МУК 4.1.1146-02

     
     
Методические указания


4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств Фамоксадона в воде, почве, клубнях
картофеля, зеленой массе, соломе и зерне зерновых колосовых культур
методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

     
     
Дата введения 2003-01-01

     
     
     УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко
     
     

1. Вводная часть

     
     Фирма-производитель: Дюпон, США.
     
     Торговое название: Танос.
     
     Синонимы: JE-874.
     
     Название действующего вещества по ИСО: Фамоксадон.
     
     Название действующего вещества по IUPAC: 3-анилино-5-метил-5-(4-феноксифенил)-2,4-оксазолидиндион.
          

     
     Химически чистый фамоксадон представляет собой светлый кремовый порошок.
     
     Давление паров: 6,4х10 Ра (4,8х10 мм Hq) при 20 °С.
     
     Температура плавления: 140,3-141,8 °С.
     
     Коэффициент распределения н-октанол-вода: 4,8 (рН 5); 4,65 (рН 7); 5,55 (рН 9).
     
     Растворимость в воде зависит от кислотности среды и составляет 243х10 г/л при рН 5; 111х10 г/л при рН 7, при рН 9 вещество быстро гидролизуется. Растворимость в органических растворителях (г/л при 20 °С): ацетон - 274, ацетонитрил - 125, гексан - 0,0476, дихлорметан - 239, метанол - 10, толуол - 13,3, этилацетат - 124, н-октанол - 1,78.
     
     Фамоксадон нестабилен в водных растворах. Гидролиз наблюдается в диапазоне рН 5-9, и время полураспада составляет 41 день, 2 дня и 93 минуты при рН 5,0; 7,0 и 9,0 соответственно. Период полураспада при фотолизе составляет 4,6 дней и 3,9 часов при рН 5 и 7,75 соответственно.
     
     Краткая гигиеническая характеристика
     
     Фамоксадон относится к малоопасным соединениям по острой (ЛД для крыс - более 5000 мг/кг) и дермальной токсичности (ЛД для крыс - более 2000 мг/кг) и умеренно опасным по ингаляционной (ЛК (4 часа) 5300 мг/м) токсичности, не вызывает раздражения глаз и кожи.
     
     В РФ установлены следующие гигиенические нормативы:
     
     ДСД - 0,01 мг/кг массы человека;
     
     ОДК в почве - 0,1 мг/кг;
     
     ПДК в воде водоемов - 0,01 мг/дм;
     
     ВМДУ в картофеле - 0,05 мг/кг.
     
     Область применения
     
     Фамоксадон (JE-874) - фунгицид из группы оксазолидиндионов контактного действия с глубинным эффектом. Является ингибитором митохондриального дыхания, специфически связываясь с активным центром убихинол-цитохром С оксидоредуктазы. Используется в заводских смесях с цимоксанилом и флусилазолом в антирезистентных системах применения фунгицидов.
     
     Высокоэффективен против возбудителей из класса оомицетов, в т.ч. против рас возбудителей, устойчивых к фениламидам. Зарегистрирован в России под названием Танос (DPX-КР 481), диспергируемые в воде гранулы, 50% (25% фамоксадона+25% цимоксанила) на картофеле с нормой расхода 0,6 кг/га, трехкратная обработка за сезон, проходил испытания на огурцах открытого и закрытого грунта.
     
     

2. Методика определения фамоксадона в воде, почве, клубнях картофеля,
зеленой массе, соломе и зерне пшеницы методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии

     
2.1. Основные положения

     
2.1.1. Принцип метода

     
     Методика основана на определении фамоксадона методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием ультрафиолетового детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, концентрирования экстракта упариванием в вакууме и очистки на колонках с флоризилом. Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.
     

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

     
     Метрологическая характеристика метода представлена в табл.1-2.
     
     

Таблица 1

     
Метрологическая характеристика метода

     
     
Таблица 2

     
Полнота определения фамоксадона в зеленой массе, соломе и зерне пшеницы (5 повторностей для каждой концентрации)

     
     
2.1.3. Избирательность метода

     
     В прилагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых при выращивании пшеницы.
     

2.2. Реактивы, растворы, материалы и оборудование

     
2.2.1. Реактивы, материалы и растворы

2.3. Подготовка к определению

     
2.3.1. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии

     
     Колонку Zorbax SB С18 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при t°=25 °С и скорости потока подвижной фазы 1 мл/мин в течение 3-4 часов.
     

2.3.2. Приготовление стандартных растворов

     
     Взвешивают 50 мг фамоксадона в мерной колбе объемом 50 мл. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом (стандартный раствор N 1, концентрация фамоксадона 1 мг/мл). Затем методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 1,0; 0,5; 0,2; 0,1 мг/мл вещества, и используют эти растворы для построения калибровочного графика и фортификации образцов.
     

2.3.3. Приготовление растворов для жидкостной хроматографии

     
     Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанные ацетонитрил и дистиллированную воду.
     
     В плоскодонную колбу объемом 1 л помещают 650 мл ацетонитрила и 350 мл 3,1 мМ НРО в воде*. Смесь тщательно перемешивают, затем пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 мл/мин в течение 5 минут, после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенного гелия на 1 минуту. Полученный раствор используют в качестве подвижной фазы.

___________

     * Для приготовления 3,1 мМ ортофосфорной кислоты прибавляют к 4 л воды 840 мкл концентрированной ортофосфорной кислоты.
     

2.3.4. Построение калибровочного графика

     
     Для построения калибровочного графика вводят в хроматограф последовательно по 5 раз по 20 мкл каждого из полученных четырех растворов, измеряют высоту или площадь пиков, рассчитывают среднее значение высоты пика или его площади для каждой концентрации и строят график зависимости высоты пика или площади от концентрации фамоксадона мкг/мл.
     

2.3.5. Подготовка колонки для очистки экстракта

     
     В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 4 г флоризила, дезактивированного путем добавления 5% очищенной воды. Сверху на флоризил насыпают 1 г безводного сульфата натрия. Перед использованием колонку промывают 10 мл смеси гексан-этилацетат в соотношении 3:1, избыток растворителя с колонки удаляют путем продавливания воздуха. Затем колонку дополнительно промывают 10 мл гексана. Перед внесением образца колонку увлажняют 5 мл гексана.
     
     Примечание. Для дезактивации вначале флоризил выдерживают в сушильном шкафу при температуре 120 °С в течение 4 часов, а затем при постоянном перемешивании в стеклянной колбе с притертой пробкой к 95 г флоризила (60-100 меш, Merck) добавляют постепенно 5 г очищенной воды.
     

2.3.6. Проверка хроматографического поведения фамоксадона на колонке

     
     В круглодонную колбу объемом 50 мл вносят 1 мл стандартного раствора фамоксадона с концентрацией 1 мкг/мл и упаривают досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 0,5 мл этилацетата, затем добавляют в колбу 5 мл гексана и полученную смесь вносят на колонку. Затем промывают колонку 15 мл смеси гексан-этилацетат 10:1 и элюат отбрасывают. Фамоксадон элюируют с колонки последовательно 6-ю порциями объемом 5 мл смеси гексана с этилацетатом в соотношении 3:1, каждую порцию собирают отдельно в концентраторы и упаривают досуха при температуре не выше 30 °С.
     
     Сухой остаток каждой фракции растворяют в 1 мл ацетонитрила и 20 мкл пробы вводят в хроматограф.
     
     Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюата.
     
     Примечание. Хроматографическое поведение фамоксадона на колонке обязательно проверяют при отработке методики и каждый раз при использовании новой партии флоризила.    
     

2.4. Отбор проб

     
     Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Пробы зеленой массы пшеницы и клубней картофеля хранят в морозильной камере при температуре -18 °С. Для длительного хранения пробы почвы, соломы и зерна подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, зерно и солому размалывают на лабораторной мельнице.
     

2.5. Описание определения

     
2.5.1. Вода

     
     2.5.1.1. Экстракция. Пробу воды объемом 500 мл помещают в делительную воронку емкостью 1000 мл и трижды экстрагируют хлористым метиленом порциями по 50 мл, встряхивая каждый раз воронку в течение 1-2 мин. После разделения фаз в воронке нижний слой сливают в концентратор, пропуская его через безводный сульфат натрия. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
     
     2.5.1.2. Очистка экстракта на колонке. Сухой остаток растворяют в 0,5 мл этилацетата, обмывая стенки концентратора, затем в концентратор прибавляют 5 мл гексана, тщательно перемешивают и полученную смесь вносят на колонку. Затем колонку промывают последовательно 15 мл смеси гексан-этилацетат в соотношении 10:1 и 10 мл смеси гексан-этилацетат в соотношении 3:1 и элюат отбрасывают. Фамоксадон элюируют с колонки 20 мл смеси гексан-этилацетат в соотношении 3:1, собирают в концентратор и упаривают досуха при температуре не выше 30 °С.
     
     Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетонитрила и 20 мкл раствора вводят в хроматограф.
     

2.5.2. Почва

     
     2.5.2.1. Экстракция. Образец почвы массой 10 г помещают в коническую колбу объемом 250 мл, добавляют 10 мл дистиллированной воды и дают выстояться в течение 10 минут. Затем в колбу прибавляют 30 мл смеси ацетонитрила с водой в соотношении 8:2 и встряхивают колбу на механическом встряхивателе в течение 30 мин. Экстракт переносят в центрифужный стакан и центрифугируют при 2500 об./мин 5 мин. Супернатант фильтруют в делительную воронку объемом 250 мл через фильтр "красная лента". Фамоксадон экстрагируют еще 2 раза, используя по 30 мл смеси ацетонитрил-вода 8:2, встряхивая в течение 0,5 часа. Экстракты объединяют и переносят в делительную воронку объемом 250 мл.
     
     2.5.2.2. Предварительная очистка экстракта. К полученному экстракту в делительной воронке добавляют 5 г хлорида натрия, интенсивно встряхивают и оставляют на 10 минут. По истечении этого времени и после разделении слоев в делительной воронке нижний водный слой с остатком не растворившегося хлорида натрия отбрасывают. К оставшемуся в делительной воронке ацетонитрильному экстракту прибавляют 40 мл гексана и воронку интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения слоев нижнюю ацетонитрильную фракцию собирают в концентратор, пропуская через 10 г безводного сульфата натрия. Затем осушитель промывают 10 мл ацетонитрила. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
     
     Сухой остаток растворяют в 5 мл ацетонитрила, добавляют в концентратор 50 мл дистиллированной воды и полученную смесь переносят в делительную воронку. Фамоксадон экстрагируют хлористым метиленом трижды, используя по 20 мл растворителя и интенсивно встряхивая смесь в течение 2 мин. Нижний метиленхлоридный слой объединяют в концентраторе, пропуская через 10 г безводного сульфата натрия. Экстракт упаривают досуха на роторном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
     
     Затем проводят очистку образца на колонке с флоризилом, как указано в п.2.5.1.2.
     

2.5.3. Картофель (клубни)

     
     Навеску 10 г измельченных клубней картофеля помещают в плоскодонную стеклянную колбу на 250 мл, добавляют 30 мл ацетонитрила и встряхивают смесь в течение 0,5 часа. Экстракцию повторяют еще 2 раза, используя 30 мл и 10 мл ацетонитрила и встряхивая смесь 30 и 5 мин соответственно. Экстракт фильтруют и объединяют в делительную воронку. Экстракцию повторяют еще 2 раза, используя по 50 мл ацетонитрила. Экстракты объединяют в делительной воронке. Далее поступают, как описано в п.2.5.2.2.
     

2.5.4 Зеленая масса пшеницы

     
     Навеску 10 г измельченной зеленой массы пшеницы помещают в плоскодонную стеклянную колбу на 250 мл, добавляют 100 мл ацетонитрила и встряхивают смесь в течение 0,5 часа. Экстракцию повторяют еще 2 раза, используя по 50 мл ацетонитрила и встряхивая смесь каждый раз по 15 мин. Экстракты фильтруют и объединяют в делительной воронке.
     
     К полученному экстракту в делительной воронке добавляют 5 г хлорида натрия, интенсивно встряхивают и оставляют на 10 минут. По истечении этого времени и после разделения слоев в делительной воронке нижний водный слой с остатком не растворившегося хлорида натрия отбрасывают. К оставшемуся в делительной воронке ацетонитрильному экстракту прибавляют 50 мл гексана и воронку интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения слоев нижнюю ацетонитрильную фракцию собирают в концентратор, пропуская через 10 г безводного сульфата натрия. Затем осушитель промывают 10 мл ацетонитрила. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Далее проводят очистку экстракта на колонке, как указано в разделе 2.5.1 2.
     

2.5.5. Солома пшеницы

     
     Навеску 5 г измельченной соломы помещают в плоскодонную стеклянную колбу на 250 мл, добавляют 100 мл ацетонитрила и встряхивают смесь в течение 0,5 часа. Экстракцию повторяют еще 2 раза, используя по 50 мл ацетонитрила и встряхивая смесь каждый раз по 15 мин. Экстракты фильтруют и объединяют в делительной воронке.
     
     К полученному экстракту в делительной воронке добавляют 50 мл гексана и воронку интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения слоев нижнюю ацетонитрильную фракцию собирают в концентратор, пропуская через 10 г безводного сульфата натрия. Затем осушитель промывают 10 мл ацетонитрила. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
     
     Затем проводят очистку образца на колонке с флоризилом, как указано в п.2.5.1.2.
     

2.5.6. Зерно

     
     Навеску 10 г измельченного зерна помещают в плоскодонную стеклянную колбу на 250 мл, добавляют 50 мл ацетонитрила и встряхивают смесь в течение 0,5 часа. Экстракцию повторяют еще 2 раза, используя по 50 мл ацетонитрила и встряхивая смесь каждый раз по 15 мин. Экстракты фильтруют и объединяют в делительной воронке.
     
     К полученному экстракту в делительной воронке добавляют 50 мл гексана и воронку интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения слоев нижнюю ацетонитрильную фракцию собирают в концентратор, пропуская через 10 г безводного сульфата натрия. Затем осушитель промывают 10 мл ацетонитрила. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30° С.
     
     Затем проводят очистку образца на колонке с флоризилом, как указано в п.2.5.1.2.
     

2.6. Условия хроматографирования и обработка результатов

     
2.6.1. Условия хроматографирования

     
     Хроматограф "Waters" или другой с аналогичными характеристиками с ультрафиолетовым детектором с измеряемой длиной волны
     

2.6.2. Обработка результатов анализа

     
     Содержание фамоксадона рассчитывают по формуле:
     

, где

     
      - содержание фамоксадона в пробе, мг/кг или мг/л;
     
      - высота (площадь) пика стандарта, мм;
     
      - высота (площадь) пика образца, мм;
     
      - концентрация стандартного раствора, мкг/мл;
     
      - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;
     
      - масса анализируемого образца, г (мл);
     
      - содержание фамоксадона в аналитическом стандарте, %.
     
     

3. Требования техники безопасности

     
     Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.
     
     

4. Разработчики

     
     Калинин В.А., профессор, к.с-х.н.; Калинина Т.С., к.с-х.н.; Довгилевич Е.В., к.биол.н.; Довгилевич А.В., к.хим.н.; Устименко Н.В., к.биол.н.
     
     Московская сельскохозяйственная академия им. К.А.Тимирязева. 127550, Москва, Тимирязевский пр., 2, кафедра химических средств защиты растений. Телефон: 976-43-26.
     
     
     

Текст документа сверен по:
официальное издание
Определение остаточных количеств пестицидов
в пищевых продуктах, сельскохозяйственном сырье
и объектах окружающей среды: Сборник методических
указаний. Выпуск 1. - М.: Федеральный центр
госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004