МУК 4.1.1236-03  

     
     
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Определение остаточных количеств флуфензина в воде, почве, яблоках,
винограде, виноградном и яблочном соках хроматографическими методами

     
     
Дата введения 2003-07-01

     
     
     УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 16 марта 2003 г.
     
     

1. Вводная часть

     
     Фирма-производитель: Агро-Кеми защита растений.
     
     Торговое название: Флумайт.
     
     Название действующего вещества: Флуфензин.
     
     Название по ИЮПАК: 3-(2-хлорфенил)-6-(2,6-дифторофенил)-1,2,4,5-тетразин.
     
     Структурная формула:
     

     
     Эмпирическая формула: CHNClF.
     
     Молекулярная масса: 304,69.
     
     Химически чистый флуфензин представляет собой кристаллический порошок малинового цвета.
     
     Температура плавления: 187-189 °С.
     
     Давление паров <1,0х10 мПа (при 25 °С).
     
     Растворимость (г/л): ацетон - 14,4; бензол - 3,2; н-гексан - 0,3; метанол - 3,7; хлороформ - 50; дихлорметан - 7,2; ацетонитрил - 13,7. Растворимость в воде - 0,23 мг/л (рН 7,0 при 25 °С).
     
     Коэффициент распределения октанол/вода  при 25 °С.
     
     Флуфензин в водных кислых средах гидролитически стабилен, но при рН>7 быстро гидролизуется с ДТ - 60 ч. При рН 9,0 период полураспада в почве от 30 до 44 дней.
     
     В воздухе может находиться в виде аэрозоля и пара.
     
     Гигиенические нормативы:
     
     ОДУ в воде - 0,002 мг/дм;
     
     ОДК в почве - 0,07 мг/кг;
     
     ВМДУ в яблоках - 0,04 мг/кг и винограде - 0,02 мг/кг;
     
     Область применения препарата. Флуфензин - специфический акарицид контактного и частично трансламинарного действия из группы производных тетразина. Эффективно подавляет растительноядных клещей во всех стадиях их развития при нормах расхода 60-100 г д.в./га.
     
     

2. Методика определения остаточных количеств флуфензина в воде, почве,
яблоках, винограде, виноградном и яблочных соках
хроматографическими методами

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

     
     Методика основана на определении остаточных количеств флуфензина с помощью газожидкостной (ГЖХ), высокоэффективной жидкостной (ВЭЖХ) или тонкослойной (ТСХ) хроматографии после его экстракции из проб почвы, яблок, винограда ацетоном, из проб воды и сока - гексаном, очистки полученных экстрактов путем перераспределения в системе жидкость-жидкость и очистки в тонком слое силикагеля. Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки или путем сравнения величины и интенсивности пятен на пластинках с пятнами аналитического стандарта.
     

2.1.2. Избирательность метода

     
     В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых в плодовых садах и на виноградниках.
     

2.1.3. Метрологическая характеристика метода

     
     Метрологическая характеристика метода представлена в табл.1.
     
     

Таблица 1

     
Метрологическая характеристика метода определения флуфензина в воде, почве,
яблоках, винограде и соках (=5)

2.2. Реактивы, растворы, материалы, приборы, аппаратура и посуда

    
2.2.1. Реактивы, растворы и материалы

     
     Основной стандартный раствор флуфензина для ГЖХ и ТСХ готовят с концентрацией 100 мкг/мл в ацетоне в мерной колбе и хранят в холодильнике не более 3 месяцев.
     
     Рабочие стандартные растворы флуфензина для ГЖХ с концентрацией 1-10 мкг готовят непосредственно перед использованием путем разбавления основного стандартного раствора ацетоном в мерных колбах вместимостью 25 мл.
     
     Основной стандартный раствор флуфензина для ВЭЖХ готовят с концентрацией 100 мкг/мл в метиловом спирте в мерной колбе вместимостью 50 мл и хранят в холодильнике не более 3 месяцев.
     
     Рабочие стандартные растворы флуфензина для ВЭЖХ с концентрацией 0,3-3,0 мкг/мл готовят непосредственно перед использованием путем разбавления основного стандартного раствора смесью растворителей метиловый спирт-вода (9+1, об/об).
     

2.2.2. Приборы, аппаратура и посуда

2.3. Отбор проб

     
     Отбор, хранение и доставка проб проводится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" N 2051-79 от 21.08.79.
     
     

2.4. Подготовка к определению

     
2.4.1. Подготовка и кондиционирование колонки для газовой хроматографии

     
     Готовую насадку (5% SE-30 на Хроматоне Н-АИ) засыпают в стеклянную колонку, уплотняют под вакуумом, колонку устанавливают в термостате хроматографа, не подсоединяя к детектору, и стабилизируют в токе азота при температуре 270 °С в течение 8-10 ч.
     

2.4.2. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии

     
     Колонку Inertsil ODS-2 (зернение 5 мкм) устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 20 °С и скорости потока подвижной фазы 1 мл/мин в течение 3-4 ч.
     

2.4.3. Приготовление стандартных растворов

     
     Основной стандартный раствор флуфензина для ГЖХ и ТСХ готовят с концентрацией 100 мкг/мл в ацетоне в мерной колбе вместимостью 50 мл и хранят в холодильнике не более 3 месяцев.
     
     Рабочие стандартные растворы флуфензина для ГЖХ с концентрацией 1-10 мкг готовят непосредственно перед использованием путем разбавления основного стандартного раствора ацетоном в мерных колбах вместимостью 25 мл.
     
     Основной стандартный раствор флуфензина для ВЭЖХ готовят с концентрацией 100 мкг/мл в метиловом спирте в мерной колбе вместимостью 50 мл и хранят в холодильнике не более 3 месяцев.
     
     Рабочие стандартные растворы флуфензина для ВЭЖХ с концентрацией 0,03-3,0 мкг/мл готовят непосредственно перед использованием путем разбавления основного стандартного раствора смесью растворителей метиловый спирт-вода (9+1, об/об) в мерных колбах вместимостью 25 мл.
     
     

2.5. Описание определения

     
2.5.1. Вода

     
     Пробу воды (500 мл) помещают в делительную воронку вместимостью 1000 мл, добавляют 10 г хлорида натрия, перемешивают раствор до полного растворения соли и экстрагируют гексаном трижды порциями по 50 мл в течение 2 мин каждый раз. Верхний органический слой отделяют, собирая в коническую колбу вместимостью 250 мл, и сушат настаиванием над безводным сульфатом натрия (10 г) в течение 30 мин при периодическом перемешивании. Затем переносят экстракт в грушевидную колбу вместимостью 200 мл, фильтруя через бумажный фильтр "красная лента", помещенный в химическую воронку. Промывают фильтр с сульфатом натрия гексаном дважды порциями по 5 мл, присоединяют смывы к основному экстракту. Упаривают объединенный экстракт на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 40 °С до объема ~1 мл, а затем досуха в токе азота или сухого воздуха.
     

2.5.2. Почва

     
     Навеску воздушно-сухой почвы (25 г) помещают в коническую колбу вместимостью 250 мл, приливают 50 мл смеси вода-ацетон (1+5, об/об) и экстрагируют в течение 30 мин на аппарате для встряхивания. Затем содержимое колбы фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр "синяя лента" в колбу Бунзена. Экстракцию повторяют еще дважды порциями той же смеси (30 мл), встряхивая каждый раз по 30 мин.
     
     Объединенный экстракт переносят в делительную воронку вместимостью 1000 мл, добавляют 350 мл дистиллированной воды, 10 г хлорида натрия, перемешивают до полного растворения соли и экстрагируют флуфензин гексаном (3х50 мл). Отделяют гексановый слой, сушат безводным сульфатом натрия (10 г) в течение 30 мин при периодическом встряхивании, переносят в грушевидную колбу вместимостью 200 мл и упаривают на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 40 °С до объема ~1 мл, а затем досуха в токе азота или сухого воздуха.
     
     Затем проводят очистку в тонком слое силикагеля (при определении методами ГЖХ и ВЭЖХ). Для этого сухой остаток после упаривания количественно наносят на пластинку "Силуфол" с помощью ацетона. Параллельно наносят стандарт флуфензина (5 мкг). Пластинку помещают в хроматографическую камеру, в которую за 30 мин до начала хроматографирования налита смесь подвижных растворителей N 1 или N 2. После развития хроматограммы (высота подъема фронта растворителей 10 см) пластинку вынимают из камеры, сушат на воздухе в вытяжном шкафу до полного удаления растворителей. Отмечают зону локализации флуфензина в пробе на уровне стандарта флуфензина в виде красного пятна. Вырезают полоску с зоной локализации флуфензина в пробе, помещают ее в плоскодонную колбу вместимостью 50 мл и приливают 10 мл ацетона. Экстрагируют флуфензин со слоя силикагеля в течение 15 мин при периодическом встряхивании. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр "красная лента" в круглодонную колбу вместимостью 50 мл. Колбу и фильтр промывают несколькими порциями ацетона по 5 мл. Объединенный экстракт упаривают на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 40 °С до объема ~1 мл, а затем досуха в токе азота или сухого воздуха.
     

2.5.3. Яблоки, виноград

     
     Помещают 25 г измельченной пробы в плоскодонную колбу вместимостью 250 мл, приливают 50 мл ацетона и экстрагируют в течение 30 мин на аппарате для встряхивания. Содержимое колбы фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр "синяя лента" в колбу Бунзена. Экстракцию повторяют дважды. Объединенный экстракт переносят в грушевидную колбу вместимостью 200 мл и упаривают на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 40 °С до полного удаления ацетона. К водному остатку добавляют 10 мл ацетона и помещают колбу в морозильную камеру на 1 ч при температуре -4 °С. Затем охлажденный экстракт фильтруют через складчатый фильтр "красная лента" в делительную воронку вместимостью 500 мл, добавляют 6 г хлорида натрия, 100 мл дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения соли и экстрагируют трижды гексаном порциями по 50, 30, 30 мл в течение 2 мин каждый раз. Объединенный гексановый экстракт сушат настаиванием над безводным сульфатом натрия (10 г) в течение 30 мин при периодическом встряхивании, переносят раствор в грушевидную колбу вместимостью 200 мл и упаривают на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 40 °С до объема ~1 мл, а затем досуха в токе азота или сухого воздуха.
     
     Затем проводят очистку проб в тонком слое силикагеля так, как описано в п.2.5.2.
     

2.5.4. Сок (виноградный, яблочный)

     
     100 мл сока помещают в делительную воронку вместимостью 500 мл, добавляют 100 мл дистиллированной воды, 5 г хлорида натрия, перемешивают раствор до полного растворения соли. Экстрагируют флуфензин гексаном (3х50 мл) по 2 мин каждый раз. При образовании эмульсии добавляют 10 мл этилового спирта для лучшего расслоения фаз. Объединенный гексановый экстракт сушат настаиванием над безводным сульфатом натрия (10 г) в течение 30 мин, при периодическом встряхивании, переносят раствор в грушевидную колбу вместимостью 200 мл и упаривают на ротационном испарителе при температуре водяной бани не более 40 °С до объема ~1 мл, а затем досуха в токе азота или сухого воздуха.
     
     

2.6. Условия хроматографирования и обработка результатов

     
2.6.1. Условия хроматографирования

     
     ГЖХ.
     
     Сухой остаток, полученный после упаривания, количественно переносят ацетоном в градуировочную пробирку (общий объем ацетона 1 мл). 3 мкл полученного раствора с помощью микрошприца вводят в испаритель хроматографа и хроматографируют при следующих условиях: температура термостата колонок - 200 °С, температура испарителя - 240 °С, температура детектора - 260 °С, скорость газа-носителя (азот осч) через колонку - 60 мл/мин, шкала электрометра - 20х10 Ом, скорость диаграммной ленты - 240 мм/ч. Время удерживания флуфензина 6 мин 15 с. Линейный диапазон детектирования 3-30 нг.
     
     Хроматографирование одной пробы проводят дважды. Измеряют на хроматограммах высоты пиков, соответствующих флуфензину, и вычисляют среднее значение из двух параллельных определений. Количественное определение проводят по методу абсолютной калибровки посредством сравнения с хроматограммами стандартных растворов флуфензина с концентрацией 1-10 мкг/мл.
     
     ВЭЖХ.
     
     Сухой остаток, полученный после упаривания, количественно переносят смесью растворителей метиловый спирт-вода (9+1, об/об) в градуированную пробирку (общий объем пробы 1 мл). 20 мкл полученного раствора вводят в инжектор хроматографа и хроматографируют при следующих условиях: стальная колонка (длина 25 см, внутренний диаметр 4,6 мм); температура колонки - 20 °С; подвижная фаза: метиловый спирт-вода (9+1, об/об); скорость потока подвижной фазы - 1,0 мл/мин; рабочая длина волны УФ-детектора - 270 нм; чувствительность - 0,04 ед. абсорбции на шкалу; скорость диаграммной ленты - 5 мм/мин; неподвижная фаза Inertsil ODS-2 (5 мкм); время удерживания флуфензина - 4,4 мин. Линейный диапазон детектирования 6-60 нг.
     
     Хроматографирование одной пробы проводят дважды. Измеряют на хроматограммах высоты пиков, соответствующих флуфензину и вычисляют среднее значение из двух параллельных определений. Количественное определение проводят по методу абсолютной калибровки посредством сравнения с хроматограммами стандартных растворов флуфензина с концентрацией 0,3-3,0 мкг/мл.
     
     ТСХ.
     
     Сухой остаток, полученный после упаривания, растворяют в 0,2 мл ацетона и количественно наносят на хроматографическую пластинку с тонким слоем силикагеля ("Силуфол"). На эту же пластинку наносят 2, 4, 6 и 10 мкг флуфензина в виде раствора в ацетоне и проводят хроматографирование в одной из систем подвижных растворителей (N 1 или N 2). Для хроматографирования используют камеру, насыщенную парами подвижных растворителей. Для этого в хроматографическую камеру наливают за 30 мин до хроматографирования смесь растворителей. Через 30 мин поднимают крышку камеры и быстро помещают в нее пластинку для развития хроматограммы. После окончания процесса хроматографирования пластинку извлекают из камеры и сушат в вытяжном шкафу до полного исчезновения следов растворителей. Флуфензин обнаруживается на пластинке в виде пятна красного цвета. Для повышения надежности идентификации флуфензина пластинку обрабатывают проявляющим реактивом, а затем помещают на 30 мин под источник Уф-излучения. Флуфензин обнаруживается в виде темно-серого пятна на светло-сером фоне с величинами Rf - 0,78±0,05 (подвижная фаза N 1) и 0,75±0,05 (подвижная фаза N 2).
     
     Количество флуфензина определяют сравнением интенсивности окраски и площади пятна пробы и стандарта. Линейная зависимость между концентрацией и площадью пятна соблюдается в интервале 2-10 мкг.
     

2.6.2. Обработка результатов анализа

     
     Для определения содержания флуфензина в пробах с помощью ГЖХ и ВЭЖХ используют следующую формулу:
     

,

где  - содержание флуфензина в пробе, мг/кг (мг/л);
            
      - количество стандарта флуфензина, введенного в хроматограф, мг;
               
      - высота хроматографического пика стандарта флуфензина, мм;
          
      - высота хроматографического пика флуфензина в пробе, мм;
          
      - объем экстракта пробы, введенной в хроматограф, мкл;
          
      - общий объем упаренного экстракта, мкл;
           
      - масса (объем) анализируемой пробы, кг (л).
     
     Для определения содержания флуфензина в пробах с помощью ТСХ используют следующую формулу:
     

,

     
где  - содержание флуфензина в пробе, мг/кг (мг/л);
           
      - количество флуфензина в пробе, мг;
                
      - масса (объем) анализируемой пробы, кг (л).
          
     Оценку количества флуфензина в пробе (, мг) проводят путем сравнения интенсивности окраски и площадей пятен проб и стандартных количеств флуфензина или рассчитывают по величине площади пятен по формуле:
     

,

     
где  - количество флуфензина в пробе, мг;

                 
      - площадь пятна флуфензина в пробе, мм;

     
      и  - стандартные количества флуфензина в пятнах на хроматограмме с меньшим и большим содержанием по сравнению с анализируемой пробой соответственно, мг;
     
      и  - площадь пятен стандартных количеств флуфензина с меньшим и большим содержанием по сравнению с анализируемой пробой, мм.
     
     Величину площади пятен определяют, накладывая на пластинку прозрачную бумагу или кальку, очерчивают контур пятна, переносят его на миллиметровую бумагу и подсчитывают число мм, входящих в контур.
     
     

3. Требования техники безопасности

     
     Помещение, в котором проводится определение флуфензина, обязательно должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией.
     
     Работу с образцами, стандартами и растворителями следует проводить в вытяжном шкафу с использованием индивидуальных средств защиты.
     
     

4. Контроль погрешности измерений

     
     Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95* "ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа".
_______________
     * Действует МИ 2335-2003. - Примечание .     
     

5. Разработчики

     
     Калинин В.А., проф.; Рыбакова О.И. Московская сельскохозяйственная академия им. К.А.Тимирязева. 127550, г.Москва, Тимирязевская ул., д.53/1, УНКЦ "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов". Телефон/факс: 976-43-26.
     
     Гринько А.П., к.х.н.; Чмиль В.Д. д.б.н., к.х.н.; Михайлов В.С., Зварич Г.В. Институт экогигиены и токсикологии им. Л.И.Медведя МЗ Украины, Киев.
     
     
     

Текст документа сверен по:
официальное издание

Определение остаточных количеств пестицидов
в пищевых продуктах, сельскохозяйственном сырье
и объектах окружающей среды: Сб. методических указаний.
Вып.2. Ч.7. МУК 4.1.1236-4.1.1239-03. -

М.: Федеральный центр гигиены и
эпидемиологии Роспотребнадзора, 2006