проводят встряхиванием в 50 мл смеси ацетонитрил-метанол-вода (25:25:50% об.) в течение 120 мин. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр "синяя лента". К 2 мл супернатанта добавляют 8 мл фосфатного буферного раствора, рН=7,4 и центрифугируют в течение 15 мин при 2,5 тыс. об./мин.
     

7.2.2. Очистка экстракта

     
     7.2.2.1. Для однокомпонентных пищевых продуктов: перед использованием ОДС-патроны предварительно кондиционируют, пропуская последовательно по 2 мл ацетонитрила и 0,1 М фосфатного буферного раствора, рН=3,0. Затем на патрон наносят 8,0 мл анализируемого экстракта и промывают 1,0 мл 0,1 М фосфатным буферным раствором, рН=3. Фумонизины элюируют с патрона 2,0 мл смеси ацетонитрил-0,025 М фосфатного буферного раствора, рН=7,0 (70:30% об.).
     
     7.2.2.2. Для очистки проб детского питания и многокомпонентных пищевых продуктов на ИА-колонку наносят со скоростью 1-2 капли в секунду 8 мл полученного раствора, промывают 10 мл фосфатного буферного раствора, рН=7,4. Фумонизины элюируют с колонки 1,5 мл метанола и 1,5 мл дистиллированной воды.
     
   

8. Выполнение измерений

8.1. Дериватизация фумонизинов о-фталевым альдегидом

     
     Для приготовления ОФА-реагента 40 мг о-фталевого альдегида растворяют в 1 мл метанола, добавляют 5 мл 0,05 М водного раствора тетрабората натрия и 50 мкл 2-меркаптоэтанола. Полученный раствор хранят в темноте в течение 1 недели при =6 °С.
     
     Дериватизацию фумонизинов о-фталевым альдегидом проводили в течение 1 мин после смешивания 40 мкл пробы и 40 мкл ОФА-реагента.
     

8.2. Определение фумонизинов B и В методом ВЭЖХ

     
     Условия ВЭЖХ: подвижная фаза ацетонитрил-метанол-0,08 М фосфатный буферный раствор (50:10:40% об.), рН 4,5, скорость подвижной фазы 1,3 мл/мин. Рекомендуется использовать перегнанный метанол, ацетонитрил и бидистиллированную воду. Все растворители необходимо предварительно отфильтровать.
     
     Флуориметрический детектор устанавливают на длину волны возбуждающего излучения 335 нм, на линии эмиссии устанавливают эмиссионный фильтр с полосой пропускания 440 нм.
     
     

9. Обработка результатов измерения

     
     9.1. Для построения калибровочного графика проводят хроматографический анализ серии рабочих растворов стандартов. В инжектор с помощью микрошприца вводят 20 мкл перемешанной в течение 1 мин смеси, состоящей из 40 мкл ОФА-реагента и 40 мкл рабочего раствора стандарта с концентрацией 5 мг/л, что соответствует 100 нг ФВ и 100 нг ФВ. Подобное делается для других стандартных растворов с концентрациями по 2,0, 1,0, 0,4, 0,2 мг/л, что в свою очередь соответствует 40, 20, 8 и 4 нг ФВ и ФВ во вколе. На основании полученных данных строят калибровочную кривую (зависимость площади хроматографического пика от концентрации фумонизина во вколе). В интервале линейности градуировочный график описывается уравнением прямой:
     

,

где  - площадь хроматографического пика;
           
      - концентрация фумонизина в очищенном экстракте, мг/кг;
     
     ,  - коэффициенты градуировочного графика.
     
     Для анализа проб в инжектор хроматографа вводят с помощью микрошприца 20 мкл смеси, перемешанной в течение 1 мин и состоящей из 40 мкл ОФА-реагента и 40 мкл очищенного экстракта. При наличии пика, совпадающего по времени удерживания с ФВ или ФВ, рассчитывают их концентрацию в очищенном экстракте с помощью уравнения градуировочного графика.
     
     Для того чтобы рассчитать содержание фумонизинов в исходном образце необходимо концентрацию ФВ и ФВ в пробе умножить на коэффициент разбавления.
     
     9.2. Коэффициент разбавления в случае использования С-18 колонок:
     

,*

где  - коэффициент разбавления;
             
      - объем смеси ацетонитрил-вода, взятой для экстракции, мл (50 мл);
            
      - навеска образца, взятого для анализа, г (10 г);
            
      - объем водно-ацетонитрильного экстракта, взятого для анализа, мл (5 мл);
           
      - объем смеси водно-ацетонитрильного экстракта и фосфатного буфера, взятых для центрифугирования, мл (10 мл);
           
      - объем смеси после центрифугирования, взятой для твердофазной очистки, мл (8 мл);
          
     * - объем собранного элюата после стадии твердофазной очистки, мл (2 мл).
________________
     * Формула и экспликация к ней соответствуют оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.
     
     Расчет концентрации ФВ и ФВ в пробе проводится по формуле:
     

     
,

где  - концентрация ФВ и ФВ, мг/кг;
                 
     2,5 - коэффициент разбавления;
          
      - концентрация ФВ в очищенном экстракте, мг/кг;
          
      - концентрация ФВ в очищенном экстракте, мг/кг.
     
     При высоких уровнях загрязнения фумонизинами кукурузы или продуктов ее переработки, экстракт перед реакцией дериватизации необходимо разбавить, в этом случае при расчете содержания фумонизинов в исходном образце, необходимо дополнительно учесть это разбавление ().     

     
,

где  - коэффициент дополнительного разбавления экстракта.

     В указанных условиях время удерживания находится для ФВ в диапазоне от 7,0 до 8,5, для ФВ - 24-27 мин. Примерный вид хроматограммы, полученной с помощью модельной смеси, где (ФВ)=(ФВ) =0,5 мг/кг, представлен на рис.1.
     

Рис.1. Вид хроматограммы на примере модельной смеси

_______________
     * Качество рисунка соответствует оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.

     9.2. Коэффициент разбавления в случае использования ИА-колонок:
     

*

     
      - коэффициент разбавления;
           
      - объем смеси ацетонитрил-метанол-вода, взятой для экстракции, мл (50 мл);
          
      - навеска образца, взятого для анализа, г (10 г);
          
      - объем ацетонитрил-метанол-водного экстракта, взятого для анализа, мл (2 мл);
          
      - объем смеси ацетонитрил-метанол-водного экстракта и фосфатного буферного раствора, взятых для центрифугирования, мл (10 мл);
          
      - объем смеси после центрифугирования, взятой для твердофазной очистки, мл (8 мл);
          
     * - объем собранного элюата после стадии твердофазной очистки, мл (3 мл).
____________________
     * Формула и экспликация к ней соответствуют оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.
     
     Расчет концентрации ФВ и ФВ в пробе проводится по формуле:     

     
,

где  - концентрация ФВ и ФВ, мг/кг;
            
     9,375 - коэффициент разбавления;
          
      - концентрация ФВ в очищенном экстракте, мг/кг;
          
      - концентрация ФВ в очищенном экстракте, мг/кг.
     
     При высоких уровнях загрязнения фумонизинами кукурузы или продуктов ее переработки экстракт перед реакцией дериватизации необходимо разбавить, в этом случае при расчете содержания фумонизинов в исходном образце необходимо дополнительно учесть это разбавление ().     

     
,

где  - коэффициент дополнительного разбавления экстракта.
     
     

10. Вычисление результатов анализа

     
     За окончательный результат испытаний принимается среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений.
     

     
     Определяют допустимое расхождение между параллельными определениями , используя , % из табл.3.
     

, мг/кг

, мг/кг

     
     
Таблица 3

     
Значение нормативов оперативного контроля сходимости при доверительной вероятности Р=0,95

     
     
     Если расхождение между параллельными определениями не превышает допустимого:
     

,

,

то среднее арифметическое принимают за результат анализа.
     
     При превышении норматива  следует повторить измерения, используя резервные пробы. В случае повторного превышения указанного норматива, выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам анализа, устраняют их и повторяют анализ пробы.
     
     

11. Оперативный контроль результатов измерения

11.1. Алгоритм проведения оперативного контроля воспроизводимости

     
     Периодичность контроля воспроизводимости измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.
     
     Пробами для контроля являются рабочие пробы продуктов, продовольственного сырья. Отбирают 2 пробы, которые анализируют в точном соответствии с прописью методики, максимально варьируя условия проведения анализа, а именно: используя разные наборы мерной посуды, разные партии реактивов и участие двух разных аналитиков. Целесообразно также проведение анализа этих аналитических проб в разных лабораториях.
     
     

11.2. Алгоритм проведения оперативного контроля погрешности

     
     Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.
     
     Образцами контроля являются рабочие пробы пищевых продуктов или продовольственного сырья. Отбирают пробу и разделяют ее на 2 равные части. Одну из них оставляют без изменений, а к другой добавляют раствор стандартов ФB и ФВ в таком количестве, чтобы массовая доля каждого из них в пробе по сравнению с исходным значением увеличилась на 50-100%. Добавка должна вводиться в пробу перед началом пробоподготовки.
     
     Обе пробы анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результаты анализа исходной пробы ( и ), мг/кг и пробы с добавкой ( и ). Определение проводят в одинаковых условиях, а именно: анализ проводит один аналитик, с использованием одного набора мерной посуды, реактивов, растворов и т.д.
     
     Алгоритм проведения оперативного контроля погрешности с использованием метода добавок состоит в сравнении результата контрольного определения, равного разности между результатом контрольного измерения пробы с добавкой (* и ), пробы без добавки ( и ) и величиной добавки ( и ), с нормативом оперативного контроля . Решение об удовлетворительной погрешности принимается при выполнении условия (при =0,95)
________________
     * Соответствует оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.
          

     
     Норматив оперативного контроля погрешности рассчитывают по формулам при проведении:
     
      внутрилабораторного контроля (=0,90)
     

, мг/кг

     
, мг/кг;

     
      внешнего контроля (=0,95)
     

, мг/кг

     
, мг/кг,

     
где ,  - абсолютные погрешности измерений для исходной пробы с добавкой, мг/кг;
           
     ,  - абсолютные погрешности измерений для исходной пробы, мг/кг;
     

                      
     ,  - содержание определяемых компонентов в пробе;
     

          
      и  приведены в табл.1.
     
     При превышении норматива оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют с использованием другой пробы. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и устраняют их.
     
     

12. Требования техники безопасности

     
     При выполнении анализов необходимо соблюдать правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.2.007.0 и ГОСТ 4658. Помещение лаборатории должно соответствовать санитарным правилам проектирования, оборудования, эксплуатации и содержания производственных и лабораторных помещений, предназначенных для проведения работ с органическими растворителями. Аналитическая лаборатория должна быть оснащена вентиляционными системами по ГОСТ 12.4.021.
     
     

13. Требования к квалификации исполнителя

     
     К выполнению анализа ФВ и ФВ в пищевых продуктах допускаются лица со специальным высшим образованием или средним специальным образованием, владеющие техникой ВЭЖХ-анализа, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие опыт работы в химической лаборатории.
     
     

14. Условия выполнения измерений

     
     Температура окружающего воздуха от 15 до 25 °С.
     
     Относительная влажность воздуха не более 80% при 25 °С.
     
     Атмосферное давление 730-760 мм рт.ст.
     
     Напряжение электропитания: 210-220 В. Частота переменного тока: 45-50 Гц.